Composti organostannici nell'ambiente marino e membrane biologiche: risposte molecolari e biochimiche nei molluschi bivalvi

Organotin compounds are worldwide diffused environmental contaminants, mainly as consequence of their extensive past use as biocides in antifouling paints. In spite of law restrictions, due to unwanted effects, organotin still persist in waters, being poorly degraded, easily resuspended from sediments and bioaccumulated in exposed organisms. The widespread toxicity and the possible threat to humans, likely to be organotin-exposed through contaminated seafood, make organotin interactions with biomolecules an intriguing biochemical topic, apart from a matter of ecotoxicological concern. Among organotins, tributyltin (TBT) is long known as the most dangerous and abundant chemical species in the Mediterranean Sea. Due to its amphiphilic nature, provided by three lipophilic arms and an electrophilic tin core, TBT can be easily incorporated in biomembranes and affect their functionality. Accordingly, it is known as a membrane-active toxicant and a mitochondrial poison. Up to now the molecular action modes of TBT are still partially unclear and poorly explored in bivalve mollusks, even if the latter play a not neglectable role in the marine trophic chain and efficiently accumulate organotins. The bivalve mollusk Mytilus galloprovincialis, selected for all experiments, is widely cultivated in the Mediterranean and currently used in ecotoxicological studies. Most work of this thesis was devoted to TBT effects on mussel mitochondria, but other possible targets of TBT were also considered. A great deal of literature points out TBT as endocrine disrupter and the masculinization of female marine gastropods, the so-called imposex, currently signals environmental organotin contamination. The hormonal status of TBT-exposed mussels and the possible interaction between hormones and contaminants in modulating microsomal hydroxilases, involved in steroid hormone and organotin detoxification, were the research topics in the period spent in Barcelona (Marco Polo fellowship). The variegated experimental approach, which consisted of two exposure experiments and in vitro tests, and the choice of selected tissues of M. galloprovincialis, the midgut gland for mitochondrial and microsomal preparations for subsequent laboratory assays and the gonads for the endocrine evaluations, aimed at drawing a clarifying pattern on the molecular mechanisms involved in organotin toxicity. TBT was promptly incorporated in midgut gland mitochondria of adult mussels exposed to 0.5 and 1.0 μg/L TBT, and partially degraded to DBT. TBT incorporation was accompanied by a decrease in the mitochondrial oligomycin-sensitive Mg-ATPase activity, while the coexistent oligomycin-insensitive fraction was unaffected. Mitochondrial fatty acids showed a clear rise in n-3 polyunsaturated fatty acids after 120 hr of TBT exposure, mainly referable to an increase in 22:6 level. TBT was also shown to inhibit the ATP hydrolytic activity of the mitochondrial F1FO complex in vitro and to promote an apparent loss of oligomycin sensitivity at higher than 1.0 μM concentration. The complex dose-dependent profile of the inhibition curve lead to the hypothesis of multiple TBT binding sites. At lower than 1.0 μM TBT concentrations the non competitive enzyme inhibition by TBT was ascribed to the non covalent binding of TBT to FO subunit. On the other hand the observed drop in oligomycin sensitivity at higher than 1.0 μM TBT could be related to the onset of covalent bonds involving thiolic groups on the enzyme structure, apparently reached only at high TBT levels. The mitochondrial respiratory complexes were in vitro affected by TBT, apart from the cytocrome c oxidase which was apparently refractory to the contaminant. The most striking inhibitory effect was shown on complex I, and ascribed to possible covalent bonds of TBT with –SH groups on the enzyme complexes. This mechanism, shouldered by the progressive decrease of free cystein residues in the presence of increasing TBT concentrations, suggests that the onset of covalent tin-sulphur bonds in distinct protein structures may constitute the molecular basis of widespread TBT effects on mitochondrial complexes. Energy production disturbances, in turn affecting energy consuming mechanisms, could be involved in other cellular changes. Mussels exposed to a wide range of TBT concentrations (20 - 200 and 2000 ng/L respectively) did not show any change in testosterone and estrogen levels in mature gonads. Most hormones were in the non-biologically active esterified form both in control and in TBT-treated mussels. Probably the endocrine status of sexually mature mussels could be refractory even to high TBT doses. In mussel digestive gland the high biological variability of microsomal 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin-O-Debenzyloxylase (BFCOD) activity, taken as a measure of CYP3A-like efficiency, probably concealed any enzyme response to TBT exposure. On the other hand the TBT-driven enhancement of BFCOD activity in vitro was once again ascribed to covalent binding to thiol groups which, in this case, would stimulate the enzyme activity. In mussels from Barcelona harbour, a highly contaminated site, the enzyme showed a decreased affinity for the 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BCF) substrate with respect to mussel sampled from Ebro Delta, a non-polluted marine site. Contaminant exposure may thus alter the kinetic features of enzymes involved in detoxification mechanisms. Contaminants and steroid hormones were clearly shown to mutually interact in the modulation of detoxification mechanisms. The xenoestrogen 17α-ethylenyl estradiol (EE2) displayed a non-competitive mixed inhibition of CYP3A-like activity by a preferential bond to the free enzyme both in Barcelona harbour and Ebro Delta mussels. The possible interaction with co-present contaminants in Barcelona harbour mussels apparently lessened the formation of the ternary complex enzyme-EE2-BCF. The whole of data confirms TBT as membrane toxicant in mussels as in other species and stresses TBT covalent binding to protein thiols as a widespread mechanism of membrane-bound-enzyme activity modulation by the contaminant.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

The Domon Family of Plant Plasma Membrane B-Type Cytochromes: Heterologous Expression, Biochemical Characterization and Physiological Roles in Vivo

The DOMON domain is a domain widespread in nature, predicted to fold in a β-sandwich structure. In plants, AIR12 is constituted by a single DOMON domain located in the apoplastic space and is GPI-modified for anchoring to the plasma membrane. Arabidopsis thaliana AIR12 has been heterologously expressed as a recombinant protein (recAtAIR12) in Pichia pastoris. Spectrophotometrical analysis of the purified protein showed that recAtAir12 is a cytochrome b. RecAtAIR12 is highly glycosylated, it is reduced by ascorbate, superoxide and naftoquinones, oxidised by monodehydroascorbate and oxygen and insensitive to hydrogen peroxide. The addition of recAtAIR12 to permeabilized plasma membranes containing NADH, FeEDTA and menadione, caused a statistically significant increase in hydroxyl radicals as detected by electron paramagnetic resonance. In these conditions, recAtAIR12 has thus a pro-oxidant role. Interestingly, AIR12 is related to the cytochrome domain of cellobiose dehydrogenase which is involved in lignin degradation, possibly via reactive oxygen species (ROS) production. In Arabidopsis the Air12 promoter is specifically activated at sites where cell separations occur and ROS, including •OH, are involved in cell wall modifications. air12 knock-out plants infected with Botrytis cinerea are more resistant than wild-type and air12 complemented plants. Also during B. cinerea infection, cell wall modifications and ROS are involved. Our results thus suggest that AIR12 could be involved in cell wall modifying reactions by interacting with ROS and ascorbate. CyDOMs are plasma membrane redox proteins of plants that are predicted to contain an apoplastic DOMON fused with a transmembrane cytochrome b561 domain. CyDOMs have never been purified nor characterised. The trans-membrane portion of a soybean CyDOM was expressed in E. coli but purification could not be achieved. The DOMON domain was expressed in P. pastoris and shown to be itself a cytochrome b that could be reduced by ascorbate.

Theoretical studies of fluid membrane mechanics

Biologische Membranen sind Fettmolekül-Doppelschichten, die sich wie zweidimensionale Flüssigkeiten verhalten. Die Energie einer solchen fluiden Oberfläche kann häufig mit Hilfe eines Hamiltonians beschrieben werden, der invariant unter Reparametrisierungen der Oberfläche ist und nur von ihrer Geometrie abhängt. Beiträge innerer Freiheitsgrade und der Umgebung können in den Formalismus mit einbezogen werden. Dieser Ansatz wird in der vorliegenden Arbeit dazu verwendet, die Mechanik fluider Membranen und ähnlicher Oberflächen zu untersuchen. Spannungen und Drehmomente in der Oberfläche lassen sich durch kovariante Tensoren ausdrücken. Diese können dann z. B. dazu verwendet werden, die Gleichgewichtsposition der Kontaktlinie zu bestimmen, an der sich zwei aneinander haftende Oberflächen voneinander trennen. Mit Ausnahme von Kapillarphänomenen ist die Oberflächenenergie nicht nur abhängig von Translationen der Kontaktlinie, sondern auch von Änderungen in der Steigung oder sogar Krümmung. Die sich ergebenden Randbedingungen entsprechen den Gleichgewichtsbedingungen an Kräfte und Drehmomente, falls sich die Kontaktlinie frei bewegen kann. Wenn eine der Oberflächen starr ist, muss die Variation lokal dieser Fläche folgen. Spannungen und Drehmomente tragen dann zu einer einzigen Gleichgewichtsbedingung bei; ihre Beiträge können nicht mehr einzeln identifiziert werden. Um quantitative Aussagen über das Verhalten einer fluiden Oberfläche zu machen, müssen ihre elastischen Eigenschaften bekannt sein. Der "Nanotrommel"-Versuchsaufbau ermöglicht es, Membraneigenschaften lokal zu untersuchen: Er besteht aus einer porenüberspannenden Membran, die während des Experiments durch die Spitze eines Rasterkraftmikroskops in die Pore gedrückt wird. Der lineare Verlauf der resultierenden Kraft-Abstands-Kurven kann mit Hilfe der in dieser Arbeit entwickelten Theorie reproduziert werden, wenn der Einfluss von Adhäsion zwischen Spitze und Membran vernachlässigt wird. Bezieht man diesen Effekt in die Rechnungen mit ein, ändert sich das Resultat erheblich: Kraft-Abstands-Kurven sind nicht länger linear, Hysterese und nichtverschwindende Trennkräfte treten auf. Die Voraussagen der Rechnungen könnten in zukünftigen Experimenten dazu verwendet werden, Parameter wie die Biegesteifigkeit der Membran mit einer Auflösung im Nanometerbereich zu bestimmen. Wenn die Materialeigenschaften bekannt sind, können Probleme der Membranmechanik genauer betrachtet werden. Oberflächenvermittelte Wechselwirkungen sind in diesem Zusammenhang ein interessantes Beispiel. Mit Hilfe des oben erwähnten Spannungstensors können analytische Ausdrücke für die krümmungsvermittelte Kraft zwischen zwei Teilchen, die z. B. Proteine repräsentieren, hergeleitet werden. Zusätzlich wird das Gleichgewicht der Kräfte und Drehmomente genutzt, um mehrere Bedingungen an die Geometrie der Membran abzuleiten. Für den Fall zweier unendlich langer Zylinder auf der Membran werden diese Bedingungen zusammen mit Profilberechnungen kombiniert, um quantitative Aussagen über die Wechselwirkung zu treffen. Theorie und Experiment stoßen an ihre Grenzen, wenn es darum geht, die Relevanz von krümmungsvermittelten Wechselwirkungen in der biologischen Zelle korrekt zu beurteilen. In einem solchen Fall bieten Computersimulationen einen alternativen Ansatz: Die hier präsentierten Simulationen sagen voraus, dass Proteine zusammenfinden und Membranbläschen (Vesikel) bilden können, sobald jedes der Proteine eine Mindestkrümmung in der Membran induziert. Der Radius der Vesikel hängt dabei stark von der lokal aufgeprägten Krümmung ab. Das Resultat der Simulationen wird in dieser Arbeit durch ein approximatives theoretisches Modell qualitativ bestätigt.

Biomimese biologischer Membranen: Konzeptionierung, Synthese und biophysikalische Charakterisierung einer Hierarchie festkörpergestützter Mimikry biologischer Membranen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Modelle zur funktionellen Mimiese biologischer Membranen im Bereich der Bionanotechnologie entwickelt. Um den Rahmen der notwendigen Faktoren und Komponenten für biomimetische Membranmodelle abzustecken, wurde das biologische Vorbild im Bezug auf Zusammensetzung, Organisation und Funktion analysiert. Die daraus abgeleiteten Erkenntnisse erlauben das Erreichen von biologisch relevanten Membranwiderständen im Bereich von mehreren MOhm cm2 und eine gute lokale Fluidität. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Hierachie unterschiedlich stark von der Festkörperoberfläche entkoppelter Membranen zur Vergrößerung des submembranen Raumes. Diese Ziele konnten realisiert werden. Das auf archaealen Etherlipiden basierende DPTL-System wurde analog dem biologischen Vorbild stereoselektiv synthetisiert und ist in der Lage die Membran bei maximaler Elongation des TEG-Spacers mit mehr als 2 nm von der Oberfläche zu entkoppeln. Die erzielten Wiederstände liegen im hohen ein- bis zweistelligen MOhm-Bereich, die Kapazität entspricht mit 0,5 µF cm-2 ebenfalls dem Wert biologischer Membranen. Die Membraneigenschaften wurden mit Hilfe von SPS, EIS, IR-Spektroskopie, QCM, AFM und Kontaktwinkelmessungen charakterisiert. Die Funktionalität und lokale Fluidität der DPTL-Membran konnte anhand des Valinomycin vermittelten K+-Transports über die Membran gezeigt werden. Fluide Elektroden oder laterale Verdünnung mit TEGL erlauben den Einbau größerer Ionenkanäle. Lipo-Glycopolymere (LGP) mit unterschiedlichen Kettenlängen wurden mit Hilfe der kontrollierten radikalischen Polymerisation mit einer PD < 1.2 synthetisiert. Es zeigte sich, daß die Vororientierung der LGPs auf dem LB-Trog, gefolgt von einem LB-Übertrag auf einen funktionalisierten Träger mit photoreaktivem SAM, nach Belichten des Systems zu einer verlässlichen kovalenten Anbindung der supramolekularen LGP-Architektur führt. Da die Lipo-Glycopolymerketten am Glycopolymerterminus nur mit oberflächennahen Repetiereinheiten an die photoaktivierte Oberfläche binden, sind sie in der Lage Oberflächenrauhigkeiten des Festkörpersubstrates auszugleichen. Die photochemische Immobilisierung von funktionell orientierten supramolekularen LGP-Architekturen auf Goldoberflächen resultiert in tBLMs mit großen vertikalen Enkopplungen der Membran von der Festkörperoberfläche (>8 nm). Der funktionelle Ionentransport von Kaliumionen durch Valinomycin zeigt eine ausreichende lokale Fluidität der Membran die mit einem guten Membranwiderstand (mehrere MOhm) kombiniert ist. Große Membran-Oberflächenentkopplungen konnten mit Hilfe plasmapolymerisierter elektrophiler Polymere erreicht werden. Filmdicken von 50 nm sind mit homogener Oberfläche und Rauhigkeiten im Bereich von Nanometern möglich. Das System zeigt interessante fluide Eigenschaften mit guten Erholungsraten bei FRAP-Experimenten (Diffusionskonstanten von etwa 17 mikro m2 s-1). Die elektrischen Eigenschaften liegen mit Widerständen von wenigen kOhm unterhalb der für gute Membranmimikrie notwendigen Werte. Erstmalig konnte gezeigt werden, daß mit Hilfe dieser Methode inerte Polymere/Plastikträger (zum Beispiel Polypropylen und TOPAS) in effizienter Weise kovalent mit reaktiven Polymeroberflächen modifiziert werden können (Anwendung als DNA-Chip ist beschrieben).

EPR spectroscopic investigation of membrane protein structure and folding on light harvesting complex LHCIIb

Structure and folding of membrane proteins are important issues in molecular and cell biology. In this work new approaches are developed to characterize the structure of folded, unfolded and partially folded membrane proteins. These approaches combine site-directed spin labeling and pulse EPR techniques. The major plant light harvesting complex LHCIIb was used as a model system. Measurements of longitudinal and transversal relaxation times of electron spins and of hyperfine couplings to neighboring nuclei by electron spin echo envelope modulation(ESEEM) provide complementary information about the local environment of a single spin label. By double electron electron resonance (DEER) distances in the nanometer range between two spin labels can be determined. The results are analyzed in terms of relative water accessibilities of different sites in LHCIIb and its geometry. They reveal conformational changes as a function of micelle composition. This arsenal of methods is used to study protein folding during the LHCIIb self assembly and a spatially and temporally resolved folding model is proposed. The approaches developed here are potentially applicable for studying structure and folding of any protein or other self-assembling structure if site-directed spin labeling is feasible and the time scale of folding is accessible to freeze-quench techniques.

Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures

Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in the cell’s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing redox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman (SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes. The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c. Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clarify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the structural and coordination changes of the heme environment. The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to understand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.

Machine-learning methods for structure prediction of β-barrel membrane proteins

Different types of proteins exist with diverse functions that are essential for living organisms. An important class of proteins is represented by transmembrane proteins which are specifically designed to be inserted into biological membranes and devised to perform very important functions in the cell such as cell communication and active transport across the membrane. Transmembrane β-barrels (TMBBs) are a sub-class of membrane proteins largely under-represented in structure databases because of the extreme difficulty in experimental structure determination. For this reason, computational tools that are able to predict the structure of TMBBs are needed. In this thesis, two computational problems related to TMBBs were addressed: the detection of TMBBs in large datasets of proteins and the prediction of the topology of TMBB proteins. Firstly, a method for TMBB detection was presented based on a novel neural network framework for variable-length sequence classification. The proposed approach was validated on a non-redundant dataset of proteins. Furthermore, we carried-out genome-wide detection using the entire Escherichia coli proteome. In both experiments, the method significantly outperformed other existing state-of-the-art approaches, reaching very high PPV (92%) and MCC (0.82). Secondly, a method was also introduced for TMBB topology prediction. The proposed approach is based on grammatical modelling and probabilistic discriminative models for sequence data labeling. The method was evaluated using a newly generated dataset of 38 TMBB proteins obtained from high-resolution data in the PDB. Results have shown that the model is able to correctly predict topologies of 25 out of 38 protein chains in the dataset. When tested on previously released datasets, the performances of the proposed approach were measured as comparable or superior to the current state-of-the-art of TMBB topology prediction.

Statistical problems related to excitation threshold and reset value of membrane potentials

Die vorliegende Arbeit ist motiviert durch biologische Fragestellungen bezüglich des Verhaltens von Membranpotentialen in Neuronen. Ein vielfach betrachtetes Modell für spikende Neuronen ist das Folgende. Zwischen den Spikes verhält sich das Membranpotential wie ein Diffusionsprozess X der durch die SDGL dX_t= beta(X_t) dt+ sigma(X_t) dB_t gegeben ist, wobei (B_t) eine Standard-Brown'sche Bewegung bezeichnet. Spikes erklärt man wie folgt. Sobald das Potential X eine gewisse Exzitationsschwelle S überschreitet entsteht ein Spike. Danach wird das Potential wieder auf einen bestimmten Wert x_0 zurückgesetzt. In Anwendungen ist es manchmal möglich, einen Diffusionsprozess X zwischen den Spikes zu beobachten und die Koeffizienten der SDGL beta() und sigma() zu schätzen. Dennoch ist es nötig, die Schwellen x_0 und S zu bestimmen um das Modell festzulegen. Eine Möglichkeit, dieses Problem anzugehen, ist x_0 und S als Parameter eines statistischen Modells aufzufassen und diese zu schätzen. In der vorliegenden Arbeit werden vier verschiedene Fälle diskutiert, in denen wir jeweils annehmen, dass das Membranpotential X zwischen den Spikes eine Brown'sche Bewegung mit Drift, eine geometrische Brown'sche Bewegung, ein Ornstein-Uhlenbeck Prozess oder ein Cox-Ingersoll-Ross Prozess ist. Darüber hinaus beobachten wir die Zeiten zwischen aufeinander folgenden Spikes, die wir als iid Treffzeiten der Schwelle S von X gestartet in x_0 auffassen. Die ersten beiden Fälle ähneln sich sehr und man kann jeweils den Maximum-Likelihood-Schätzer explizit angeben. Darüber hinaus wird, unter Verwendung der LAN-Theorie, die Optimalität dieser Schätzer gezeigt. In den Fällen OU- und CIR-Prozess wählen wir eine Minimum-Distanz-Methode, die auf dem Vergleich von empirischer und wahrer Laplace-Transformation bezüglich einer Hilbertraumnorm beruht. Wir werden beweisen, dass alle Schätzer stark konsistent und asymptotisch normalverteilt sind. Im letzten Kapitel werden wir die Effizienz der Minimum-Distanz-Schätzer anhand simulierter Daten überprüfen. Ferner, werden Anwendungen auf reale Datensätze und deren Resultate ausführlich diskutiert.

New sensing platforms based on nanoscopic devices for probing protein-membrane interactions

A novel nanosized and addressable sensing platform based on membrane coated plasmonic particles for detection of protein adsorption using dark field scattering spectroscopy of single particles has been established. To this end, a detailed analysis of the deposition of gold nanorods on differently functionalized substrates is performed in relation to various factors (such as the pH, ionic strength, concentration of colloidal suspension, incubation time) in order to find the optimal conditions for obtaining a homogenous distribution of particles at the desired surface number density. The possibility of successfully draping lipid bilayers over the gold particles immobilized on glass substrates depends on the careful adjustment of parameters such as membrane curvature and adhesion properties and is demonstrated with complementary techniques such as phase imaging AFM, fluorescence microscopy (including FRAP) and single particle spectroscopy. The functionality and sensitivity of the proposed sensing platform is unequivocally certified by the resonance shifts of the plasmonic particles that were individually interrogated with single particle spectroscopy upon the adsorption of streptavidin to biotinylated lipid membranes. This new detection approach that employs particles as nanoscopic reporters for biomolecular interactions insures a highly localized sensitivity that offers the possibility to screen lateral inhomogeneities of native membranes. As an alternative to the 2D array of gold nanorods, short range ordered arrays of nanoholes in optically transparent gold films or regular arrays of truncated tetrahedron shaped particles are built by means of colloidal nanolithography on transparent substrates. Technical issues mainly related to the optimization of the mask deposition conditions are successfully addressed such that extended areas of homogenously nanostructured gold surfaces are achieved. Adsorption of the proteins annexin A1 and prothrombin on multicomponent lipid membranes as well as the hydrolytic activity of the phospholipase PLA2 were investigated with classical techniques such as AFM, ellipsometry and fluorescence microscopy. At first, the issues of lateral phase separation in membranes of various lipid compositions and the dependency of the domains configuration (sizes and shapes) on the membrane content are addressed. It is shown that the tendency for phase segregation of gel and fluid phase lipid mixtures is accentuated in the presence of divalent calcium ions for membranes containing anionic lipids as compared to neutral bilayers. Annexin A1 adsorbs preferentially and irreversibly on preformed phosphatidylserine (PS) enriched lipid domains but, dependent on the PS content of the bilayer, the protein itself may induce clustering of the anionic lipids into areas with high binding affinity. Corroborated evidence from AFM and fluorescence experiments confirm the hypothesis of a specifically increased hydrolytic activity of PLA2 on the highly curved regions of membranes due to a facilitated access of lipase to the cleavage sites of the lipids. The influence of the nanoscale gold surface topography on the adhesion of lipid vesicles is unambiguously demonstrated and this reveals, at least in part, an answer for the controversial question existent in the literature about the behavior of lipid vesicles interacting with bare gold substrates. The possibility of formation monolayers of lipid vesicles on chemically untreated gold substrates decorated with gold nanorods opens new perspectives for biosensing applications that involve the radiative decay engineering of the plasmonic particles.

Caratteristiche biologiche e potenziale applicativo delle cellule staminali derivate da membrane fetali

La ricerca sulle cellule staminali apre nuove prospettive per approcci di terapia cellulare. Molta attenzione è concentrata sulle cellule staminali isolate da membrane fetali, per la facilità di recupero del materiale di partenza, le limitate implicazioni etiche e le caratteristiche delle popolazioni di cellule staminali residenti. In particolare a livello dell’epitelio amniotico si concentra una popolazione di cellule (hAECs) con interessanti caratteristiche di staminalità, pluripotenza e immunomodulazione. Restano però una serie di limiti prima di arrivare ad un’applicazione clinica: l’uso di siero di origine animale nei terreni di coltura e le limitate conoscenze legate alla reazione immunitaria in vivo. La prima parte di questo lavoro è focalizzata sulle caratteristiche delle hAECs coltivate in un terreno privo di siero, in confronto a un terreno di coltura classico. Lo studio è concentrato sull’analisi delle caratteristiche biologiche, immunomodulatorie e differenziative delle hAECs. L’interesse verso le caratteristiche immunomodulatorie è legato alla possibilità che l’uso di un terreno serum free riduca il rischio di rigetto dopo trapianto in vivo. La maggior parte degli studi in vivo con cellule isolate da membrane fetali sono stati realizzati con cellule di derivazione umana in trapianti xenogenici, ma poco si sa circa la sopravvivenza di queste cellule in trapianti allogenici, come nel caso di trapianti di cellule di derivazione murina in modelli di topo. La seconda parte dello studio è focalizzata sulla caratterizzazione delle cellule derivate da membrane fetali di topo (mFMSC). Le caratteristiche biologiche, differenziative e immunomodulatorie in vitro e in vivo delle mFMSC sono state confrontate con i fibroblasti embrionali di topo. In particolare è stata analizzata la risposta immunitaria a trapianti di mFMSC nel sistema nervoso centrale (CNS) in modelli murini immunocompetenti.

A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy

Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.

In vitro synthesis of the light-harvesting complex into artificial membrane systems

In green plants, the function of collecting solar energy for photosynthesis is fulfilled by a series of light-harvesting complexes (LHC). The light-harvesting chlorophyll a/b protein (LHCP) is synthesized in the cytosol as a precursor (pLHCP), then imported into chloroplasts and assembled into photosynthetic thylakoid membranes. Knowledge about the regulation of the transport processes of LHCP is rather limited. Closely mimicking the in vivo situation, cell-free protein expression system is employed in this dissertation to study the reconstitution of LHCP into artificial membranes. The approach starts merely from the genetic information of the protein, so the difficult and time-consuming procedures of protein expression and purification can be avoided. The LHCP encoding gene from Pisum sativum was cloned into a cell-free compatible vector system and the protein was expressed in wheat germ extracts. Vesicles or pigment-containing vesicles were prepared with either synthetic lipid or purified plant leaf lipid to mimic cell membranes. LHCP was synthesized in wheat germ extract systems with or without supplemented lipids. The addition of either synthetic or purified plant leaf lipid was found to be beneficial to the general productivity of the expression system. The lipid membrane insertion of the LHCP was investigated by radioactive labelling, protease digestion, and centrifugation assays. The LHCP is partially protected against protease digestion; however the protection is independent from the supplemented lipids.

Purificazione di plasminogeno con membrane di affinita'

Alcune patologie dell’occhio come la retinopatia diabetica, il pucker maculare, il distacco della retina possono essere curate con un intervento di vitrectomia. I rischi associati all’intervento potrebbero essere superati ricorrendo alla vitrectomia enzimatica con plasmina in associazione o in sostituzione della vitrectomia convenzionale. Inoltre, l’uso di plasmina autologa eviterebbe problemi di rigetto. La plasmina si ottiene attivando il plasminogeno con enzimi quali l’attivatore tissutale (tPA) e l’urochinasi ( uPA ) . La purificazione del plasminogeno dal sangue avviene normalmente attraverso cromatografia di affinità con resina. Tuttavia, le membrane di affinità costituiscono un supporto ideale per questa applicazione poiché possono essere facilmente impaccate prima dell’intervento, permettendo la realizzazione di un dispositivo monouso che fornisce un processo rapido ed economico. Obiettivo di questo lavoro è la preparazione di membrane di affinità per la purificazione del plasminogeno utilizzando L-lisina come ligando di affinità. Per questo scopo sono state usate membrane in cellulosa rigenerata ad attivazione epossidica, modificate con due diversi protocolli per l’immobilizzazione di L-lisina. La densità ligando è stata misurata mediante un saggio colorimetrico che usa l’acido arancio 7 come indicatore. La resa di immobilizzazione è stata studiata in funzione del tempo di reazione e della concentrazione di L-lisina. Le membrane ottimizzate sono state caratterizzate con esperimenti dinamici usando siero bovino e umano, i risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in esperimenti paralleli condotti con una resina commerciale di affinità con L-lisina. Durante gli esperimenti con siero, le frazioni provenienti da ogni fase cromatografica sono state raccolte e analizzate con HPLC ed elettroforesi SDS-PAGE. In particolare, l’elettroforesi dei campioni eluiti presenta una banda del plasminogeno ben definita indicando che le membrane di affinità con L-lisina sono adatte alla purificazione del plasminogeno. Inoltre, è emerso che le membrane hanno maggiore produttività della resina commerciale di riferimento.

Phosphonic acid-containing molecules as proton conductors and linkers for hybrid materials

In dieser Arbeit werden zwei Arten von nicht-kovalent verknüpften Netzwerkstrukturen vorgestellt, die aus phosphonsäurehaltigen Molekülen aufgebaut sind. Einerseits sollen diese phosphonsäurehaltigen Moleküle als Protonenleiter in Brennstoffzellen eingesetzt werden. Dies ist durch die Möglichkeit des kooperativen Protonentransports in wasserstoffbrückenhaltigen Netzwerken begründet. Auf der anderen Seite sollen die phosphonsäurehaltigen Moleküle unter Einsatz von Metallkationen zur Darstellung ionischer Netzwerke verwendet werden. In diesem Fall fungieren die phosphonierten Moleküle als Linker in porösen organisch-anorganischen Hybridmaterialien, die sich beispielsweise zur Gasspeicherung eignen.rnEine Brennstoffzelle stellt Energie mit hoher Effizienz und geringer Umweltbelastung bereit. Das Herzstück der Brennstoffzelle ist die Elektrolytmembran, die auch als Separator oder Protonenaustauschmembran (PEM) bezeichnet wird. Es wird davon ausgegangen, daß der Schlüssel zur Weiterentwicklung der PEM-Brennstoffzellen in der Entwicklung von Elektrolyten liegt, die ausschließlich und effizient Protonen transportieren und darüber hinaus chemisch (oxidationsbeständig) und mechanisch stabil sind. Die mechanische Stabilität betrifft insbesondere den Betrieb der Brennstoffzelle bei hohen Temperaturen und niedriger relativer Feuchtigkeit. In dieser Arbeit wird ein neuartiger Ansatz zum Erreichen eines hohen Protonentransports im Festkörper vorgestellt, der auf dem Einsatz kleiner Moleküle beruht, die durch Selbstorganisation eine kontinuierliche protonenleitende Phase erzeugen. Bis jetzt stellt Hexakis(p-phosphonatophenyl)benzol das erste Beispiel eines kristallinen Protonenleiters dar, der im festen Zustand eine hohe und konstante Leistung zeigt. Die Modifizierung von Hexakis(p-phosphonatophenyl)benzol, entweder durch Änderung von para- zu meta-Substitution oder die Einführung von Alkylketten, führt zu Verbindungen geringerer Kristallinität und niedriger Protonenleitfähigkeit.rnIm zweiten Teil der Arbeit wurde 1,3,5-Tris(p-phosphonatophenyl)benzol als Linker in der Synthese von offenen Phosphonat-Netzwerken eingesetzt. Es bilden sich aufgrund der ionischen Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen Metallkationen und den negativ geladenen Phosphonsäuregruppen hochstabile Feststoffe. Eines der wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit besteht darin, daß 1,3,5-Tris(p-phosphonatophenyl)benzol als Linker zum Aufbau poröser Hybridmaterialien eingesetzt werden kann. Zum ersten Mal wurde ein dreifach phosphoniertes organisches Molekül zum Aufbau mikroporöser offener Phosphonat-Netzwerke verwendet. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Porosität mit dem Wachstumsmechanismus dieser Materialien zusammenhängt. Es ist nur dann möglich ein gleichfalls mikroporöses und kristallines ionisches Netzwerk auf der Grundlage phosphonierter Moleküle zu erhalten, wenn Linker und Konnektor die gleiche Geometrie und Funktionalität besitzen.rn