Avaliação da suscetibilidade antimicrobiana e do perfil de macrorrestrição do DNA de isolados humanos de Salmonella serovar Typhimurium fagotipo 193, no período de 1970 a 2008

Para analisar cepas de Salmonella ser. Typhimurium isoladas de processos entéricos e extraintestinais humanos ocorridos no período de 1970 a 2008 de diferentes regiões do país foram selecionadas, com base nos registros contidos no banco de dados do Laboratório de Enterobactérias do IOC/FIOCRUZ, RJ, amostras do fagotipo prevalente 193, visando precipuamente o reconhecimento de clones epidêmicos. Foram selecionadas 553 cepas de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 representadas por 91, 65, 70 e 327 amostras referentes as décadas de 70, 80, 90 e ao período de 2000 a 2008, respectivamente. Na análise global da sensibilidade destas cepas, 52% apresentaram um ou mais marcadores de resistência a antibióticos incluídos no perfil ACSSuT. Este perfil de resistência completo foi verificado em 20,9% dos isolados, sendo os 21,9% restantes, sensíveis a todas as drogas testadas, especialmente no período de 2000 a 2008, representadas por 121 amostras (37,0%) em relação as 327 culturas dessa época. O maior percentual de resistência foi observado nas amostras da década de 70 (99%) sendo o perfil ACSSuT detectado em 35,2% dos isolados, ressaltando-se que todas as amostras foram isoladas de processos gastroentéricos ocorridos na cidade de São Paulo. Ao longo das quatro décadas de estudo, descreve-se um ponto de ruptura entre a prevalência de resistência e a suscetibilidade na transição entre as décadas de 80 e 90. Embora o número de isolados de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 tenha aumentado no último período considerado, o percentual de mono e multirresistência aos antimicrobianos se situou em nível elevado (63,0%). A análise do polimorfismo obtido após macrorrestrição com a enzima XbaI revelou que cepas isoladas na década de 90 apresentaram elevado percentual de similaridade (≥85%) com cepas isoladas recentemente (período de 2000-2008), sendo agrupadas nos mesmos subclusters. Por outro lado, as cepas da década de 70 inserem-se em subclusters independentes, embora o percentual de similaridade entre tais subclusters e os demais seja ≥70%; o mesmo sendo observado para as cepas isoladas durante a década de 80. Em conclusão, este estudo mostrou que a prevalência de isolados humanos de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 no Brasil vem progredindo desde a década de 1990, enquanto a detecção do modelo R (ACSSuT) está diminuindo e a avaliação através da PFGE indicou a presença de multiplicidade de perfis de macrorrestrição no fagotipo 193, entretanto com elevados percentuais de similaridade entre si, sugerindo alguma clonalidade, tendo em vista o período entre o isolamento e a análise

Identifizierung der Welsart in Filetware durch Protein- und DNA-Analyse

Zusammenfassung Zur Identifizierung der folgenden vier Welsarten bzw. zwei Hybriden (Clarias gariepinus, Pangasius hypophthalmus, Pseudoplatystoma spp., Silurus glanis, Claresse® und Melander®) wurden die isolektrische Fokussierung (IEF) der wasserlöslichen Muskelproteine und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung und Sequenzierung eines Abschnittes aus dem Cytochrom b – Gen eingesetzt. Die IEF ergab artspezifische Proteinmuster mit hitzestabilen Proteinbanden im anodalen Gelbereich. Der afrikanische Wels (C. gariepinus) und das Hybriderzeugnis Melander® wiesen das gleiche Proteinmuster auf. Mittels DNA-Analyse ließen sich die Welsarten anhand ihrer Cytochrom b Gensequenzen eindeutig identifizieren. Auch hier zeigte der Welshybrid Melander® ein identisches Ergebnis wie der afrikanische Wels. Die Schwierigkeiten der Identifizierung von Tigerwelsen südamerikanischer Herkunft aus der Gattung Pseudoplatystoma werden diskutiert. Abstract Isoelectric focusing (IEF) of water soluble proteins and PCR-based DNA- analysis were used to differentiate between four catfish species (Clarias gariepinus, Pangasius hypophthalmus, Pseudoplatystoma spp., Silurus glanis) and two hybrids Claresse® and Melander®. Specific protein patterns have been obtained for all species and Claresse®, but in case of Melander® the identical pattern was observed as for the African catfish Clarias gariepinus. By sequencing the PCR products and application of BLAST, authenticity of the different catfish samples was confirmed. The cytochrome b gene sequences of Melander® and African catfish were identical. The difficulties of identifying catfishes of the genus Pseudoplatystoma are discussed.

Utilização de sistema multiplex de marcadores do tipo INDELs em identificação humana por DNA

Os INDELs são polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inserções e/ou deleções de um ou mais nucleotídeos. Os marcadores INDELs, que estão amplamente distribuídos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido à baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A facilidade de análise e a possibilidade de construção de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificação humana por DNA. Para avaliar a eficiência e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de inserção/deleção na identificação humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs bialélicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biológicas (cabelo, saliva, sangue, sêmen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentração mínima de DNA necessária para amplificação dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condições de análise, redução de artefatos e aumento na intensidade média de fluorescência dos alelos amplificados. A eficiência do sistema Indel-plex ID na amplificação de DNA degradado foi verificada durante as análises das amostras de DNA extraídas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de número de loci genotipados e qualidade de amplificação. Nas investigações de vínculos genéticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possível corroborar resultados anteriores obtidos pela análise de marcadores STR. Nas análises com amostras in vivo foram obtidos valores máximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforçou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um índice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco

Estudo da ancestralidade materna da população do Rio de Janeiro: análise do DNA mitocondrial

As porções uniparentais do genoma humano, representadas pelo cromossomo Y e pelo DNA mitocondrial (DNAmt), contêm informação genética relacionada às heranças patrilinear e matrilinear, respectivamente. Além da aplicabilidade em genética médica e forense, o DNAmt tem sido utilizado como um importante marcador molecular em estudos sobre evolução para traçar inferências filogenéticas e filogeográficas sobre as populações humanas. A análise de linhagens de DNAmt presentes em diferentes populações mundiais levou à identificação de haplogrupos reunindo diversos haplótipos específicos dos grandes grupos étnicos: africanos, europeus, asiáticos e nativos americanos. A população brasileira é conhecida como uma das mais heterogêneas do mundo, resultado do processo de colonização do país, abrangendo mais de cinco séculos de miscigenação entre povos de diferentes continentes. Este trabalho teve como objetivo estimar a partir da análise do DNA mitocondrial as proporções ancestrais africanas, européias e ameríndias na população do Rio de Janeiro. Para isso foram sequencidas as regiões hipervariáveis HVI e HVII do DNAmt de 109 indivíduos não relacionados geneticamente residentes no Rio de Janeiro. Os haplogrupos foram classificados de acordo com o conjunto de polimorfismos dos haplótipos individuais. Programas estatísticas foram utilizados para a determinação de parâmetros de diversidade genética e comparações populacionais. A diversidade haplotípica foi estimada em 0,9988. Nossos resultados demonstraram na população do Rio de Janeiro percentuais de cerca de 60%, 25% e 15% de ancestralidades maternas africana, ameríndia e européia, respectivamente. Através da análise de distâncias genéticas, evidenciou-se que a população do Rio de Janeiro está mais próxima das populações brasilerias dos estados de São Paulo e Alagoas. Como descrito nos registros históricos, algumas regiões do país tiveram processos de colonização muito específicos que se refletem nas proporções ancestrais maternas e paternas observadas. Em relação ao DNAmt, não se verificou diferença genética significativa entre as populações do Rio de Janeiro e a de Angola, uma população africana. Os resultados obtidos estão em estreita concordância com os registros históricos e outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira

Differenzierung von Kammmuscheln durch DNA-Analyse

Abstract In the last years scallops have reached a considerable popularity and the import of scallops into the EU has increased about 20 % over the last fi ve years from some 50.000 t to nearly 63.000 t in the year 2010. Scallops are fi shed or farmed, and traded as fresh or deep frozen product. Recently investigation of scallop products of various origins by determining the species using molecular biological techniques showed that the species had been mislabelled in a considerable proportion of samples. Determination of the species was performed by PCR-based DNA-analysis of mitochondrial DNA followed by (i) sequencing the PCR product and (ii) comparison of the DNA sequence with entries in GenBank using BLAST. The deduced sequences of the analysed samples were considerably different from each other allowing the unambiguous assignment of samples to a certain species. Kurzfassung Die Nachfrage von Kammmuscheln in der EU hat in den letzten fünf Jahren erheblich zugenommen. Der Import stieg von knapp 53.000 t im Jahr 2005 um 20% auf annähernd 63.000 t im Jahr 2010. Gehandelt werden Kammmuscheln sowohl als frische als auch als Tiefkühlware aus Wildfängen und Aquakultur. Untersuchungen von Kammmuschel-Proben aus verschiedenen Ursprungsländern und Bestimmung der Spezies auf molekularbiologischer Basis zeigten, dass ein erheblicher Anteil der Proben falsch deklariert war. Die Bestimmung der Spezies erfolgte durch Vervielfältigung eines Abschnitts des 16S rRNA Gens durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR), anschließender Sequenzanalyse der PCR-Produkte und Vergleich der DNA Sequenzen untereinander und mit Dateneintragungen in GenBank. Die DNA-Sequenzen der ermittelten Abschnitte der 16S rRNA der Proben unterschieden sich erheblich voneinander und erlaubten eine eindeutige Zuordnung zu jeweils einer Spezies.

Estudo do reparo das lesões induzidas no DNA de Escherichia coli pela radiação ultravioleta C (UVC)

Didaticamente, podemos dividir o espectro da radiação ultravioleta (UV) em três faixas: UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC (290 a 100 nm). Apesar do UVC ou UV-curto ser eficientemente filtrado pela camada de ozônio da Terra e sua atmosfera, este é uma das faixas do espectro de UV mais usadas para explorar as consequências de danos causados ao DNA, já que a letalidade induzida por este agente está relacionada aos danos diretos no genoma celular, como as lesões dímero de pirimidina, que são letais se não reparadas. Contudo, demonstrou-se que a radiação UVC pode gerar espécies reativas de oxigênio (ERO), como o oxigênio singleto (1O2). Embora, o radical hidroxil (OH) cause modificações oxidativas nas bases de DNA, alguns trabalhos indicam que o 1O2 também está envolvido nos danos oxidativos no DNA. Esta ERO é produzida por vários sistemas biológicos e reações fotossensibilização, quando cromóforos são expostos à luz visível ou são excitados pela luz UV, permitindo que essa energia possa ser transferida para o oxigênio sendo convertido em 1O2, que é conhecido por modificar resíduos de guanina, gerando 8-oxoG, que caso não seja reparada pode gerar uma transversão GC-TA. O objetivo deste trabalho foi o de elucidar a participação de ERO nos efeitos genotóxicos e mutagênicos gerados pela radiação UVC, assim como as enzimas envolvidas no processo de reparação destas lesões em células de Escherichia coli. Nos ensaios as culturas foram irradiadas com o UVC (254 nm; 15W General Electric G15T8 germicidal lamp, USA). Nossos resultados mostram que o uso de quelantes de ferro não alterou a letalidade induzida pelo UVC. A azida sódica, um captador de 1O2, protegeu as cepas contra os danos genotóxicos gerados pelo UVC e também diminuiu a frequência de mutações induzidas no teste com rifampicina. A reversão específica GC-TA foi induzida mais de 2,5 vezes no ensaio de mutagênese. A cepa deficiente na proteína de reparo Fpg, enzima que corrige a lesão 8-oxoG, apresentou menos quebras no DNA do que a cepa selvagem no ensaio de eletroforese alcalina. A letalidade induzida pelo UVC foi aumentada nos mutantes transformados com o plasmídeo pFPG, ao mesmo tempo que representou uma redução na indução mutagênica. Houve dimuição na eficiência de transformação com plasmídeo pUC 9.1 na cepa fpg quando comparado a cepa selvagem. Assim como, um aumento da sensibilidade ao UVC na associação entre mutantes fpg e uvrA. Estes resultados mostram que o 1O2 participa dos danos induzidos pelo UVC, através da geração da lesão 8-oxoG, uma lesão mutagênica, que é reparada pela proteína Fpg

Surface mucous as a source of genomic DNA from Atlantic billfishes (Istiophoridae) and swordfish (Xiphiidae)

Procedures for sampling genomic DNA from live billfishes involve manual restraint and tissue excision that can be difficult to carry out and may produce stresses that affect fish survival. We examined the collection of surface mucous as a less invasive alternative method for sourcing genomic DNA by comparing it to autologous muscle tissue samples from Atlantic blue marlin (Makaira nigricans), white marlin (Tetrapturus albidus), sailfish (Istiophorus platypterus), and swordfish (Xiphias gladius). Purified DNA from mucous was comparable to muscle and was suitable for conventional polymerase chain reaction, random amplified polymorphic DNA analysis, and mitochondrial and nuclear locus sequencing. The nondestructive and less invasive characteristics of surface mucous collection may promote increased survival of released specimens and may be advantageous for other marine fish genetic studies, particularly those involving large live specimens destined for release.

Evolutionary associations between sand seatrout (Cynoscion arenarius) and silver seatrout (C. nothus) inferred from morphological characters, mitochondrial DNA, and microsatellite markers

The evolutionary associations between closely related fish species, both contemporary and historical, are frequently assessed by using molecular markers, such as microsatellites. Here, the presence and variability of microsatellite loci in two closely related species of marine fishes, sand seatrout (Cynoscion arenarius) and silver seatrout (C. nothus), are explored by using heterologous primers from red drum (Sciaenops ocellatus). Data from these loci are used in conjunction with morphological characters and mitochondrial DNA haplotypes to explore the extent of genetic exchange between species offshore of Galveston Bay, TX. Despite seasonal overlap in distribution, low genetic divergence at microsatellite loci, and similar life history parameters of C. arenarius and C. nothus, all three data sets indicated that hybridization between these species does not occur or occurs only rarely and that historical admixture in Galveston Bay after divergence between these species was unlikely. These results shed light upon the evolutionary history of these fishes and highlight the genetic properties of each species that are influenced by their life history and ecology.

Mitochondrial DNA markers to identify commercial spiny lobster species (Panulirus spp.) from the Pacific coast of Mexico: an application on phyllosoma larvae

Molecular markers based on mitochondrial DNA (mtDNA) are extensively used to study genetic relationships. mtDNA has been used in phylogenetic studies to understand the evolutionary history of species because it is maternally inherited and is not subject to genetic recombination (Gyllensten et al., 1991). The high mutation rate of mtDNA makes it a useful tool for differentiating between closely related species (Brown et al., 1979)—a tool that is especially important when significant variations occur between species, but not within species (Hill et al., 2001; Blair et al., 2006; Chow et al., 2006a).

Genetic variability in spotted seatrout (Cynoscion nebulosus), determined with microsatellite DNA markers

Variation in the allele frequencies of five microsatellite loci was surveyed in 1256 individual spotted seatrout (Cynoscion nebulosus) obtained from 12 bays and estuaries from Laguna Madre, Texas, to Charlotte Harbor, Florida, to St. John’s River on the Florida Atlantic Coast. Texas and Louisiana collection sites were resampled each year for two to four years (1998−2001). Genetic differentiation was observed. Spotted seatrout from Florida waters were strongly differentiated from spotted seatrout collected in Louisiana and Texas. The greatest genetic discontinuity was observed between Tampa Bay and Charlotte Harbor, and Charlotte Harbor seatrout were most similar to Atlantic Coast spotted seatrout. Texas and Louisiana samples were not strongly structured within the northwestern Gulf of Mexico and there was little evidence of temporal differentiation within bays. These findings are contrary to those of earlier analyses with allozymes and mitochondrial DNA (mtDNA) where evidence of spatial differentiation was found for spotted seatrout resident on the Texas coast. The differences in genetic structure observed among these markers may reflect differences in response to selective pressure, or may be due to differences in underlying genetic processes.

Yellow (Perca flavescens) and Eurasian (P. fluviatilis) perch distinguished in fried fish samples by DNA analysis

DNA techniques are increasingly used as diagnostic tools in many fields and venues. In particular, a relatively new application is its use as a check for proper advertisement in markets and on restaurant menus. The identification of fish from markets and restaurants is a growing problem because economic practices often render it cost-effective to substitute one species for another. DNA sequences that are diagnostic for many commercially important fishes are now documented on public databases, such as the National Center for Biotechnology Information’s (NCBI) GenBank.1 It is now possible for most genetics laboratories to identify the species from which a tissue sample was taken without sequencing all the possible taxa it might represent.