Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Étude numérique des premières étapes d'agrégation du peptide amyloïde GNNQQNY, impliqué dans une maladie à prion.

Les protéines amyloïdes sont impliquées dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer, Parkinson et les maladies à prions et forment des structures complexes, les fibres amyloïdes. Le mécanisme de formation de ces fibres est un processus complexe qui implique plusieurs espèces d’agrégats intermédiaires. Parmi ces espèces, des petits agrégats, les oligomères, sont reconnus comme étant l’espèce amyloïde toxique, mais leur mécanisme de toxicité et d’agrégation sont mal compris. Cette thèse présente les résultats d’une étude numérique des premières étapes d’oligomérisation d’un peptide modèle GNNQQNY, issu d’une protéine prion, pour des systèmes allant du trimère au 50-mère, par le biais de simulations de dynamique moléculaire couplée au potentiel gros-grain OPEP. Nous trouvons que le mécanisme d’agrégation du peptide GNNQQNY suit un processus complexe de nucléation, tel qu’observé expérimentalement pour plusieurs protéines amyloïdes. Nous observons aussi que plusieurs chemins de formation sont accessibles à l’échelle du 20-mère et du 50-mère, ce qui confère aux structures un certain degré de polymorphisme et nous sommes capable de reproduire, dans nos simulations, des oligomères protofibrillaires qui présentent des caractéristiques structurelles observées expérimentalement chez les fibres amyloïdes.

Méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides: application à la synthèse d’analogues aza-GHRP-6 en tant que ligands du récepteur CD36

Les azapeptides sont des mimes peptidiques où le carbone alpha d’un ou de plusieurs acides aminés est remplacé par un atome d’azote. Cette modification tend à stabiliser une conformation en repliement beta en raison de la répulsion électronique entre les paires d’électrons libres des atomes d’azote adjacents et de la géométrie plane de l’urée. De plus, le résidu semicarbazide a une meilleure résistance face aux protéases en plus d’être chimiquement plus stable qu’une liaison amide. Bien que les propriétés des azapeptides en fassent des mimes peptidiques intéressants, leurs méthodes de synthèses font appel à la synthèse laborieuse d’hydrazines substituées en solution. Le peptide sécréteur d’hormone de croissance 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) est un hexapeptide synthétique qui possède une affinité pour deux récepteurs distincts: les récepteurs GHS-R1a et CD36. Les travaux effectués au cours de mon doctorat qui seront détaillés dans cet ouvrage visent à atteindre deux objectifs: (1) le développement d’analogues du peptide GHRP-6 sélectif à un seul récepteur et (2) la mise au point d’une nouvelle méthodologie pour la synthèse combinatoire d’azapeptides. En réponse au premier objectif, la synthèse parallèle de 49 analogues aza-GHRP-6 a été effectuée et certains candidats sélectifs au récepteur CD36 ont été identifiés. L’étude de leurs propriétés anti-angiogéniques, effectuée par nos collaborateurs, a également permis d’identifier des candidats intéressants pour le traitement potentiel de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une nouvelle approche pour la synthèse combinatoire d’azapeptides, faisant appel à l’alkylation et la déprotection chimiosélective d’une sous-unité semicarbazone ancrée sur support solide, a ensuite été développée. La portée de cette méthodologie a été augmentée par la découverte de conditions permettant l’arylation régiosélective de cette sous-unité semicarbazone, donnant accès à treize nouveaux dérivés aza-GHRP-6 possédant des résidus aza-arylglycines aux positions D-Trp2 et Trp4. L’élaboration de conditions propices à l’alkylation et la déprotection chimiosélective de la semicarbazone a donné accès à une variété de chaînes latérales sur l’acide aminé « aza » préalablement inaccessibles. Nous avons, entre autres, démontré qu’une chaîne latérale propargyl pouvait être incorporée sur l’acide aminé « aza ». Tenant compte de la réactivité des alcynes, nous avons ensuite élaboré des conditions réactionnelles permettant la formation in situ d’azotures aromatiques, suivie d’une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur support solide, dans le but d’obtenir des mimes de tryptophane. Sept analogues du GHRP-6 ont été synthétisés et testés pour affinité au récepteur CD36 par nos collaborateurs. De plus, nous avons effectué une réaction de couplage en solution entre un dipeptide possédant un résidu aza-propargylglycine, du paraformaldehyde et une variété d’amines secondaires (couplage A3) afin d’accéder à des mimes rigides d’aza-lysine. Ces sous-unités ont ensuite été incorporées sur support solide afin de générer sept nouveaux azapeptides avec des dérivés aza-lysine à la position Trp4 du GHRP-6. Enfin, une réaction de cyclisation 5-exo-dig a été développée pour la synthèse de N-amino imidazolin-2-ones en tant que nouveaux mimes peptidiques. Leur fonctionnalisation par une série de groupements benzyliques à la position 4 de l’hétérocycle a été rendue possible grâce à un couplage Sonogashira précédant la réaction de cyclisation. Les propriétés conformationnelles de cette nouvelle famille de composés ont été étudiées par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN d’un tétrapeptide modèle. L’activité biologique de deux mimes peptidiques, possédant un résidu N-amino-4-méthyl- et 4-benzyl-imidazolin-2-one à la position Trp4 du GHRP-6, a aussi été examinée. L’ensemble de ces travaux devrait contribuer à l’avancement des connaissances au niveau des facteurs structurels et conformationnels requis pour le développement d’azapeptides en tant que ligands du récepteur CD36. De plus, les résultats obtenus devraient encourager davantage l’utilisation d’azapeptides comme peptidomimétiques grâce à leur nouvelle facilité de synthèse et la diversité grandissante au niveau de la chaîne latérale des acides aminés « aza ».

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Implication du peptide ScRALF3 dans le développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense

La coordination du développement par les communications intercellulaires est essentielle pour assurer la reproduction chez les plantes. Plusieurs études démontrent qu’une communication entre le sac embryonnaire et le tissu maternel, le sporophyte, est essentielle au bon développement des gamètes. Les molécules, peptides ou autres protagonistes impliqués dans ces voies de signalisation ainsi que leur mode d’action restent toutefois nébuleux. Les gènes de type RALF codent pour des petits peptides sécrétés retrouvés de manière spécifique ou ubiquitaire dans la plante. Leur structure en font de parfaits candidats pour permettre ces communications cellule-cellule entre les différents tissus. Treize gènes de type RALF ont été isolés actuellement chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Maintenant, nous montrons qu’un de ceux-ci, ScRALF3, est impliqué dans la polarisation du sac embryonnaire et dans la synchronicité des divisions mitotiques assurant la formation d’un gamétophyte femelle mature fonctionnel. Étant exprimé de manière spécifique au niveau des téguments de l’ovule, ScRALF3 est un candidat idéal pour réguler les communications cellule-cellule entre le sporophyte et le sac embryonnaire.

Enforcing dendritic cell vaccines by manipulating the MHC II antigen presentation pathway

Les vaccins à base de cellules dendritiques (DCs) constituent une avenue très populaire en immunothérapie du cancer. Alors que ces cellules peuvent présenter des peptides exogènes ajoutés au milieu, l’efficacité de chargement de ces peptides au le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II est limitée. En effet, la majorité des molécules du CMH II à la surface des DCs sont très stable et l’échange de peptide spontané est minime. Confinée aux vésicules endosomales, HLA-DM (DM) retire les peptides des molécules du CMH II en plus de leur accorder une conformation réceptive au chargement de peptides. Il est possible, cependant, de muter le signal de rétention de DM de façon à ce que la protéine s’accumule en surface. Nous avons émis l’hypothèse que ce mutant de DM (DMY) sera aussi fonctionnel à la surface que dans la voie endosomale et qu’il favorisera le chargement de peptides exogènes aux DCs. Nous avons utilisé un vecteur adénoviral pour exprimer DMY dans des DCs et avons montrer que la molécule augmente le chargement de peptides. L’augmentation du chargement peptidique par DMY est autant qualitatif que quantitatif. DMY améliore la réponse T auxiliaire (Th) du coté Th1, ce qui favorise l’immunité anti-cancer. Du côté qualitatif, le chargement de peptides résulte en des complexes peptide-CMHII (pCMH) d’une conformation supérieure (conformère). Ce conformère (Type A) est le préféré pour la vaccination et DMY édite avec succès les complexes pCMH à la surface en éliminant ceux de type B, lesquels sont indésirables. La fonction de DM est régulée par HLA-DO (DO). Ce dernier inhibe l’habilité de DM à échanger le peptide CLIP (peptide dérivée de la chaîne invariante) en fonction du pH, donc dans les endosomes tardifs. Mes résultats indiquent que la surexpression de DO influence la présentation des superantigènes (SAgs) dépendants de la nature du peptide. Il est probable que DO améliore indirectement la liaison de ces SAgs au pCMH dû à l’accumulation de complexe CLIP-CMH, d’autant plus qu’il neutralise la polarisation Th2 normalement observée par CLIP. Ensemble, ces résultats indiquent que DMY est un outil intéressant pour renforcer le chargement de peptides exogènes sur les DCs et ainsi générer des vaccins efficaces. Un effet inattendu de DO sur la présentation de certains SAgs a aussi été observé. Davantage de recherche est nécessaire afin de résoudre comment DMY et DO influence la polarisation des lymphocytes T auxiliaires. Cela conduira à une meilleure compréhension de la présentation antigénique et de son étroite collaboration avec le système immunitaire.

Le rôle et la régulation du pyroglutamylated RF-amide peptide dans le tissu adipeux lors de l’obésité

L’obésité est définie comme un surplus de masse adipeuse. Cette condition représente un problème de santé publique devenu pandémique dans les pays industrialisés. Elle prédispose à des maladies potentiellement mortelles comme le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique non-alcoolique. L’accumulation du tissu adipeux intra-abdominal, formé d’adipocytes, est corrélée avec la résistance à l’insuline. L’augmentation de la masse adipeuse se fait par l’hyperplasie des préadipocytes, la différenciation des préadipocytes en adipocytes et l’hypertrophie des adipocytes. La différenciation des préadipocytes se fait selon l’adipogenèse qui est régulée par une multitude de facteurs, mais qui est inhibée pas les stimuli inflammatoires qui sont aussi responsables de la résistance à l’insuline et de l’apparition des problèmes de santé liés à l’obésité. Nous avons identifié un nouveau système de régulation autocrine/paracrine de l’adipogenèse dans les cellules du tissu adipeux. Le pyroglutamylated RF-amide peptide (QRFP), qui était connu pour son rôle dans la régulation de l’appétit, est un activateur de l’adipogenèse par l’activation de son récepteur, le G protein-coupled receptor 103 (GPR103). Le QRFP est exprimé dans les macrophages et les adipocytes alors que le GPR103 de sous-type b est exprimé dans les adipocytes seulement. Un traitement des adipocytes avec le QRFP augmente le captage des acides gras, l’accumulation de lipides ainsi que l’expression et l’activité de l’enzyme LPL. Le QRFP augmente aussi l’expression des gènes des transporteurs d’acides gras CD36 et FATP1, de l’enzyme activatrice d’acides gras ACSL1 et des facteurs de transcription PPAR-γ et C/EBP-α, qui sont tous impliqués dans l’adipogenèse. En plus de ses effets sur l’adipogenèse, le QRFP possède aussi un effet inhibiteur sur l’activité lipolytique induite par les catécholamines. Nous avons montré que l’expression du QRFP est diminuée dans le tissu adipeux des souris obèses. Selon nos résultats, cette diminution pourrait être expliquée par une augmentation des endotoxines circulantes chez les obèses, appelée endotoxémie métabolique, qui agirait, entre autres, par l’induction des interférons dans les macrophages. Les voies de signalisation de ces effets ont aussi été identifiées. Nous avons montré un autre exemple de stimulus inflammatoire qui régule les signaux adipogènes à la baisse.

Impact de l’expression de l’isoforme p35 de la chaîne invariante humaine chez des souris déficientes en CD74 endogène

La chaîne invariante (Ii ; CD74) est une protéine membranaire de type II qui joue un rôle majeur dans la présentation antigénique. Dans le réticulum endoplasmique (RE), Ii favorise l’assemblage du CMH II et prévient la liaison indésirable de polypeptides. Grâce à son motif di-leucine, la chaîne invariante cible le CMH II dans les endosomes. Une fois dans ces compartiments acides, Ii est dégradé, permettant la liaison de peptides de forte affinité qui seront ensuite présentés aux cellules T CD4+. Chez les souris déficientes en Ii murin (mIi), le CMH II présente une conformation non compacte typique des molécules vides ou liées faiblement à un peptide. Le transport du CMH II est aberrant ce qui conduit à une réduction de son expression en surface ainsi qu’à un défaut de présentation antigénique. De plus, Ii diversifie le répertoire de peptides et assure la sélection thymique des cellules T CD4+. Enfin, il a un rôle dans la maturation des cellules B et les souris déficientes en Ii présentent des nombres réduits de cellules B matures folliculaires (FO). L’isoforme mineure humaine p35 (Iip35) n’existe pas chez la souris et possède une extension cytoplasmique de 16 acides aminés contenant un motif R-x-R de rétention dans le RE. La sortie du RE est conditionnelle à la liaison du CMH II qui permet de masquer le motif de rétention. Iip35 agit comme dominant et impose la rétention aux autres isoformes d’Ii. Cependant, le rôle physiologique du motif R-x-R et, plus globalement, celui d’Iip35, demeurent nébuleux. Pour mieux cerner la fonction d’Iip35, nous avons généré des souris transgéniques (Tg) exprimant l’isoforme humaine Iip35 et avons analysé la conformation et le trafic du CMH II, la sélection thymique et la maturation des cellules B ainsi que la présentation antigénique. Nos résultats ont démontré qu’Iip35 favorise l’assemblage du CMH II dans le RE. Il induit également une conformation compacte du CMH II et augmente l’expression du CMH II en surface. De plus, Iip35 cible le CMH II dans les endosomes où un peptide de forte affinité se lie dans la niche peptidique. Par ailleurs, Iip35 diversifie le répertoire de peptides et rétablit totalement la sélection des cellules T CD4+ ainsi que le niveau d’expression du TCR de ces dernières. Iip35 restaure également la présentation antigénique de l’ovalbumine dont la présentation requiert l’expression d’Ii. Par contre, Iip35 rétablit la présentation des superantigènes mais à un niveau moindre que celui des souris sauvages. Ensuite, Iip35 permet le rétablissement de la sélection des cellules iNKT démontrant qu’il assiste la présentation des lipides par les molécules CD1d. Enfin, les résultats ont démontré qu’Iip35 restaure le développement des cellules B matures folliculaires (FO) mais pas celui des cellules B de la zone marginale. Ceci suggère qu’Iip35 est capable d’induire le développement des cellules FO sans stimulation préalable par le MIF (macrophage migration inhibitory factor). Ainsi, l’ensemble de ces résultats démontre qu’Iip35 est fonctionnel et assure la majorité des fonctions d’Ii. Cependant, Iip35 ne remplace pas mIi endogène concernant la maturation des cellules B MZ suggérant qu’il pourrait avoir un rôle de régulateur.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

A study of chymotrypsin immobilization conditions for improved peptide mapping

La cartographie peptidique est une technique de grande importance utilisée lors de l’identification des protéines et la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines. Deux méthodes sont utilisées afin de couper les protéines en peptides pour la cartographie : les méthodes chimiques et les méthodes enzymatiques. Dans ce projet, l’enzyme chymotrypsine a été utilisée pour l’hydrolyse (la digestion) des liens peptidiques. Cependant, l’autoprotéolyse des enzymes peut augmenter la complexité des échantillons, rendant ainsi ardue l’obtention de pics résolus suite à l’apparition de pics non-désirés dans la carte peptidique. Par conséquent, nous avons utilisé la réticulation des enzymes protéolytiques par réaction avec le glutaraldéhyde (GA) donnant une enzyme insoluble afin de réduire l’autoprotéolyse. L’immobilisation de la chymotrypsine par GA a été effectuée selon une méthode rapportée précédemment par le groupe Waldron. L’électrophorèse capillaire (CE) couplée à l’absorption UV-visible a été utilisée pour la séparation et la détection de peptides et pour obtenir ainsi une cartographie peptidique. Deux tampons différents ont été évalués afin d’obtenir les meilleures conditions pour la digestion de substrats protéiques par la chymotrypsine libre (soluble) ou la GAchymotrypsine et l’analyse par CE. Les cartes des peptides autoprotéolytiques ont été comparées entre les deux formats de chymotrypsine. Afin d’améliorer la cartographie peptidique, nous avons évalué trois méthodes de conditionnement du capillaire CE et deux méthodes pour stopper la digestion. Le bicarbonate d’ammonium s’est avéré être le tampon optimal pour la digestion en solution et l’utilisation d’un bain d’acétone et de glace sèche s’est avérée être la méthode optimale pour stopper la digestion. Une solution de SDS, 25 mM, dans l’étape de rinçage a été utilisée après chaque analyse CE et a permis d’améliorer la résolution des cartes peptidiques. La comparaison entre l’autoprotéolyse de la chymotrypsine libre et de celle immobilisé par GA a été effectuée par des tests utilisant une gamme de six différentes combinaisons de conditions afin d’évaluer le temps (30 et 240 min) et la température de digestion (4, 24 et 37°C). Dans ces conditions, nos résultats ont confirmé que le GA-chymotrypsine réduit l’autoprotéolyse par rapport à l’enzyme libre. La digestion (à 37°C/240 min) de deux substrats modèles par la chymotrypsine libre et immobilisée en fonction de la température de dénaturation du substrat a été étudiée. iii Avant la digestion, les substrats (l’albumine de sérum bovine, BSA, et la myoglobine) ont été dénaturés par chauffage pendant 45 min à trois températures différentes (60, 75 et 90°C). Les résultats ont démontré que la dénaturation par chauffage du BSA et de la myoglobine n’a pas amélioré la cartographie peptidique pour la GA-chymotrypsine, tandis que la digestion de ceux-ci en présence de la chymotrypsine libre a amélioré de façon quantifiable à des températures élevées. Ainsi, le chauffage du substrat à 90°C avec l’enzyme soluble facilite le dépliement partiel du substrat et sa digestion limitée, ce qui a été mieux pour la myoglobine que pour la BSA.

Synthesis of polyelectrolyte brushes on silica-based substrates through surface-initiated polymerization : brush characterization and responsiveness to variation in pH and ionic strength

Les brosses de polyélectrolytes font l’objet d’une attention particulière pour de nombreuses applications car elles présentent la capacité de changer de conformation et, par conséquent, de propriétés de surface en réponse aux conditions environnementales appliquées. Le contrôle des principaux paramètres de ces brosses telles que l'épaisseur, la composition et l'architecture macromoléculaire, est essentiel pour obtenir des polymères greffés bien définis. Ceci est possible avec la Polymérisation Radicalaire par Transfert d’Atomes - Initiée à partir de la Surface (PRTA-IS), qui permet la synthèse de brosses polymériques de manière contrôlée à partir d’une couche d'amorceurs immobilisés de manière covalente sur une surface. Le premier exemple d’une synthèse directe de brosses de poly(acide acrylique) (PAA) par polymérisation radicalaire dans l’eau a été démontré. Par greffage d’un marqueur fluorescent aux brosses de PAA et via l’utilisation de la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, le dégreffage du PAA en temps réel a pu être investigué. Des conditions environnementales de pH ≥ 9,5 en présence de sel, se sont avérées critiques pour la stabilité de la liaison substrat-amorceur, conduisant au dégreffage du polymère. Afin de protéger de l’hydrolyse cette liaison substrat-amorceur sensible et prévenir le dégreffage non souhaité du polymère, un espaceur hydrophobique de polystyrène (PS) a été inséré entre l'amorceur et le bloc de PAA stimuli-répondant. Les brosses de PS-PAA obtenues étaient stables pour des conditions extrêmes de pH et de force ionique. La réponse de ces brosses de copolymère bloc a été étudiée in situ par ellipsométrie, et le changement réversible de conformation collapsée à étirée, induit par les variations de pH a été démontré. De plus, des différences de conformation provenant des interactions du bloc de PAA avec des ions métalliques de valence variable ont été obtenues. Le copolymère bloc étudié semble donc prometteur pour la conception de matériaux répondant rapidement a divers stimuli. Par la suite, il a été démontré qu’un acide phosphonique pouvait être employé en tant qu’ amorceur PRTA-IS comme alternative aux organosilanes. Cet amorceur phosphonate a été greffé pour la première fois avec succès sur des substrats de silice et une PRTA-IS en milieux aqueux a permis la synthèse de brosses de PAA et de poly(sulfopropyl méthacrylate). La résistance accrue à l’hydrolyse de la liaison Sisubstrat-O- Pamorceur a été confirmée pour une large gamme de pH 7,5 à 10,5 et a permis l’étude des propriétés de friction des brosses de PAA sous différentes conditions expérimentales par mesure de forces de surface. Malgré la stabilité des brosses de PAA à haute charge appliquée, les études des propriétés de friction ne révèlent pas de changement significatif du coefficient de friction en fonction du pH et de la force ionique.

Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry

In recent years, we observed a significant increase of food fraud ranging from false label claims to the use of additives and fillers to increase profitability. Recently in 2013, horse and pig DNA were detected in beef products sold from several retailers. Mass spectrometry has become the workhorse in protein research and the detection of marker proteins could serve for both animal species and tissue authentication. Meat species authenticity will be performed using a well defined proteogenomic annotation, carefully chosen surrogate tryptic peptides and analysis using a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. Selected mammalian meat samples were homogenized, proteins were extracted and digested with trypsin. The samples were analyzed using a high-resolution mass spectrometer. The chromatography was achieved using a 30 minutes linear gradient along with a BioBasic C8 100 × 1 mm column at a flow rate of 75 µL/min. The mass spectrometer was operated in full-scan high resolution and accurate mass. MS/MS spectra were collected for selected proteotypic peptides. Muscular proteins were methodically analyzed in silico in order to generate tryptic peptide mass lists and theoretical MS/MS spectra. Following a comprehensive bottom-up proteomic analysis, we were able to detect and identify a proteotypic myoglobin tryptic peptide [120-134] for each species with observed m/z below 1.3 ppm compared to theoretical values. Moreover, proteotypic peptides from myosin-1, myosin-2 and -hemoglobin were also identified. This targeted method allowed a comprehensive meat speciation down to 1% (w/w) of undesired product.

Caractérisation du rôle de l’amyline (IAPP) dans le diabète de type 2 : études de dérivés peptidiques et de composés inhibiteurs de la formation d’amyloïde

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement.

Characterization of glutaraldehyde-immobilized chymotrypsin and an in-situ immobilized enzyme reactor using capillary electrophoresis-based peptide mapping

La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée.

Développement d’outils analytiques pour la détection de biomolécules directement dans des fluides sanguins

Cette thèse porte sur le développement de biocapteurs basés sur la technique de résonance des plasmons de surface (SPR) pour effectuer des analyses directement dans un fluide sanguin n’ayant subi aucune purification ou dilution. L’ensemble des biocapteurs discutés exploiteront un instrument SPR portable développé dans le groupe du professeur Masson. Le premier volet de la thèse portera sur le processus d’interférence lié à l’adsorption non spécifique du sérum à la surface du capteur. L’analyse des biomolécules adsorbées sera effectuée en combinant la SPR à la spectrométrie de masse. Les informations obtenues seront exploitées pour la construction de biocapteurs adaptés à l’analyse en milieu sanguin. Un premier biocapteur développé ciblera la protéine antigène prostatique spécifique (APS) contenue dans le sérum servant de biomarqueur pour dépister le cancer de la prostate. Pour détecter les faibles concentrations de cette protéine directement dans le sérum, un matériel plasmonique microstructuré sera utilisé pour amplifier les signaux obtenus et sera recouvert d’une monocouche peptidique minimisant l’adsorption non spécifique du sérum. L’instrument SPR aura été adapté pour permettre également la détection simultanée de fluorescence. Un test ELISA sera ainsi effectué en parallèle du test SPR. Chacune des techniques fournira un contrôle pour la deuxième, tout en permettant de détecter le biomarqueur au niveau requis pour dépister la maladie. La combinaison des deux méthodes permettra aussi d’élargir la gamme dynamique du test de dépistage. Pour terminer, l’instrument SPR portable sera utilisé dans le cadre de détection de petites biomolécules ayant un potentiel thérapeutique directement dans un échantillon de sang. Des peptides ayant une activité anti-athérosclérotique pourront ainsi être détectés à même un échantillon de sang ni purifié ni dilué, et ce à des concentrations de l’ordre du micromolaire. Une modification de la microfluidique via l’introduction d’une membrane poreuse au cœur de celle-ci sera la clé permettant d’effectuer de telles analyses. La présente thèse met de l’avant de nouvelles stratégies et des modifications instrumentales permettant d’analyser des protéines et des petites molécules directement dans un échantillon non purifié de sérum ou de sang. Les modifications apportées au système fluidique, à l’instrument SPR et au niveau du biocapteur employé permettront d’effectuer des biodétections dans des matrices aussi complexes que les fluides sanguins. Les présents travaux mettent en lumière la capacité d’un instrument SPR/fluorescence portable à faire en 12 minutes la biodétection d’un marqueur du cancer de la prostate directement dans un échantillon de sérum. Finalement, on rapporte ici un des premiers articles où un biocapteur SPR est utilisé à même un échantillon de sang non-purifié pour faire des biodétections.