Efeitos tardios no tecido ovariano de ratas Wistar após tratamento com Docetaxel e Ciclofosfamida

O câncer de mama (CM) é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Sabe-se que a maior incidência de CM ocorre nas mulheres pós-menopausa, entretanto é crescente o número de mulheres jovens acometidas por esta doença. O tratamento do CM pode incluir: quimioterapia, radioterapia e/ou hormonioterapia. A quimioterapia, por se ser um tratamento sistêmico, pode causar importantes efeitos colaterais, entre eles a falência ovariana induzida por quimioterapia (FOIQ). As principais consequências da FOIQ são a infertilidade, além de complicações tardias relacionadas à diminuição do estrogênio, como a osteoporose e doenças cardiovasculares. O regime quimioterápico TC, adota a associação do docetaxel com a ciclofosfamida, como uma opção por fármacos que resultem numa taxa de sobrevida livre do câncer, e menores efeitos colaterais. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos tardios no ovário causados pelo tratamento com a associação dos quimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida (TC), em modelo animal com ratos Wistar. Para verificar o sinergismo desses quimioterápicos e assim analisar o efeito da administração conjunta, ratos Wistar fêmeas foram divididos em dois grupos: um grupo controle e um grupo que recebeu quimioterapia (TC). Os animais foram submetidos a eutanasia cinco meses após o fim do tratamento, e foram recolhidos o plasma e os ovários. Foram observadas alterações importantes. O nível de estradiol no plasma foi significativamente reduzido no grupo de TC em comparação com o grupo controle. Além disso, o número de núcleos apoptóticos foi maior no grupo TC. O papel da resposta inflamatória no desenvolvimento da lesão ovariana foi também investigado, e notou-se um aumento do número de mastócitos, e aumento da expressão de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) no grupo TC. O envolvimento de fibrose nesse processo, foi também investigado. Os resultados mostraram que níveis de expressão de Fator de Crescimento Tumoral-β1 (TGF-β1), Colágeno Tipo I (Col-I) e Colágeno Tipo III (Col-III) estavam maiores no grupo TC em comparação com o grupo de controle. A análise ultraestrutural revelou a presença de feixes de colágeno no grupo tratado, e mostrou que a arquitetura do tecido do ovário estava mais desorganizada neste grupo comparado ao grupo controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de ciclofosfamida e docetaxel, um recente regime quimioterápico proposto para o tratamento do CM, pode levar a importantes alterações no ovário. O processo inflamatório, desencadeado pela administração dos quimioterápicos, estimula a apoptose e liberação de TGF-β no estroma ovariano, que induz a produção de matriz extracelular e subsequente, substituição do tecido sadio por tecido fibrótico. A principal consequência deste processo é a diminuição, ou perda, da função ovariana, levando à menopausa precoce e possível infertilidade. É importante compreender os mecanismos envolvidos na infertilidade provocada pelo regime TC, a fim de estudar novos métodos que evitem este efeito indesejável em mulheres submetidas a tratamento do CM.

Comunidades macrofaunais bênticas associadas às algas de deriva e à grama marinha Halodule wrightii Ascherson na Ilha do Japonês, Cabo Frio, RJ

As extensas pradarias submersas formadas pelas gramas marinhas são importantes habitats da costa, onde ocorrem interações ecológicas entre diversas espécies da vegetação subaquática, invertebrados bentônicos e peixes. As gramas marinhas e algas de deriva são conhecidas como macrófitas marinhas e, por ocuparem o mesmo tipo de substrato, são normalmente encontradas juntas, proporcionando oxigênio, alimento, proteção, abrigo além de sítios de reprodução e pastagem para os animais associados a essas pradarias. Amostras de algas de deriva e de H. wrightii foram coletadas, ao longo de transectos fixos de 50 m paralelos à Ilha do Japonês, a fim de analisar a existência de relações positivas entre as espécies de macrófitas marinhas e sua macrofauna associada, comparar as duas comunidades e avaliar a estruturação da comunidade macrofaunal bêntica do local. Os transectos foram alocados de acordo com a posição do banco de grama marinha. Observou-se que a densidade de eixos e a biomassa de H. wrightii não explicam a variação da biomassa, riqueza de espécies e diversidade (Índice de Simpson) das algas de deriva. A grande movimentação das algas de deriva ao longo do banco de grama marinha faz com que elas se homogeneízem e ocupem diferentes lugares ao acaso na pradaria, muitos desses locais com baixa biomassa de H. wrightii devido à grande variabilidade na distribuição dessa espécie no local de estudo. Os descritores ecológicos da grama marinha também não tiveram relações positivas com sua macrofauna bêntica associada. A comunidade macrofaunal associada às gramas marinhas foi mais densa, rica e diversa do que a comunidade macrofaunal associada às algas de deriva. Os moluscos Anomalocardia flexuosa, Cerithium atratum, Ostrea sp, Tellina lineata e Divalinga quadrissulcata dominaram o ambiente de gramas marinhas. A maior complexidade estrutural das algas de deriva forneceu um habitat protegido mais atrativo para os crustáceos como, Pagurus criniticornis, Cymadusa filosa e Batea catharinensis. A malacofauna associada às algas não foi abundante, mas um novo registro foi a ocorrência do bivalve invasor Lithopaga aristatus, perfurando uma concha de Ostrea sp. As relações entre os descritores da biomassa algal foram comprovadas para a maioria dos descritores de sua fauna associada. As relações das macrófitas marinhas com a macrofauna total associada seguiram o mesmo padrão das relações das algas de deriva. As análises de agrupamento e ordenação mostraram que as comunidades macrofaunais bênticas do local são estruturadas de acordo com os táxons dos organismos associados mais dominantes influenciados pelo tipo de vegetação basibionte (algas de deriva ou grama marinha). Destaca-se com o presente estudo a importância de medidas de maior proteção no local para a preservação e manutenção do ecossistema da Ilha do Japonês, RJ, Brasil

Efeito da restrição alimentar materna durante a lactação sobre a função ovariana da prole fêmea na puberdade e vida adulta

α.O objetivo deste estudo foi avaliar se a restrição alimentar materna durante a lactação altera a função ovariana da prole na puberdade e na vida adulta. No dia do nascimento da ninhada, as ratas foram separadas aleatoriamente nos seguintes grupos: (C) controle = dieta com 23% de proteína; (PER) restrição protéica calórica = dieta com 8% de proteína. Após o desmame, as proles tiveram livre acesso a dieta com 23% proteína e apenas os animais na fase diestro foram sacrificados com uma dose letal de pentobarbital aos 40 e 90 dias de idade. O sangue foi retirado por punção cardíaca e o soro armazendo para posterior dosagem dos níveis hormonais por radioimunoensaio. O ovário direito foi excisado, pesado e armazenado a 80C para subseqüente avaliação do receptor de androgênio (AR), das isoformas dos receptores de estrogênio (ERα, ERβ1 e ERβ2), do receptor do hormônio folículo estimulante (FSHR), do receptor do hormonio luteinizante (LHR), das isoformas dos receptores de leptina (Ob-R, Ob-Ra and Ob-Rb), e da enzima aromatase pela técnica de RT-PCR. O ovário esquerdo foi incluido em parafina, seccionado em cortes de 5 μm de espessura e processado por análise histológica de rotina, para classificação dos foliculos ovarianos. Na puberdade, o grupo PER apresentou um aumento significativo (p<0,05) no número dos folículos pré-antrais e antrais, enquanto o número de folículos primordiais, folículos de Graaf e corpo lúteo foram reduzidos significativamente (p<0,05). As concentrações sericas de estradiol (pg/ml) foram significativamente aumentadas (p<0,05). Houve aumento significativo na expressão do RNAm dos FSHR (p<0.05) e LHR (p<0.05), e diminuição significativa na expressão do RNAm dos AR (p<0.05), ERα (p<0.05), ERβ1 (p<0.05) e ERβ2 (p<0.05). Na vida adulta, a restrição alimentar causou uma diminuição no número total de folículos ovarianos, entretanto esta redução só foi significativa no número dos folículos primordiais, primários e de Graaf (p<0.05). Houve redução significativa da expressão da enzima aromatase (p<0.01), do FSHR (p<0.05), LHR (p<0.05), Ob-R (p<0.05) e Ob-Rb (p<0.05). Podemos concluir que a restrição alimentar materna durante a lactação causa uma programação metabólica no ovário da prole, alterando a foliculogênese, expressão das diferentes isoformas dos receptores de estrogênio, leptina, androgênio e gonadotropinas e da enzima aromatase. Essa programação, possivelmente decorrente dos baixos níveis de leptina nos primeiros dias de vida, pode contribuir para uma senescência precoce e redução da fertilidade já descrita na literatura.

Alterações estruturais cardíaca e aórticana menopausa cirúrgica associada à hipertensão renovascular em ratos

A menopausa e a hipertensão podem alterar o remodelamento cardiovascular, porém pouco se sabe sobre sua associação no remodelamento ventricular esquerdo e na aorta. As ratas foram separadas em quatro grupos com seis animais cada: grupo Sham, OVX (ratas ooforectomizadas), 2K1C (ratas com dois rins, um clipe), e grupo 2K1C+OVX com período experimental de 11 semanas. O ventrículo esquerdo (VE) e a aorta torácica foram removidos e analisados (microscopia de luz, imuno-histoquímica e estereologia). A citologia vaginal mostrou que os animais dos grupos Sham e 2K1C ciclaram normalmente, entretanto, os animais dos grupos OVX e OVK+2K1C permaneceram na fase do diestro ou proestro. Comparado ao grupo Sham, a pressão arterial aumentou 12% no grupo OVX e 35% maior nos grupos 2K1C e OVX+2K1C. A relação massa do VE/comprimento da tíbia e a área seccional média de cardiomiócitos aumentaram em todos os grupos com exceção do grupo Sham. A vascularização intramiocárdica foi reduzida cerca de 30% em relação ao grupo Sham, não havendo diferença significativa entre os grupos OVX, 2K1C e OVX+2K1C. O tecido conjuntivo cardíaco teve um aumento superior a 45% nos grupos 2K1C e OVX+2K1C comparados ao grupo Sham, sem diferença entre o os animais do grupo Sham e OVX. O número de núcleos de cardiomiócitos do VE foi gradualmente menor nos grupos OVX, 2K1C e OVX+2K1C, sem diferença entre os dois últimos grupos. Imuno-histoquímica positiva para receptor AT1 da Ang II nas células musculares lisas da túnica média da aorta foi observado em todos os grupos. Estes resultados indicam que a ooforectomia e a hipertensão renovascular agem aumentando a pressão arterial independentemente, com conseqüente remodelamento cardíaco adverso, com estímulo maior da hipertensão renovascular que da menopausa induzida cirurgicamente.

Alterações estruturais cardíaca e aórtica na menopausa cirúrgica associada à hipertensão renovascular em ratos

A menopausa e a hipertensão podem alterar o remodelamento cardiovascular, porém pouco se sabe sobre sua associação no remodelamento ventricular esquerdo e na aorta. As ratas foram separadas em quatro grupos com seis animais cada: grupo Sham, OVX (ratas ooforectomizadas), 2K1C (ratas com dois rins, um clipe), e grupo 2K1C+OVX com período experimental de 11 semanas. O ventrículo esquerdo (VE) e a aorta torácica foram removidos e analisados (microscopia de luz, imuno-histoquímica e estereologia). A citologia vaginal mostrou que os animais dos grupos Sham e 2K1C ciclaram normalmente, entretanto, os animais dos grupos OVX e OVK+2K1C permaneceram na fase do diestro ou proestro. Comparado ao grupo Sham, a pressão arterial aumentou 12% no grupo OVX e 35% maior nos grupos 2K1C e OVX+2K1C. A relação massa do VE/comprimento da tíbia e a área seccional média de cardiomiócitos aumentaram em todos os grupos com exceção do grupo Sham. A vascularização intramiocárdica foi reduzida cerca de 30% em relação ao grupo Sham, não havendo diferença significativa entre os grupos OVX, 2K1C e OVX+2K1C. O tecido conjuntivo cardíaco teve um aumento superior a 45% nos grupos 2K1C e OVX+2K1C comparados ao grupo Sham, sem diferença entre o os animais do grupo Sham e OVX. O número de núcleos de cardiomiócitos do VE foi gradualmente menor nos grupos OVX, 2K1C e OVX+2K1C, sem diferença entre os dois últimos grupos. Imuno-histoquímica positiva para receptor AT1 da Ang II nas células musculares lisas da túnica média da aorta foi observado em todos os grupos. Estes resultados indicam que a ooforectomia e a hipertensão renovascular agem aumentando a pressão arterial independentemente, com conseqüente remodelamento cardíaco adverso, com estímulo maior da hipertensão renovascular que da menopausa induzida cirurgicamente.

Capacidade de invasão, persistência intracelular e atividade citotóxica de cepas de Aeromonas spp. em modelo celular in vitro e ex vivo

As Aeromonas são consideradas patógenos em potenciais para o homem e animais e estão amplamente distribuídas no ambiente sendo a água e os alimentos importantes veículos de transmissão. Muitos estudos têm demonstrado que a patologia causada pela infecção por Aeromonas é complexa e envolvem inúmeros fatores de virulência, dentre eles a aderência, invasão, enterotoxinas, hemolisinas, exoenzimas, sideróforos, flagelos, formação de biofilme e mecanismos de secreção. No presente estudo, analisamos os mecanismos de patogênese mediados por A. caviae e A. hydrophila, avaliando a participação desses microrganismos nos processos de adesão, invasão, persistência intracelular e citotoxidade celular. Foram utilizados ensaios quantitativos in vitro para testar associação, invasão e persistência intracelular em linhagens celulares HEp-2 e/ou T84. A interação de tecidos intestinais de coelho cultivados in vitro (IVOC) com três cepas de A. caviae originárias de fezes diarréicas também foi avaliada. Observamos que 10 (62,5%) das 16 cepas de Aeromonas spp. de diferentes origens, submetidas aos testes de invasão quantitativos foram capazes de invadir células HEp-2 e T84 em 6 horas de incubação. As cepas positivas nos testes de invasão foram submetidas ao teste quantitativo de persistência em células HEp-2 e sobreviveram no ambiente intracelular por 48 e/ou 72 horas sem multiplicação. A interação de três cepas de A. caviae com a mucosa intestinal de coelho ex vivo resultou em aderência, produção de muco e alterações como, intensa vacuolização e drástica desorganização estrutural que levaram a destruição das microvilosidades intestinais. Este estudo demonstrou que subconjuntos de cepas de A. caviae e A. hydrophila de diversas origens, foram capazes de invadir, persistir ou destruir linhagens celulares in vitro. Nosso estudo também evidenciou que cepas de A. caviae causaram expressivas alterações morfológicas que resultaram na destruição de epitélios intestinais de coelho ex vivo. Finalmente, nossos resultados contribuíram para reforçar o potencial patogênico de cepas de Aeromonas, em especial, as de origem vegetal e clínica.

Bases moleculares da multiresistência a drogas em Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose (Tb) é a principal causa de morte no mundo, por um agente infeccioso. O tratamento padrão é a quimioterapia: rifampicina (RMP), isoniazida (INH) e pirazinamida (PZA). O maior problema global da Tb é o aumento de cepas multirresistentes (resistência pelo menos à INH e à RMP) do Mycobacterium tuberculosis (MTb). A resistência à INH e RMP ocorre geralmente por mutação genética nos genes KatG e rpoB, respectivamente. Os objetivos deste trabalho foram: 1. Analisar os tipos e freqüências de mutações em duas regiões iniciais do gene katG do MTb. 2. Determinar os tipos e freqüências das mutações no gene rpoB. Duas regiões do gene katG e uma do gene rpoB foram amplificadas por PCR e seqüenciadas para o diagnóstico das mutações. Para a análise do gene katG foram utilizadas 101 cepas. Dentre estas, 4 eram sensíveis e não apresentaram mutação (controle). Das 97 cepas restantes, na primeira região seqüenciada do KatG, não ocorreram mutações em 67. Nas outras 30 cepas houve 33 deleções de nucleotídeos, sendo que 24 ocorreram no último nucleotídeo do códon 4 (24,7%), o que caracterizou um novo alelo. Na região 2, dentre as 97 cepas não houve mutação em 16 - sete estavam associadas a ausência de mutação na região 1. Ocorreram 83 mutações pontuais, sendo 75,3% no códon 315. Sete cepas resistentes a INH não apresentaram mutações em nenhuma das duas regiões analisadas. As mutações na região 2 permitiram o diagnóstico de resistência à INH em 79 cepas ou 81,4%. Nove cepas que não mostraram mutações na região 2 tiveram mutações na região 1. Logo, esta região permitiu o acréscimo do diagnóstico de resistência à INH para 88 cepas, aumentando a positividade em 9,3%. Em sete casos resistentes não houve mutação em ambas as regiões. Na análise do gene rpoB usamos 120 cepas de MTb. Nenhuma mutação foi encontrada em 13 isolados resistentes à RMP. O códon que apresentou maior freqüência de mutação foi o 531 (45.6%), seguido pelo 526 (26%) e 516 (12.5%). Em outros onze códons, foi encontrado um total de 18 mutações (15.2%), principalmente nos códons 511 (3.4%) e 513 (3.4%). Nenhum dos isolados sensíveis à RMP apresentou mutações. No Estado do Rio de Janeiro, as mutações mais freqüentes foram: 516 (5%), 526 (2.5 %) e 531 (21.2%). Dentre os outros estados, as mutações mais freqüentes foram: 516 (2.5 %), 526 (11%) e 531 (19.4%). A freqüência de mutações dos isolados do Rio de Janeiro foi comparada com a encontrada nos outros estados, mas quando o removemos da análise, a freqüência de mutações nos códons 531 e 526 para os outros 15 estados é semelhante. A análise estatística mostra que este dado é significativo (p=0.002). No entanto, quando todos os estados são analisados simultaneamente, o códon 531 é novamente o mais freqüentemente mutado. A análise do gene rpoB diagnosticou a resistência à rifampicina em 89,17% das cepas. Nossos resultados confirmam que, no Brasil, mutações na região RRDR do gene rpoB podem predizer resistência a RMP.

Perfil genético por sequenciamento e genotipagem de cepas multirresistentes do Mycobacterium tuberculosis provenientes de diversos estados brasileiros

A tuberculose multirresistente (MR) a drogas é uma séria ameaça à saúde pública devido à maiores complexidade, custo e efeitos colaterais do tratamento. Poucos estudos descreveram a epidemiologia molecular de isolados de Mycobacterium tuberculosis MR no Brasil. Neste trabalho foi investigada a diversidade genética e mutações associadas à resistência a drogas de 99 isolados MR e 7 não MR coletados em um período de 8 anos e provenientes de 12 estados brasileiros. Esta investigação foi feita através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do elemento de inserção IS6110 (IS6110-RFLP), spoligotyping e sequenciamento de regiões dos genes rpoB e katG que conferem resistência aos antibióticos rifampicina e isoniazida, respectivamente. Mutações nos genes katG e rpoB foram encontradas em 90,9% e 93% dos isolados MR analisados, respectivamente. Para o gene rpoB, 91,9% das mutações estavam contidas na região RRDR de 81-pb. Um total de 51 (51.5%), 23 (23.3%) e 11 (11.1%) isolados MR apresentaram mutações nos códons 531, 526 e 516, respectivamente. Com relação ao gene katG, foram encontradas mutações em 93% dos isolados MR analisados, sendo que 7 apresentaram mutações apenas na primeira região analisada (katG1). O codon 315 da segunda região analisada do gene katG (katG2) apresentou mutações em 82.8% dos isolados MR, sendo a maioria Ser315Thr. A região katG1 apresentou mutações em 30.3% dos isolados MR sendo a maioria deleção do códon 4. Pelo spoligotyping foi possível determinar que os isolados MR deste estudo pertencem a 5 diferentes famílias (com suas subfamílias) de M. tuberculosis circulantes no Brasil, onde as mais frequentemente encontradas foram: LAM (46%), T (17%) e H (12%). Nós observamos que uma das famílias, a EAI5, carrega mutações no códon 463 do gene katG, o que não ocorre para as demais. Além disso, entre nossos isolados foi identificada um isolado pertencente à cepa Beijing (extremamente virulenta), mas este fato não é alarmante já que se tratou de apenas um caso. Através de nossos dados foram descritos novos alelos mutados para os genes rpoB e katG. Com exceção da família X2, foi identificada uma região inicial do gene katG com alta frequência de mutações nos isolados MR. A análise por IS6110-RFLP revelou que 25 isolados formaram 11 grupos genotípicos enquanto 74 mostraram um padrão único de bandas. Esta alta taxa de polimorfismo indica aquisição independente de resistência entre nossos isolados. Para a família H, foi identificada uma inversão na freqüência de ocorrência de mutações no gene rpoB, sendo o códon 516 o mais mutado, seguido pelo 526 e 531. Os resultados deste estudo fornecem informações úteis para um melhor entendimento do espectro de mutações dos isolados MR de pacientes no Brasil. Nossos resultados também se tornam úteis no desenvolvimento de testes diagnósticos de tuberculose MR e para auxiliar no rastreamento da transmissão global desta doença.

Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de Pseudomonas aeruginosa em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10⁷ Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Papel do bloqueio dos receptores NMDA e da ativação dos receptores GABAA na manifestação dos déficits neurocomportamentais decorrentes da exposição ao etanol durante o período equivalente ao terceiro trimestre de gestação

A exposição gestacional ao etanol produz um amplo espectro de defeitos neurocomportamentais que podem persistir ao longo da vida. Dentre os distúrbios mais comumente observados estão o transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e os déficits de aprendizado e memória. Apesar da grande quantidade de estudos, os mecanismos envolvidos com a manifestação destes transtornos permanecem pouco conhecidos. Estudos em roedores vêm demonstrando que o período equivalente ao terceiro trimestre de gestação é critico para o aparecimento destas alterações comportamentais. Durante este período, que é caracterizado por intensa sinaptogênese, a neurotoxicidade do etanol vem sendo atribuída ao bloqueio dos receptores glutamatérgicos do tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) e hiperativação dos receptores do ácido gama-aminobutírico do subtipo A (GABAA). Tendo em vista que ao longo do desenvolvimento estes receptores diferem em relação a função e distribuição espaço-temporal, neste estudo avaliamos a contribuição relativa do bloqueio dos receptores NMDA e hiperativação dos receptores GABAA durante o período equivalente ao terceiro trimestre de gestação para a manifestação da hiperatividade locomotora e para os distúrbios de aprendizado e memória de camundongos pré-púberes. Para tanto, este estudo foi realizado em duas etapas. Na primeira, investigamos os efeitos da exposição isolada ao bloqueador NMDA MK801 (MK) e ao agonista GABAA muscimol (MU). Para tanto, em dias alternados do segundo dia pós-natal (PN2) a PN8, os animais receberam uma injeção intraperitoneal de Salina (SAL), MK nas doses de 0,1, 0,3 ou 0,5 mg/kg ou de MU nas doses de 0,1 0,3 ou 0,5 mg/kg. Na segunda etapa investigamos os efeitos da administração simultânea de MK (0,1mg/kg) e MU (doses 0,02, 0,1 ou 0,5 mg/kg). Em PN25, a atividade locomotora foi automaticamente avaliada por 15 min no teste de campo aberto. Em PN31 e PN32, o aprendizado e memória foi avaliado no teste da esquiva passiva inibitória. Em relação aos resultados da exposição isolada a cada uma das drogas, apenas o tratamento com MK promoveu um aumento dose dependente na atividade locomotora. No teste da esquiva passiva inibitória, os animais expostos as maiores doses de MK e MU apresentaram déficits de aprendizado e memória. Em relação aos resultados da exposição combinada de MK e MU, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos na atividade locomotora. Na esquiva passiva inibitória, a administração simultânea de MK e MU, em doses que administradas isoladamente não tiveram efeito, promoveu prejuízos de aprendizado e memória. Nossos resultados sugerem que, enquanto a hiperatividade locomotora está associada apenas com o bloqueio dos receptores NMDA, os déficits de aprendizado e memória podem ser produto de uma ação sinergista do etanol nos dois receptores.

Análise comportamental de ratos Wistar machos em diferentes idades em um modelo de programação metabólica pela restrição protéica materna durante a lactação

A desnutrição neonatal em ratos resulta em alterações metabólicas e endócrinas nas proles a curto e a longo prazo. Sabe-se que algumas destas alterações, como o conteúdo aumentado de catecolaminas adrenais e a hipercorticosteronemia nos animais adultos estão associadas a alterações comportamentais. Não se sabe, no entanto, se as alterações comportamentais observadas estão presentes desde o insulto original, a desnutrição, ou se estas se desenvolvem ao longo do tempo. Neste sentido, avaliamos em ratos Wistar os efeitos da programação pela restrição protéica materna durante a lactação sobre os parâmetros comportamentais relacionados à ansiedade, à atividade locomotora e à memória/aprendizado em diferentes idades ao longo do desenvolvimento. Ao nascimento das suas proles as progenitoras foram separadas em: Grupo restrição protéica (RP) - que recebeu ração hipoprotéica (8% de proteína) do nascimento ao desmame [dia pós-natal (P) 21], e Grupo CONT (controle) - que recebeu ração normoprotéica neste período. Os seguintes testes comportamentais foram realizados com a prole (21 animais / grupo / idade) em P21, P45, P90 e P180: 1) labirinto em cruz elevado (LCE) - avalia comportamentos associados à ansiedade; 2) campo aberto (CA) - avalia atividade locomotora; 3) labirinto aquático radial de oito braços (LAROB) - avalia memória e aprendizado. Após os testes comportamentais, os animais foram sacrificados por decapitação, o sangue foi coletado para dosagem da corticosterona sérica e a glândula adrenal para quantificação das catecolaminas adrenais. No LCE, os animais RP apresentaram aumentos significativos nas variáveis associadas à ansiedade quando comparado ao grupo CONT somente em P21. No CA foi observada uma redução significativa no número de retângulos percorridos pelo grupo RP somente na idade de P90. No LAROB não identificamos diferenças significativas entre os grupos durante os quatro primeiros dias de teste, independente da idade. No quinto dia de testes (probe trial), o grupo RP mostrou uma diminuição na latência para encontrar a plataforma, em P21 e P180. Quanto à função adrenal, o grupo RP apresentou uma diminuição nos valores de corticosterona sérica em P90, e um aumento no conteúdo de catecolaminas adrenais quando comparado ao grupo CONT em P21 e P180. Nas demais idades analisadas não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos. Nossos dados indicam que os animais do grupo RP apresentam: 1) redução do comportamento associado à ansiedade no final do período de lactação; 2) redução da atividade locomotora em adultos jovens; 3) melhora do desempenho de memória e aprendizado no final da lactação e na idade adulta (P180). Adicionalmente, os dados indicam que há uma associação entre alterações nos parâmetros comportamentais e da função adrenal. Podemos concluir que a restrição protéica durante o período de lactação em ratos afeta o comportamento apresentado ao longo da vida e que o padrão temporal dos efeitos varia em função do comportamento estudado.

Efeito protetor do extrato hidroalcoólico de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) nas alterações renais, cardiovasculares e metabólicas induzidas pela restrição protéica materna durante a gestação

Alguns trabalhos demonstraram que a planta, Euterpe oleracea Mart. (açaí) é rica em polifenóis e que uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) (200mg/Kg/dia), sobre as alterações renais, cardiovasculares, metabólicas, morfológicas e o estresse oxidativo na prole adulta com dezesseis semanas, cujas mães foram submetidas a uma dieta hipoprotéica durante a gestação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (20% de proteínas); controle + ASE (20% de proteína + ASE); hipoprotéica (6% de proteína); hipoprotéica + ASE (6% de proteína + ASE) durante a gestação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados com 4 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram determinados o peso corporal, níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), albumina, uréia, creatinina, glicose, insulina, resistência à insulina (índice de Homa IR), sódio, potássio e a renina plasmática. Foi avaliada a depuração de creatinina, volume de urina, excreção fracionada de sódio (EFNa) e o número de glomérulos renais. O dano oxidativo, níveis de nitrito e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de rim. O peso corporal foi menor no grupo hipoprotéico e recuperado com ASE. A PAS foi aumentada no grupo hipoprotéico e revertida pelo tratamento com ASE. Os níveis de renina plasmática foram aumentados no grupo hipoprotéico e reduzidos com ASE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM estava reduzida no grupo hipoprotéico com ASE houve uma melhora dessa resposta.O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. No grupo hipoprotéico também foi observado o aumento dos níveis de triglicerídeos, colesterol total, uréia, creatinina, glicose e insulina, os mesmos foram reduzidos pelo ASE. Não houve diferença nos níveis de HDL, sódio, potássio, depuração de creatinina e volume urinário nos grupos estudados. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estavam aumentados e os níveis de nitrito reduzidos no grupo hipoprotéico e foram revertidos pelo ASE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no rim foram reduzidas no grupo hipoprotéico e aumentadas pelo ASE, com exceção da catalase que não apresentou diferença entre os grupos. Os animais hipoprotéicos apresentaram redução no número de glomérulos renais e aumento da EFNa e o tratamento com ASE preveniu as alterações renais encontradas neste modelo. Em conclusão, o ASE parece proteger a prole, cujas mães foram expostas a uma dieta com pouca proteína durante a gestação, através do efeito anti-hipertensivo, vasodilatador e antioxidante observado neste trabalho.

Estudo da sinalização da insulina nos tecidos muscular e adiposo de ratos submetidos à desnutrição materna no início da lactação

Vários estudos sugerem que a desnutrição materna no período pós-natal poderia causar alterações na homeostase glicêmica da prole na vida adulta. Neste trabalho objetivamos investigar a interferência da programação metabólica induzida pela desnutrição protéica materna durante o início da lactação sobre a homeostase glicêmica e a sinalização da insulina nos tecidos muscular e adiposo. Animais desnutridos (D-dieta da mãe contendo 0% de proteína nos primeiros 10 dias de lactação) ou controle (C-dieta da mãe contendo 22% de proteína) foram estudados do nascimento até a vida adulta. Em resumo, observamos uma diminuição na insulina plasmática acompanhada de normoglicemia nos animais adultos desnutridos. A ativação do receptor de insulina (IR), após a estimulação com o hormônio apresentou-se diminuída durante o período de restrição protéica em músculo isolado destes animais experimentais. Durante o período da lactação, observamos uma diminuição na captação de glicose, na fosforilação do substrato para o receptor de insulina (IRS 1) e na translocação do GLUT 4 no tecido muscular. Na idade adulta, entretanto, houve aumento significativo na captação de glicose e translocação do GLUT 4 no músculo, associado com o aumento na expressão da PI3 quinase associada ao IRS 1. No tecido adiposo de ratos desnutridos adultos observamos menor fosforilação em tirosina tanto do IR quanto do IRS 1, que foi compensada pela maior ativação do IRS 2 e da PI3 quinase. Os níveis basais de pAkt e de GLUT 4 na membrana estavam aumentados, culminando em um aumento na captação de glicose. Observamos também uma redistribuição do citoesqueleto de actina e maior resistência aos efeitos da Ltrunculina B nos adipócitos dos ratos desnutridos. Em conclusão, este estudo demonstrou que a desnutrição materna no início da lactação é capaz de causar alterações na prole na vida adulta, o que parece estar relacionado com a expressão e ativação de proteínas chave na cascata da sinalização da insulina nos tecidos periféricos, importantes na regulação do metabolismo da glicose.

Modulação por Sucupira (Pterodon polygalaeflorus, Benth) da distribuição de Linfócitos T ativados e T de memória em linfonodos (LN) de camundongos com Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) e da mielopoiese em baços de camundongos primados com Adjuvante Completo de Freund (AFC)

Sementes de árvores do gênero Pterodon, conhecidas principalmente pelo nome Sucupira, são utilizadas popularmente para o tratamento de doenças reumáticas. Na presente dissertação, temos como objetivo estudar a possível ação do extrato hidroalcoólico de sementes de Pterodon polygalaeflorus (EHPp) no tratamento de Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) em camundongos DBA/1J. Verificou-se a distribuição de Linfócitos T CD4+ com fenótipo de memória em linfonodos de animais com CIA; a possível interferência do tratamento no segundo aumento de células mielóides (Mac-1+) esplênicas gerado pela segunda injeção de colágeno tipo II (CII) para indução da CIA e confirmou-se o fenótipo granulocítico dessas células mielóides. Além disso, através de outro modelo experimental de 10 dias de duração, objetivou-se estudar as células mielóides Mac-1+: se o tratamento com EHPp interfere na mielopoese esplênica induzida somente pela injeção de Adjuvante de Freund Completo (AFC) em camundongos DBA1/J e avaliar uma eventual diferença entre o grau de ativação dessas células em animais primados com AFC tratados ou não com EHPp. A CIA foi induzida em camundongos DBA/1J machos, por injeção intradérmica (i.d.) de CII em AFC com reforço intraperitonial de CII três semanas após a primeira injeção. O tratamento oral, diário, com EHPp por cerca de 30 dias foi iniciado no dia do reforço com CII. No modelo de curta duração, com o intuito de verificar o possível aumento de células Mac-1+ no baço, os animais foram tratados oralmente com EHPp, por 9 dias, sendo o AFC injetado, i.d., no 5o dia do tratamento e os animais sacrificados no 10o. Os resultados obtidos foram: o tratamento com EHPp interfere na distribuição de Linfócitos T com fenótipo de memória em animais com indução de CIA; resultados preliminares sugerem que o tratamento com EHPp não interfere no segundo aumento de células mielóides no baço no modelo CIA; a maioria das células mielóides presentes no baço de animais sadios ou de animais com CIA apresenta fenótipo granulocítico (GR.1+); o tratamento com EHPp reduz significantemente a mielopoese esplênica induzida pela injeção de AFC; a fração significante de células Mac-1+ no baço de animais primados com AFC apresenta aumento de produção de Espécies Reativas de Oxigênio em relação aos animais sadios ou tratados com EHPp. Em conjunto, estes resultados permitem identificar uma possível ação anti-inflamatória do EHPp ao impedir o aumento de células inflamatórias no baço de animais primados com AFC, bem como uma atividade imunossupressora, evidenciada pela redução de Linfócitos com perfil de recém ativação e de Linfócitos com perfil de memória nos LNs em relação aos animais com CIA, sugerindo o seu envolvimento nos processos de ativação e de migração linfocitários.

Estudo das características fenotípicas e genotípicas de amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis

Uma vez que C. pseudotuberculosis é o agente etiológico de processos infecciosos em animais caprinos e ovinos e que também pode ser isolado de processos infecciosos em seres humanos as investigações direcionadas para a espécie em questão são necessárias, visto que a escassez de dados epidemiológicos e de conhecimento relativo ao comportamento do microrganismo em hospedeiros animais e humanos em nosso país dificulta o diagnóstico laboratorial da espécie, à semelhança do observado com outra espécie de transmissão zoonótica, o C. ulcerans. Uma preocupação adicional é o fato da espécie em questão também ser capaz de albergar bacteriófagos codificadores da toxina diftérica, representando uma ameaça à circulação dos bacteriófagos. Assim, o presente estudo tem como objetivo geral analisar as características fenotípicas e genotípicas de amostras de C. pseudotuberculosis. Neste sentido, foram propostos os seguintes objetivos: Avaliar as características bioquímicas das amostras através de testes bioquímicos convencionais; avaliar as características bioquímicas das amostras utilizando o sistema semi-automatizado API Coryne; diferenciar amostras de C. pseudotuberculosis de C. ulcerans utilizando a técnica de PCR multiplex; pesquisar a presença de gene tox. Os resultados demonstraram que amostras de C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis podem ser caracterizadas por métodos bioquímicos convencionais e por taxonomia numérica (API Coryne System). C. ulcerans e C. pseudotuberculosis, com potencial de circulação zoonótica, da mesma forma que C. diphtheriae são capazes de albergar o gene da toxina diftérica. A reação m-PCR foi capaz de discernir as amostras de C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis e ainda definir o potencial das amostras em produzir a toxina diftérica. Os dados enfatizam a necessidade da técnica multiplex PCR para o diagnostico e para o controle de espécies associadas a quadros de difteria em populações humana.