Transient and Pulsed Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy on Type I Photosynthetic Reaction Centers

Two time-resolved EPR techniques, have been used to study the light induced electron transfer(ET) in Type I photosynthetic reaction centers(RCs). First, pulsed EPR was used to compare PsaA-M688H and PsaB-M668H mutants of Chlamydomonas reinhardtii and Synechosystis sp. PCC 6803.The out-of-phase echo modulation curves combined with other EPR and optical data show that the effect of the mutations is species dependent. Second, transient and pulsed EPR data are presented which show that PsaA-A660N and PsaB-A640N mutations in C. reinhardtii alter the relative quantum yield of ET in the A- and B-branches of PS I. Third, transient EPR studies on RCs from Heliobacillus mobilis that have been exposed to oxygen show partial inhibition of ET. In the RCs in which ET still occurs, the ET kinetics and EPR spectra show evidence of oxidation of some but not all of the, BChl g and BChl g' to Chl a.

Electron Transfer Involving the Phylloquinone (A1) Cofactor of Photosystem I Examined with Time Resolved Absorbance and Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

The dependence of the electron transfer (ET) rate on the Photosystem I (PSI) cofactor phylloquinone (A1) is studied by time-resolved absorbance and electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. Two active branches (A and B) of electron transfer converge to the FX cofactor from the A1A and A1B quinone. The work described in Chapter 5 investigates the single hydrogen bond from the amino acid residue PsaA-L722 backbone nitrogen to A1A for its effect on the electron transfer rate to FX. Room temperature transient EPR measurements show an increase in the rate for the A1A- to FX for the PsaA-L722T mutant and an increased hyperfine coupling to the 2-methyl group of A1A when compared to wild type. The Arrhenius plot of the A1A- to FX ET in the PsaA-L722T mutant suggests that the increased rate is probably the result of a slight change in the electronic coupling between A1A- and FX. The reasons for the non-Arrhenius behavior are discussed. The work discussed in Chapter 6 investigates the directionality of ET at low temperature by blocking ET to the iron-sulfur clusters FX, FA and FB in the menB deletion mutant strain of Synechocyctis sp. PCC 6803, which is unable to synthesize phylloquinone, by incorporating the high midpoint potential (49 mV vs SHE) 2,3-dichloro-1,4-naphthoquinone (Cl2NQ) into the A1A and A1B binding sites. Various EPR spectroscopic techniques were implemented to differentiate between the spectral features created from A and B- branch electron transfer. The implications of this result for the directionality of electron transfer in PS I are discussed. The work discussed in Chapter 7 was done to study the dependence of the heterogeneous ET at low temperature on A1 midpoint potential. The menB PSI mutant contains plastiquinone-9 in the A1 binding site. The solution midpoint potential of the quinone measures 100 mV more positive then wild-type phylloquinone. The irreversible ET to the terminal acceptors FA and FB at low temperature is not controlled by the forward step from A1 to FX as expected due to the thermodynamic differences of the A1 cofactor in the two active branches A and B. Alternatives for the ET heterogeneity are discussed.

(A) Photoregulation of DNA Functions by Cyclic Azobenzene-tethered Oligonucleotides (B) Site-specific Fluorescent Labeling of DNA using Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction between trans-Cyclooctene Derivatives and BODIPY-Tetrazine Adducts

(A) Most azobenzene-based photoswitches require UV light for photoisomerization, which limit their applications in biological systems due to possible photodamage. Cyclic azobenzene derivatives, on the other hand, can undergo cis-trans isomerization when exposed to visible light. A shortened synthetic scheme was developed for the preparation of a building block containing cyclic azobenzene and D-threoninol (cAB-Thr). trans-Cyclic azobenzene was found to thermally isomerize back to the cis-form in a temperature-dependent manner. cAB-Thr was transformed into the corresponding phosphoramidite and subsequently incorporated into oligonucleotides by solid phase synthesis. Melting temperature measurement suggested that incorporation of cis-cAB into oligonucleotides destabilizes DNA duplexes, these findings corroborate with circular dichroism measurement. Finally, Fluorescent Energy Resonance Transfer experiments indicated that trans-cAB can be accommodated in DNA duplexes. (B) Inverse Electron Demand Diels-Alder reactions (IEDDA) between trans-olefins and tetrazines provide a powerful alternative to existing ligation chemistries due to its fast reaction rate, bioorthogonality and mutual orthogonality with other click reactions. In this project, an attempt was pursued to synthesize trans-cyclooctene building blocks for oligonucleotide labeling by reacting with BODIPY-tetrazine. Rel-(1R-4E-pR)-cyclooct-4-enol and rel-(1R,8S,9S,4E)-Bicyclo[6.1.0]non-4-ene-9-ylmethanol were synthesized and then transformed into the corresponding propargyl ether. Subsequent Sonogashira reactions between these propargylated compounds with DMT-protected 5-iododeoxyuridine failed to give the desired products. Finally a methodology was pursued for the synthesis of BODIPY-tetrazine conjugates that will be used in future IEDDA reactions with trans-cyclooctene modified oligonucleotides.

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Étude des artefacts en tomodensitométrie par simulation Monte Carlo

En radiothérapie, la tomodensitométrie (CT) fournit l’information anatomique du patient utile au calcul de dose durant la planification de traitement. Afin de considérer la composition hétérogène des tissus, des techniques de calcul telles que la méthode Monte Carlo sont nécessaires pour calculer la dose de manière exacte. L’importation des images CT dans un tel calcul exige que chaque voxel exprimé en unité Hounsfield (HU) soit converti en une valeur physique telle que la densité électronique (ED). Cette conversion est habituellement effectuée à l’aide d’une courbe d’étalonnage HU-ED. Une anomalie ou artefact qui apparaît dans une image CT avant l’étalonnage est susceptible d’assigner un mauvais tissu à un voxel. Ces erreurs peuvent causer une perte cruciale de fiabilité du calcul de dose. Ce travail vise à attribuer une valeur exacte aux voxels d’images CT afin d’assurer la fiabilité des calculs de dose durant la planification de traitement en radiothérapie. Pour y parvenir, une étude est réalisée sur les artefacts qui sont reproduits par simulation Monte Carlo. Pour réduire le temps de calcul, les simulations sont parallélisées et transposées sur un superordinateur. Une étude de sensibilité des nombres HU en présence d’artefacts est ensuite réalisée par une analyse statistique des histogrammes. À l’origine de nombreux artefacts, le durcissement de faisceau est étudié davantage. Une revue sur l’état de l’art en matière de correction du durcissement de faisceau est présentée suivi d’une démonstration explicite d’une correction empirique.

Méthode efficace d'assignation de tissus humains par tomodensitométrie à double énergie

Pour analyser les images en tomodensitométrie, une méthode stœchiométrique est gé- néralement utilisée. Une courbe relie les unités Hounsfield d’une image à la densité électronique du milieu. La tomodensitométrie à double énergie permet d’obtenir des informations supplémentaires sur ces images. Une méthode stœchiométrique a été dé- veloppée pour permettre de déterminer les valeurs de densité électronique et de numéro atomique effectif à partir d’une paire d’images d’un tomodensitomètre à double énergie. Le but de cette recherche est de développer une nouvelle méthode d’identification de tissus en utilisant ces paramètres extraits en tomodensitométrie à double énergie. Cette nouvelle méthode est comparée avec la méthode standard de tomodensitométrie à simple énergie. Par ailleurs, l’impact dosimétrique de bien identifier un tissu est déterminé. Des simulations Monte Carlo permettent d’utiliser des fantômes numériques dont tous les paramètres sont connus. Les différents fantômes utilisés permettent d’étalonner les méthodes stœchiométriques, de comparer la polyvalence et la robustesse des méthodes d’identification de tissus double énergie et simple énergie, ainsi que de comparer les distributions de dose dans des fantômes uniformes de mêmes densités, mais de compo- sitions différentes. La méthode utilisant la tomodensitométrie à double énergie fournit des valeurs de densi- tés électroniques plus exactes, quelles que soient les conditions étudiées. Cette méthode s’avère également plus robuste aux variations de densité des tissus. L’impact dosimé- trique d’une bonne identification de tissus devient important pour des traitements aux énergies plus faibles, donc aux énergies d’imagerie et de curiethérapie.

Semiautomated 3D liver segmentation using computed tomography and magnetic resonance imaging

Le foie est un organe vital ayant une capacité de régénération exceptionnelle et un rôle crucial dans le fonctionnement de l’organisme. L’évaluation du volume du foie est un outil important pouvant être utilisé comme marqueur biologique de sévérité de maladies hépatiques. La volumétrie du foie est indiquée avant les hépatectomies majeures, l’embolisation de la veine porte et la transplantation. La méthode la plus répandue sur la base d'examens de tomodensitométrie (TDM) et d'imagerie par résonance magnétique (IRM) consiste à délimiter le contour du foie sur plusieurs coupes consécutives, un processus appelé la «segmentation». Nous présentons la conception et la stratégie de validation pour une méthode de segmentation semi-automatisée développée à notre institution. Notre méthode représente une approche basée sur un modèle utilisant l’interpolation variationnelle de forme ainsi que l’optimisation de maillages de Laplace. La méthode a été conçue afin d’être compatible avec la TDM ainsi que l' IRM. Nous avons évalué la répétabilité, la fiabilité ainsi que l’efficacité de notre méthode semi-automatisée de segmentation avec deux études transversales conçues rétrospectivement. Les résultats de nos études de validation suggèrent que la méthode de segmentation confère une fiabilité et répétabilité comparables à la segmentation manuelle. De plus, cette méthode diminue de façon significative le temps d’interaction, la rendant ainsi adaptée à la pratique clinique courante. D’autres études pourraient incorporer la volumétrie afin de déterminer des marqueurs biologiques de maladie hépatique basés sur le volume tels que la présence de stéatose, de fer, ou encore la mesure de fibrose par unité de volume.

Applying scanning electron microscopy for the ultrastructural and clinical analysis of periprosthetic capsules in implant-based breast reconstruction

La reconstruction en deux étapes par expanseur et implant est la technique la plus répandue pour la reconstruction mammmaire post mastectomie. La formation d’une capsule périprothétique est une réponse physiologique universelle à tout corps étranger présent dans le corps humain; par contre, la formation d’une capsule pathologique mène souvent à des complications et par conséquent à des résultats esthétiques sous-optimaux. Le microscope électronique à balayage (MEB) est un outil puissant qui permet d’effectuer une évaluation sans pareille de la topographie ultrastructurelle de spécimens. Le premier objectif de cette thèse est de comparer le MEB conventionnel (Hi-Vac) à une technologie plus récente, soit le MEB environnemental (ESEM), afin de déterminer si cette dernière mène à une évaluation supérieure des tissus capsulaires du sein. Le deuxième objectif est d‘appliquer la modalité de MEB supérieure et d’étudier les modifications ultrastructurelles des capsules périprothétiques chez les femmes subissant différents protocoles d’expansion de tissus dans le contexte de reconstruction mammaire prothétique. Deux études prospectives ont été réalisées afin de répondre à nos objectifs de recherche. Dix patientes ont été incluses dans la première, et 48 dans la seconde. La modalité Hi-Vac s’est avérée supérieure pour l’analyse compréhensive de tissus capsulaires mammaires. En employant le mode Hi-Vac dans notre protocole de recherche établi, un relief 3-D plus prononcé à été observé autour des expanseurs BIOCELL® dans le groupe d’approche d’intervention retardée (6 semaines). Des changements significatifs n’ont pas été observés au niveau des capsules SILTEX® dans les groupes d’approche d’intervention précoce (2 semaines) ni retardée.

Enhancement of Diffraction Efficiency and Storage Life of Poly (Vinyl Chloride) Based Optical Recording Medium with the Incorporation of an Electron Donor

The differaction efficiency,sensitivity and storage life of Methylene Blue sencitized poly (vinyl chloride) film was improved by the addition of an electron donor in the matrix. The addition of pyridine enhanced the diffraction efficiency by two times and storage life of the gratings was increased to 2-3 days.

Enhancement of Diffraction Efficiency and Storage Life of Poly (Vinyl Chloride) Based Optical Recording Medium with the Incorporation of an Electron Donor

The differaction efficiency,sensitivity and storage life of Methylene blue sensitized poly(vinyl chloride) film was improved by the addition of an electron donor in the matrix. The addition of pyridine enhanced the diffraction efficiency by two times and storage life of the gratings was increased to 2-3 days.