Secretory TAT-peptide-mediated protein transduction of LIF receptor α-chain distal cytoplasmic motifs into human myeloid HL-60 cells

The distal cytoplasmic motifs of leukemia inhibitory factor receptor α-chain (LIFRα-CT3) can independently induce intracellular myeloid differentiation in acute myeloid leukemia (AML) cells by gene transfection; however, there are significant limitations in the potential clinical use of these motifs due to liposome-derived genetic modifications. To produce a potentially therapeutic LIFRα-CT3 with cell-permeable activity, we constructed a eukaryotic expression pcDNA3.0-TAT-CT3-cMyc plasmid with a signal peptide (ss) inserted into the N-terminal that codes for an ss-TAT-CT3-cMyc fusion protein. The stable transfection of Chinese hamster ovary (CHO) cells via this vector and subsequent selection by Geneticin resulted in cell lines that express and secrete TAT-CT3-cMyc. The spent medium of pcDNA3.0-TAT-CT3-cMyc-transfected CHO cells could be purified using a cMyc-epitope-tag agarose affinity chromatography column and could be detected via SDS-PAGE, with antibodies against cMyc-tag. The direct administration of TAT-CT3-cMyc to HL-60 cell culture media caused the enrichment of CT3-cMyc in the cytoplasm and nucleus within 30 min and led to a significant reduction of viable cells (P < 0.05) 8 h after exposure. The advantages of using this mammalian expression system include the ease of generating TAT fusion proteins that are adequately transcripted and the potential for a sustained production of such proteins in vitro for future AML therapy.

Adenovirus-mediated siRNA targeting TNF-α and overexpression of bone morphogenetic protein-2 promotes early osteoblast differentiation on a cell model of Ti particle-induced inflammatory response in vitro

Wear particles are phagocytosed by macrophages and other inflammatory cells, resulting in cellular activation and release of proinflammatory factors, which cause periprosthetic osteolysis and subsequent aseptic loosening, the most common causes of total joint arthroplasty failure. During this pathological process, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) plays an important role in wear-particle-induced osteolysis. In this study, recombination adenovirus (Ad) vectors carrying both target genes [TNF-α small interfering RNA (TNF-α-siRNA) and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)] were synthesized and transfected into RAW264.7 macrophages and pro-osteoblastic MC3T3-E1 cells, respectively. The target gene BMP-2, expressed on pro-osteoblastic MC3T3-E1 cells and silenced by the TNF-α gene on cells, was treated with titanium (Ti) particles that were assessed by real-time PCR and Western blot. We showed that recombinant adenovirus (Ad-siTNFα-BMP-2) can induce osteoblast differentiation when treated with conditioned medium (CM) containing RAW264.7 macrophages challenged with a combination of Ti particles and Ad-siTNFα-BMP-2 (Ti-ad CM) assessed by alkaline phosphatase activity. The receptor activator of nuclear factor-κB ligand was downregulated in pro-osteoblastic MC3T3-E1 cells treated with Ti-ad CM in comparison with conditioned medium of RAW264.7 macrophages challenged with Ti particles (Ti CM). We suggest that Ad-siTNFα-BMP-2 induced osteoblast differentiation and inhibited osteoclastogenesis on a cell model of a Ti particle-induced inflammatory response, which may provide a novel approach for the treatment of periprosthetic osteolysis.

The structure of arabidopsis NPR1 : its function as a salicylic acid receptor and a metal-binding protein

The Arabidopsis NPRI protein regulates systemic acquired resistance dependent on salicylic acid. Analyses by plant two-hybrid analysis in vivo and pull-down assays in vitro showed that the BTB/POZ domain of NPRI at the N-terminus serves as an autoinhibitory domain to negate the function of the transactivation domain at the C-terminus through direct binding of these two domains. I t was also shown that the binding of the BTB/POZ domain to the C-terminus of NPRI was abolished by SA treatment, suggesting that SA could interfere directly with this binding. By gel filtration, it was demonstrated that SA affects the conformation of full-length NPRl , confirming the role of NPRI as an SA receptor. Gel filtration analysis also indicated that NPRI could be converted from an oligomer to a dimer with SA treatment. Furthermore, one N-terminal deletion ~513 has been shown to act as a metal-binding protein and its two Cys-521 and Cys-529 are important for binding to Ni 2 + by pull-down assays.

The Arabidopsis NPR1 Protein Is a Receptor for the Plant Defense Hormone Salicylic Acid

Systemic Acquired Resistance (SAR) is a type of plant systemic resistance occurring against a broad spectrum of pathogens. It can be activated in response to pathogen infection in the model plant Arabidopsis thaliana and many agriculturally important crops. Upon SAR activation, the infected plant undergoes transcriptional reprogramming, marked by the induction of a battery of defense genes, including Pathogenesis-related (PR) genes. Activation of the PR-1 gene serves as a molecular marker for the deployment of SAR. The accumulation of a defense hormone, salicylic acid (SA) is crucial for the infected plant to mount SAR. Increased cellular levels of SA lead to the downstream activation of the PR-1 gene, triggered by the combined action of the Non-expressor of Pathogenesis-related Gene 1 (NPR1) protein and the TGA II-clade transcription factor (namely TGA2). Despite the importance of SA, its receptor has remained elusive for decades. In this study, we demonstrated that in Arabidopsis the NPR1 protein is a receptor for SA. SA physically binds to the C-terminal transactivation domain of NPR1. The two cysteines (Cys521 and Cys529), which are important for NPR1’s coactivator function, within this transactivation domain are critical for the binding of SA to NPR1. The interaction between SA and NPR1 requires a transition metal, copper, as a cofactor. Our results also suggested a conformational change in NPR1 upon SA binding, releasing the C-terminal transactivation domain from the N-terminal autoinhibitory BTB/POZ domain. These results advance our understanding of the plant immune function, specifically related to the molecular mechanisms underlying SAR. The discovery of NPR1 as a SA receptor enables future chemical screening for small molecules that activate plant immune responses through their interaction with NPR1 or NPR1-like proteins in commercially important plants. This will help in identifying the next generation of non-biocidal pesticides.

Requirements for the selective degradation of CD4 receptor molecules by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein in the endoplasmic reticulum.

BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Étude de la fonction anti-apoptotique de la sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase des virus de l’herpès simplex

L’élimination des cellules infectées par apoptose constitue un mécanisme de défense antivirale. Les virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1 et 2 encodent des facteurs qui inhibent l’apoptose induite par la réponse antivirale. La sous-unité R1 de la ribonucléotide réductase d’HSV-2 (ICP10) possède une fonction anti-apoptotique qui protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par les récepteurs de mort en agissant en amont ou au niveau de l’activation de la procaspase-8. Puisqu’une infection avec un mutant HSV-1 déficient pour la R1 diminue la résistance des cellules infectées vis à vis du TNFα, il a été suggéré que la R1 d’HSV-1 (ICP6) pourrait posséder une fonction anti-apoptotique. Le but principal de cette thèse est d’étudier le mécanisme et le potentiel de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV-1 et de la R1 d'HSV-2. Dans une première étude, nous avons investigué le mécanisme de la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV en utilisant le TNFα et le FasL, deux inducteurs des récepteurs de mort impliqués dans la réponse immune anti-HSV. Cette étude a permis d’obtenir trois principaux résultats concernant la fonction anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Premièrement, la R1 d’HSV-1 inhibe l’apoptose induite par le TNFα et par le FasL aussi efficacement que la R1 d’HSV-2. Deuxièmement, la R1 d’HSV-1 est essentielle à l’inhibition de l’apoptose induite par le FasL. Troisièmement, la R1 d’HSV interagit constitutivement avec la procaspase-8 d’une manière qui inhibe la dimérisation et donc l’activation de la caspase-8. Ces résultats suggèrent qu’en plus d’inhiber l’apoptose induite par les récepteurs de mort la R1 d’HSV peut prévenir l’activation de la caspase-8 induite par d’autres stimuli pro-apoptotiques. Les ARN double-brins (ARNdb) constituant un intermédiaire de la transcription du génome des HSV et activant l’apoptose par une voie dépendante de la caspase-8, nous avons testé dans une seconde étude l’impact de la R1 d’HSV sur l’apoptose induite par l’acide polyriboinosinique : polyribocytidylique (poly(I:C)), un analogue synthétique des ARNdb. Ces travaux ont montré qu’une infection avec les HSV protège les cellules épithéliales de l’apoptose induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV-1 joue un rôle majeur dans l’inhibition de l’activation de la caspase-8 induite par le poly(I:C). La R1 d’HSV interagit non seulement avec la procaspase-8 mais aussi avec RIP1 (receptor interacting protein 1). En interagissant avec RIP1, la R1 d’HSV-2 inhibe l’interaction entre RIP1 et TRIF (Toll/interleukine-1 receptor-domain-containing adapter-inducing interferon β), l’adaptateur du Toll-like receptor 3 qui est un détecteur d’ARNdb , laquelle est essentielle pour signaler l’apoptose induite par le poly(I:C) extracellulaire et la surexpression de TRIF. Ces travaux démontrent la capacité de la R1 d’HSV à inhiber l’apoptose induite par divers stimuli et ils ont permis de déterminer le mécanisme de l’activité anti-apoptotique de la R1 d’HSV. Très tôt durant l’infection, cFLIP, un inhibiteur cellulaire de la caspase-8, est dégradé alors que la R1 d’HSV s’accumule de manière concomitante. En interagissant avec la procapsase-8 et RIP1, la R1 d’HSV se comporte comme un inhibiteur viral de l’activation de la procaspase-8 inhibant l’apoptose induite par les récepteurs de mort et les détecteurs aux ARNdb.

Étude du trafic cellulaire de la convertase de proprotéine PCSK9 responsable de la dégradation du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR)

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'hypercholestérolémie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractérisée par des niveaux élevés de lipoprotéines de faible densité (LDL, aussi appelé “mauvais cholestérol”). La présence prolongée de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athérosclérotiques, ce qui peut conduire à l'obstruction des artères et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au récepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hépatocytes. Des études génétiques humaines ont identifié PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisième locus responsable de l'hypercholestérolémie autosomique dominante après le LDLR et son ligand l’apolipoprotéine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dégradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associées à des niveaux plasmatiques élevés de LDL et à l'apparition précoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu’à ~ 88% grâce à une réduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour réduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR à la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hépatocytes et provoque sa dégradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette étude est de déterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dégrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dégradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont été fusionnées à la protéine fluorecente mCherry dans le but d'étudier leur mobilité moléculaire dans les cellules hépatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilité protéique plus élevée (> 35% par rapport au WT) dans le réseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse après photoblanchiment (iFRAP) ont montré que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilité protéique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et électronique démontrent pour la toute première fois que PCSK9 est localisée et concentrée dans le TGN des hépatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel à la dégradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes démontrent pour la première fois que le CHRD n'est pas nécessaire à l'internalisation de PCSK9. Ces résultats apportent de nouveaux éléments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au développement d'inhibiteurs de la dégradation du LDLR induite par PCSK9.

Cardiac cell fate control by the imidazoline I1 receptor/nischarin : application in cardiac pathology

La moxonidine, un médicament antihypertenseur sympatholytique de type imidazolinique, agit au niveau de la médulla du tronc cérébral pour diminuer la pression artérielle, suite à l’activation sélective du récepteur aux imidazolines I1 (récepteur I1, aussi nommé nischarine). Traitement avec de la moxonidine prévient le développement de l’hypertrophie du ventricule gauche chez des rats hypertendus (SHR), associé à une diminution de la synthèse et une élévation transitoire de la fragmentation d’ADN, des effets antiprolifératifs et apoptotiques. Ces effets se présentent probablement chez les fibroblastes, car l’apoptose des cardiomyocytes pourrait détériorer la fonction cardiaque. Ces effets apparaissent aussi avec des doses non hypotensives de moxonidine, suggérant l’existence d’effets cardiaques directes. Le récepteur I1 se trouvé aussi dans les tissus cardiaques; son activation ex vivo par la moxonidine stimule la libération de l’ANP, ce qui montre que les récepteurs I1 cardiaques sont fonctionnels malgré l’absence de stimulation centrale. Sur la base de ces informations, en plus du i) rôle des peptides natriurétiques comme inhibiteurs de l’apoptose cardiaque et ii) des études qui lient le récepteur I1 avec la maintenance de la matrix extracellulaire, on propose que, à part les effets sympatholytiques centrales, les récepteurs I1 cardiaques peuvent contrôler la croissance-mort cellulaire. L’activation du récepteur I1 peut retarder la progression des cardiopathies vers la défaillance cardiaque, en inhibant des signaux mal adaptatifs de prolifération et apoptose. Des études ont été effectuées pour : 1. Explorer les effets in vivo sur la structure et la fonction cardiaque suite au traitement avec moxonidine chez le SHR et le hamster cardiomyopathique. 2. Définir les voies de signalisation impliquées dans les changements secondaires au traitement avec moxonidine, spécifiquement sur les marqueurs inflammatoires et les voies de signalisation régulant la croissance et la survie cellulaire (MAPK et Akt). 3. Explorer les effets in vitro de la surexpression et l’activation du récepteur I1 sur la survie cellulaire dans des cellules HEK293. 4. Rechercher la localisation, régulation et implication dans la croissance-mort cellulaire du récepteur I1 in vitro (cardiomyocytes et fibroblastes), en réponse aux stimuli associés au remodelage cardiaque : norépinephrine, cytokines (IL-1β, TNF-α) et oxydants (H2O2). Nos études démontrent que la moxonidine, en doses hypotensives et non-hypotensives, améliore la structure et la performance cardiaque chez le SHR par des mécanismes impliquant l’inhibition des cytokines et des voies de signalisation p38 MAPK et Akt. Chez le hamster cardiomyopathique, la moxonidine améliore la fonction cardiaque, module la réponse inflammatoire/anti-inflammatoire et atténue la mort cellulaire et la fibrose cardiaque. Les cellules HEK293 surexprimant la nischarine survivent et prolifèrent plus en réponse à la moxonidine; cet effet est associé à l’inhibition des voies ERK, JNK et p38 MAPK. La surexpression de la nischarine protège aussi de la mort cellulaire induite par le TNF-α, l’IL-1β et le H2O2. En outre, le récepteur I1 s’exprime dans les cardiomyocytes et fibroblastes, son activation inhibe la mort des cardiomyocytes et la prolifération des fibroblastes induite par la norépinephrine, par des effets différentiels sur les MAPK et l’Akt. Dans des conditions inflammatoires, la moxonidine/récepteur aux imidazolines I1 protège les cardiomyocytes et facilite l’élimination des myofibroblastes par des effets contraires sur JNK, p38 MAPK et iNOS. Ces études démontrent le potentiel du récepteur I1/nischarine comme cible anti-hypertrophique et anti-fibrose à niveau cardiaque. L’identification des mécanismes cardioprotecteurs de la nischarine peut amener au développement des traitements basés sur la surexpression de la nischarine chez des patients avec hypertrophie ventriculaire. Finalement, même si l’effet antihypertenseur des agonistes du récepteur I1 centraux est salutaire, le développement de nouveaux agonistes cardiosélectifs du récepteur I1 pourrait donner des bénéfices additionnels chez des patients non hypertendus.

Adrenergic and muscarinic receptor subtypes functional regulation during diabetogenesis: Effect of curcumin and vitamin D3 pre-treatment

In the present study, the initial phase was directed to confirm the effects of curcumin and vitamin D3 in preventing or delaying diabetes onset by studying the blood glucose and insulin levels in the pre-treated and diabetic groups. Behavioural studies were conducted to evaluate the cognitive and motor function in experimental rats. The major focus of the study was to understand the cellular and neuronal mechanisms that ensure the prophylactic capability of curcumin and vitamin D3. To elucidate the mechanisms involved in conferring the antidiabetogenesis effect, we examined the DNA and protein profiles using radioactive incorporation studies for DNA synthesis, DNA methylation and protein synthesis. Furthermore the gene expression studies of Akt-1, Pax, Pdx-1, Neuro D1, insulin like growth factor-1 and NF-κB were done to monitor pancreatic beta cell proliferation and differentiation. The antioxidant and antiapoptotic actions of curcumin and vitamin D3 were examined by studying the expression of antioxidant enzymes - SOD and GPx, and apoptotic mediators like Bax, caspase 3, caspase 8 and TNF-α. In order to understand the signalling pathways involved in curcumin and vitamin D3 action, the second messengers, cAMP, cGMP and IP3 were studied along with the expression of vitamin D receptor in the pancreas. The neuronal regulation of pancreatic beta cell maintenance, proliferation and insulin release was studied by assessing the adrenergic and muscarinic receptor functional regulation in the pancreas, brain stem, hippocampus and hypothalamus. The receptor number and binding affinity of total muscarinic, muscarinic M1, muscarinic M3, total adrenergic, α adrenergic and β adrenergic receptor subtypes were studied in pancreas, brain stem and hippocampus of experimental rats. The mRNA expression of muscarinic and adrenergic receptor subtypes were determined using Real Time PCR. Immunohistochemistry studies using confocal microscope were carried out to confirm receptor density and gene expression results. Cell signalling alterations in the pancreas and brain regions associated with diabetogenesis and antidiabetogenesis were assessed by examining the gene expression profiles of vitamin D receptor, CREB, phospholipase C, insulin receptor and GLUT. This study will establish the anti-diabetogenesis activity of curcumin and vitamin D3 pre-treatment and will attempt to understand the cellular, molecular and neuronal control mechanism in the onset of diabetes.Administration of MLD-STZ to curcumin and vitamin D3 pre-treated rats induced only an incidental prediabetic condition. Curcumin and vitamin D3 pretreated groups injected with MLD-STZ exhibited improved circulating insulin levels and behavioural responses when compared to MLD-STZ induced diabetic group. Activation of beta cell compensatory response induces an increase in pancreatic insulin output and beta cell mass expansion in the pre-treated group. Cell signalling proteins that regulate pancreatic beta cell survival, insulin release, proliferation and differentiation showed a significant increase in curcumin and vitamin D3 pre-treated rats. Marked decline in α2 adrenergic receptor function in pancreas helps to relent sympathetic inhibition of insulin release. Neuronal stimulation of hyperglycemia induced beta cell compensatory response is mediated by escalated signalling through β adrenergic, muscarinic M1 and M3 receptors. Pre-treatment mediated functional regulation of adrenergic and cholinergic receptors, key cell signalling proteins and second messengers improves pancreatic glucose sensing, insulin gene expression, insulin secretion, cell survival and beta cell mass expansion in pancreas. Curcumin and vitamin D3 pre-treatment induced modulation of adrenergic and cholinergic signalling in brain stem, hippocampus and hypothalamus promotes insulin secretion, beta cell compensatory response, insulin sensitivity and energy balance to resist diabetogenesis. Pre-treatment improved second messenger levels and the gene expression of intracellular signalling molecules in brain stem, hippocampus and hypothalamus, to retain a functional neuronal response to hyperglycemia. Curcumin and vitamin D3 protect pancreas and brain regions from oxidative stress by their indigenous antioxidant properties and by their ability to stimulate cellular free radical defence system. The present study demonstrates the role of adrenergic and muscarinic receptor subtypes functional regulation in curcumin and vitamin D3 mediated anti-diabetogenesis. This will have immense clinical significance in developing effective strategies to delay or prevent the onset of diabetes.

MicroRNA-3148 Modulates Allelic Expression of Toll-Like Receptor 7 Variant Associated with Systemic Lupus Erythematosus

We previously reported that the G allele of rs3853839 at 3′untranslated region (UTR) of Toll-like receptor 7 (TLR7) was associated with elevated transcript expression and increased risk for systemic lupus erythematosus (SLE) in 9,274 Eastern Asians [P = 6.5×10−10, odds ratio (OR) (95%CI) = 1.27 (1.17–1.36)]. Here, we conducted trans-ancestral fine-mapping in 13,339 subjects including European Americans, African Americans, and Amerindian/Hispanics and confirmed rs3853839 as the only variant within the TLR7-TLR8 region exhibiting consistent and independent association with SLE (Pmeta = 7.5×10−11, OR = 1.24 [1.18–1.34]). The risk G allele was associated with significantly increased levels of TLR7 mRNA and protein in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and elevated luciferase activity of reporter gene in transfected cells. TLR7 3′UTR sequence bearing the non-risk C allele of rs3853839 matches a predicted binding site of microRNA-3148 (miR-3148), suggesting that this microRNA may regulate TLR7 expression. Indeed, miR-3148 levels were inversely correlated with TLR7 transcript levels in PBMCs from SLE patients and controls (R2 = 0.255, P = 0.001). Overexpression of miR-3148 in HEK-293 cells led to significant dose-dependent decrease in luciferase activity for construct driven by TLR7 3′UTR segment bearing the C allele (P = 0.0003). Compared with the G-allele construct, the C-allele construct showed greater than two-fold reduction of luciferase activity in the presence of miR-3148. Reduced modulation by miR-3148 conferred slower degradation of the risk G-allele containing TLR7 transcripts, resulting in elevated levels of gene products. These data establish rs3853839 of TLR7 as a shared risk variant of SLE in 22,613 subjects of Asian, EA, AA, and Amerindian/Hispanic ancestries (Pmeta = 2.0×10−19, OR = 1.25 [1.20–1.32]), which confers allelic effect on transcript turnover via differential binding to the epigenetic factor miR-3148.

Análisis del gen adra2a receptor alfa 2a adrenergico en pacientes con trastorno de hiperactividad y déficit de atención

El trastorno de hiperactividad y déficit de atención (THDA), es definido clínicamente como una alteración en el comportamiento, caracterizada por inatención, hiperactividad e impulsividad. Estos aspectos son clasificados en tres subtipos, que son: Inatento, hiperactivo impulsivo y mixto. Clínicamente se describe un espectro amplio que incluye desordenes académicos, trastornos de aprendizaje, déficit cognitivo, trastornos de conducta, personalidad antisocial, pobres relaciones interpersonales y aumento de la ansiedad, que pueden continuar hasta la adultez. A nivel global se ha estimado una prevalencia entre el 1% y el 22%, con amplias variaciones, dadas por la edad, procedencia y características sociales. En Colombia, se han realizado estudios en Bogotá y Antioquia, que han permitido establecer una prevalencia del 5% y 15%, respectivamente. La causa específica no ha sido totalmente esclarecida, sin embargo se ha calculado una heredabilidad cercana al 80% en algunas poblaciones, demostrando el papel fundamental de la genética en la etiología de la enfermedad. Los factores genéticos involucrados se relacionan con cambios neuroquímicos de los sistemas dopaminérgicos, serotoninérgicos y noradrenérgicos, particularmente en los sistemas frontales subcorticales, corteza cerebral prefrontal, en las regiones ventral, medial, dorsolateral y la porción anterior del cíngulo. Basados en los datos de estudios previos que sugieren una herencia poligénica multifactorial, se han realizado esfuerzos continuos en la búsqueda de genes candidatos, a través de diferentes estrategias. Particularmente los receptores Alfa 2 adrenérgicos, se encuentran en la corteza cerebral, cumpliendo funciones de asociación, memoria y es el sitio de acción de fármacos utilizados comúnmente en el tratamiento de este trastorno, siendo esta la principal evidencia de la asociación de este receptor con el desarrollo del THDA. Hasta la fecha se han descrito más de 80 polimorfismos en el gen (ADRA2A), algunos de los cuales se han asociado con la entidad. Sin embargo, los resultados son controversiales y varían según la metodología diagnóstica empleada y la población estudiada, antecedentes y comorbilidades. Este trabajo pretende establecer si las variaciones en la secuencia codificante del gen ADRA2A, podrían relacionarse con el fenotipo del Trastorno de Hiperactividad y el Déficit de Atención.

G-protein-coupled-receptor-mediated presynaptic inhibition in the cerebellum

Throughout the central nervous system a dominant form of inhibition of neurotransmitter release from presynaptic terminals is mediated by G-protein-coupled receptors (GPCRs). Neurotransmitter release is typically induced by action potentials (APs), but can also occur spontaneously. Presynaptic inhibition by GPCRs has been associated with modulation of voltage-dependent ion channels. However, electrophysiological recordings of spontaneous, AP-independent (so-called ‘miniature’) postsynaptic events reveal an additional, important form of GPCR-mediated presynaptic inhibition, distinct from effects on ionic conductances and consistent with a direct action on the vesicle release machinery. Recent studies suggest that such miniature events might be of physiological relevance not only in signalling but also in development. In the cerebellum, neurotransmitter release onto Purkinje cells occurs by AP-dependent and AP-independent pathways. Here, I focus on inhibitory synapses between interneurons and Purkinje cells, which are subject to strong, identifiable regulation by endogenous GPCR agonists, to consider mechanisms of GPCR-mediated presynaptic inhibition.

Fas ligand-induced apoptosis is regulated by nitric oxide through the inhibition of fas receptor clustering and the nitrosylation of protein kinase Cepsilon

Apoptosis induced by the death-inducing ligand FasL (CD95L) is a major mechanism of cell death. Trophoblast cells express the Fas receptor yet survive in an environment that is rich in the ligand. We report that basal nitric oxide (NO) production is responsible for the resistance of trophoblasts to FasL-induced apoptosis. In this study we demonstrate that basal NO production resulted in the inhibition of receptor clustering following ligand binding. In addition NO also protected cells through the selective nitrosylation, and inhibition, of protein kinase Cepsilon (PKCepsilon) but not PKCalpha. In the absence of NO production PKCepsilon interacted with, and phosphorylated, the anti-apoptotic protein cFLIP. The interaction is predominantly with the short form of cFLIP and its phosphorylation reduces its recruitment to the death-inducing signaling complex (DISC) that is formed following binding of a death-inducing ligand to its receptor. Inhibition of cFLIP recruitment to the DISC leads to increased activation of caspase 8 and subsequently to apoptosis. Inhibition of PKCepsilon using siRNA significantly reversed the sensitivity to apoptosis induced by inhibition of NO synthesis suggesting that NO-mediated inhibition of PKCepsilon plays an important role in the regulation of Fas-induced apoptosis.

Domain swapping in the human histamine H-1 receptor

G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest family of receptors involved in transmembrane signaling. Although these receptors were generally believed to be monomeric entities, accumulating evidence supports the presence of GPCRs in multimeric forms. Here, using immunoprecipitation as well as time-resolved fluorescence resonance energy transfer to assess protein-protein interactions in living cells, we unambiguously demonstrate the occurrence of dimerization of the human histamine H-1 receptor. We also show the presence of domain-swapped H-1 receptor dimers in which there is the reciprocal exchange of transmembrane domain TM domains 6 and 7 between the receptors present in the dimer. Mutation of aspartate(107) in transmembrane (TM) 3 or phenylalanine(432) in TM6 to alanine results in two radioligand-binding-deficient mutant H-1 receptors. Coexpression of H-1 D(107)A and H-1 F(432)A, however, results in a reconstituted radioligand binding site that exhibits a pharmacological profile that corresponds to the wildtype H-1 receptor. Interestingly, the H-1 receptor radioligands [H-3] mepyramine and [H-3]-(-)- trans-1-phenyl-3-N, N-dimethylamino-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene show differential saturation binding values (B-max) for wild-type H-1 receptors but not for the radioligand binding site that is formed upon coexpression of H-1 D(107)A and H-1 F(432)A receptors, suggesting the presence of different H-1 receptor populations.