Detection and determination of oligonucleotide triplex formation-mediated transcription-coupled DNA repair in HeLa nuclear extracts

Transcription-coupled repair (TCR) plays an important role in removing DNA damage from actively transcribed genes. It has been speculated that TCR is the most important mechanism for repairing DNA damage in non-dividing cells such as neurons. Therefore, abnormal TCR may contribute to the development of many age-related and neurodegenerative diseases. However, the molecular mechanism of TCR is not well understood. Oligonucleotide DNA triplex formation provides an ideal system to dissect the molecular mechanism of TCR since triplexes can be formed in a sequence-specific manner to inhibit transcription of target genes. We have recently studied the molecular mechanism of triplex-forming oligonucleotide (TFO)-mediated TCR in HeLa nuclear extracts. Using plasmid constructs we demonstrate that the level of TFO-mediated DNA repair activity is directly correlated with the level of transcription of the plasmid in HeLa nuclear extracts. TFO-mediated DNA repair activity was further linked with transcription since the presence of rNTPs in the reaction was essential for AG30-mediated DNA repair activity in HeLa nuclear extracts. The involvement of individual components, including TFIID, TFIIH, RNA polymerase II and xeroderma pigmentosum group A (XPA), in the triplex-mediated TCR process was demonstrated in HeLa nuclear extracts using immunodepletion assays. Importantly, our studies also demonstrated that XPC, a component involved in global genome DNA repair, is involved in the AG30-mediated DNA repair process. The results obtained in this study provide an important new understanding of the molecular mechanisms involved in the TCR process in mammalian cells.

DNA polymerase ɛ is required for coordinated and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts

DNA polymerase ɛ (Polɛ) is thought to be involved in DNA replication, repair, and cell-cycle checkpoint control in eukaryotic cells. Although the requirement of other replicative DNA polymerases, DNA polymerases α and δ (Polα and δ), for chromosomal DNA replication has been well documented by genetic and biochemical studies, the precise role, if any, of Polɛ in chromosomal DNA replication is still obscure. Here we show, with the use of a cell-free replication system with Xenopus egg extracts, that Xenopus Polɛ is indeed required for chromosomal DNA replication. In Polɛ-depleted extracts, the elongation step of chromosomal DNA replication is markedly impaired, resulting in significant reduction of the overall DNA synthesis as well as accumulation of small replication intermediates. Moreover, despite the decreased DNA synthesis, excess amounts of Polα are loaded onto the chromatin template in Polɛ-depleted extracts, indicative of the failure of proper assembly of DNA synthesis machinery at the fork. These findings strongly suggest that Polɛ, along with Polα and Polδ, is necessary for coordinated chromosomal DNA replication in eukaryotic cells.

Herbicide Safener-Binding Protein of Maize1 : Purification, Cloning, and Expression of an Encoding cDNA

Dichloroacetamide safeners protect maize (Zea mays L.) against injury from chloroacetanilide and thiocarbamate herbicides. Etiolated maize seedlings have a high-affinity cytosolic-binding site for the safener [3H](R,S)-3-dichloroacetyl-2,2,5-trimethyl-1,3-oxazol-idine ([3H]Saf), and this safener-binding activity (SafBA) is competitively inhibited by the herbicides. The safener-binding protein (SafBP), purified to homogeneity, has a relative molecular weight of 39,000, as shown by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and an isoelectric point of 5.5. Antiserum raised against purified SafBP specifically recognizes a 39-kD protein in etiolated maize and sorghum (Sorghum bicolor L.), which have SafBA, but not in etiolated wheat (Triticum aestivum L.), oat (Avena sativa L.), barley (Hordeum vulgare L.), tobacco (Nicotiana tabacum L.), or Arabidopsis, which lack SafBA. SafBP is most abundant in the coleoptile and scarcest in the leaves, consistent with the distribution of SafBA. SBP1, a cDNA encoding SafBP, was cloned using polymerase chain reaction primers based on purified proteolytic peptides. Extracts of Escherichia coli cells expressing SBP1 have strong [3H]Saf binding, which, like binding to the native maize protein, is competitively inhibited by the safener dichlormid and the herbicides S-ethyl dipropylthiocarbamate, alachlor, and metolachlor. SBP1 is predicted to encode a phenolic O-methyltransferase, but SafBP does not O-methylate catechol or caffeic acid. The acquisition of its encoding gene opens experimental approaches for the evaluation of the role of SafBP in response to the relevant safeners and herbicides.

Mismatch repair in Xenopus egg extracts: DNA strand breaks act as signals rather than excision points.

In Xenopus egg extracts, DNA strand breaks (nicks) located 3' or 5' to a mismatch cause an overall 3-fold stimulation of the repair of the mismatch in circular heteroduplex DNA molecules. The increase in mismatch repair is almost entirely due to an increase in repair of the nicked strand, which is stimulated 5-fold. Repair synthesis is centered to the mismatch site, decreases symmetrically on both sides, and its position is not significantly altered by the presence of the nick. Therefore, it appears that in the Xenopus germ cells, the mismatch repair system utilizes nicks as signals for the induction and direction of mismatch repair, but not as the start or end point for excision and resynthesis.

An inhibitor of p34cdc2/cyclin B that regulates the G2/M transition in Xenopus extracts.

The activity of maturation-promoting factor (MPF), a protein kinase complex composed of p34cdc2 and cyclin B, is undetectable during interphase but rises abruptly at the G2/M transition to induce mitosis. After the synthesis of cyclin B, the suppression of MPF activity before mitosis has been attributed to the phosphorylation of p34cdc2 on sites (threonine-14 and tyrosine-15) that inhibit its catalytic activity. We previously showed that the activity of the mitotic p34cdc2/cyclin B complex is rapidly suppressed when added to interphase Xenopus extracts that lack endogenous cyclin B. Here we show that a mutant of p34cdc2 that cannot be inhibited by phosphorylation (threonine-14-->alanine, tyrosine-15-->phenylalanine) is also susceptible to inactivation, demonstrating that inhibitory mechanisms independent of threonine-14 and tyrosine-15 phosphorylation must exist. We have partially characterized this inhibitory pathway as one involving a reversible binding inhibitor of p34cdc2/cyclin B that is tightly associated with cell membranes. Kinetic analysis suggests that this inhibitor, in conjunction with the kinases that mediate the inhibitory phosphorylations on p34cdc2, maintains the interphase state in Xenopus; it may play an important role in the exact timing of the G2/M transition.

Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens.

The virulence (vir) genes of Agrobacterium tumefaciens are induced by low-molecular-weight phenolic compounds and monosaccharides through a two-component regulatory system consisting of the VirA and VirG proteins. However, it is not clear how the phenolic compounds are sensed by the VirA/VirG system. We tested the vir-inducing abilities of 15 different phenolic compounds using four wild-type strains of A. tumefaciens--KU12, C58, A6, and Bo542. We analyzed the relationship between structures of the phenolic compounds and levels of vir gene expression in these strains. In strain KU12, vir genes were not induced by phenolic compounds containing 4'-hydroxy, 3'-methoxy, and 5'-methoxy groups, such as acetosyringone, which strongly induced vir genes of the other three strains. On the other hand, vir genes of strain KU12 were induced by phenolic compounds containing only a 4'-hydroxy group, such as 4-hydroxyacetophenone, which did not induce vir genes of the other three strains. The vir genes of strains KU12, A6, and Bo542 were all induced by phenolic compounds containing 4'-hydroxy and 3'-methoxy groups, such as acetovanillone. By transferring different Ti plasmids into isogenic chromosomal backgrounds, we showed that the phenolic-sensing determinant is associated with Ti plasmid. Subcloning of Ti plasmid indicates that the virA locus determines which phenolic compounds can function as vir gene inducers. These results suggest that the VirA protein directly senses the phenolic compounds for vir gene activation.

Selenophosphate synthetase: detection in extracts of rat tissues by immunoblot assay and partial purification of the enzyme from the archaean Methanococcus vannielii.

In Escherichia coli and Salmonella typhimurium it has been shown that selenophosphate serves as the selenium donor for the conversion of seryl-tRNA to selenocysteyl-tRNA and for the synthesis of 2-selenouridine, a modified nucleoside present in tRNAs. Although selenocysteyl-tRNA also is formed in eukaryotes and is used for the specific insertion of selenocysteine into proteins, the precise mechanism of its biosynthesis from seryl-tRNA in these systems is not known. Because selenophosphate is extremely oxygen labile and difficult to identify in biological systems, we used an immunological approach to detect the possible presence of selenophosphate synthetase in mammalian tissues. With antibodies elicited to E. coli selenophosphate synthetase the enzyme was detected in extracts of rat brain, liver, kidney, and lung by immunoblotting. Especially high levels were detected in Methanococcus vannielii, a member of the domain Archaea, and the enzyme was partially purified from this source. It seems likely that the use of selenophosphate as a selenium donor is widespread in biological systems.

Antitumor promotion by phenolic antioxidants: inhibition of AP-1 activity through induction of Fra expression.

Induction of phase 2 detoxification enzymes by phenolic antioxidants can account for prevention of tumor initiation but cannot explain why these compounds inhibit tumor promotion. Phase 2 genes are induced through an antioxidant response element (ARE). Although the ARE resembles an AP-1 binding site, we show that the major ARE binding and activating protein is not AP-1. Interestingly, AP-1 DNA binding activity was induced by the phenolic antioxidant tert-butylhydroquinone (BHQ), but the induction of AP-1 transcriptional activity by the tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) was inhibited by this compound. BHQ induced expression of c-jun, junB, fra-1, and fra-2, which encode AP-1 components, but was a poor inducer of c-fos and had no effect on fosB. Like c-Fos and FosB, the Fra proteins heterodimerize with Jun proteins to form stable AP-1 complexes. However, Fra-containing AP-1 complexes have low transactivation potential. Furthermore, Fra-1 repressed AP-1 activity induced by either TPA or expression of c-Jun and c-Fos. We therefore conclude that inhibitory AP-1 complexes composed of Jun-Fra heterodimers, induced by BHQ, antagonize the transcriptional effects of the tumor promoter TPA, which are mediated by Jun-Fos heterodimers. Since AP-1 is an important mediator of tumor promoter action, these findings may explain the anti-tumor-promoting activity of phenolic antioxidants.

Propriedades de soluções filmogênicas e de filmes de gelatina ou colágeno com extrato de boldo-do-Chile

Filmes à base de biopolímeros podem ser utilizados para produção de embalagens ativas, que além de proteger os alimentos, podem interagir com o produto. No caso de embalagens ativas com atividade antioxidante, tem-se privilegiado o uso de agentes antioxidantes naturais, considerando-se que o uso de antioxidantes sintéticos tem sido questionado, sobretudo em relação à sua inocuidade. Existem muitos extratos de plantas já conhecidos por sua atividade antioxidante, que têm sido utilizados com frequência em estudos de filmes à base de biopolímeros, não somente por serem ricos em polifenóis, mas principalmente por sua boa interação com a matriz polimérica. O extrato de boldo-do-Chile (Peumus boldus) possui atividade antioxidante comprovada, entretanto, não existem relatos sobre sua adição em filmes. Dessa forma, o objetivo geral desta tese foi o desenvolvimento de filmes à base de colágeno ou gelatina adicionados de extrato de boldo-do-Chile, com propriedades físicas e funcionais para seu emprego como embalagens bioativas. Foram realizadas as caracterizações (fenólicos totais, ABTS, DPPH, cor, °Brix e pH) do extrato aquoso de boldo-do-Chile, preparado em quatro diferentes temperaturas. Além disso, foram avaliadas as propriedades reológicas e térmicas da solução de gelatina, e também foram elaborados filmes com as soluções de gelatina e colágeno a partir de soluções filmogênicas com diferentes concentrações de macromoléculas e extrato de boldo. Esses filmes foram caracterizados para conhecimento de suas propriedades mecânicas (tração e perfuração), propriedades óticas (cor e opacidade), espessura, umidade e solubilidade em água. Uma concentração de macromoléculas foi escolhida para a realização de análises complementares, a saber: análises térmicas (DSC), cristalinidade por difração de raio X (DRX), permeabilidade ao vapor de água (PVA), microscopia eletrônica de varredura (MEV), brilho, espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), ângulo de contato, propriedades de barreira UV/Visível e atividade antioxidante. A adição do extrato de boldo-do-Chile nos filmes de gelatina e colágeno produziu filmes com atividade antioxidante, sem prejuízo às demais propriedades estudadas. Observou-se que o extrato aquoso de boldo-do-Chile apresentou propriedades antioxidantes, mas que foram dependentes da temperatura de extração. O extrato de boldo-do-Chile foi capaz de modificar as propriedades térmicas das soluções filmogênicas de gelatina, não sendo observado efeito nas análises reológicas. Por outro lado, o extrato aquoso de boldo-do-Chile não influenciou as propriedades mecânicas, solubilidade, umidade, cristalinidade e a permeabilidade ao vapor de água dos filmes de gelatina ou colágeno. Algumas propriedades térmicas sofreram efeito dos extratos, mas as análises de FTIR não mostraram a formação de novas interações. As propriedades óticas e de barreira UV/Visível foram influenciadas pelo extrato de boldo-do-Chile, sendo que os filmes se apresentaram mais amarelados com o aumento da concentração do extrato de boldo-do-Chile. As micrografias mostraram filmes de gelatina bastante homogêneos e filmes de colágeno com superfícies mais rugosas. Os resultados de brilho e ângulo de contato corroboraram com estas respostas. Em conclusão, os filmes de ambas macromoléculas apresentaram atividade antioxidante, podendo dessa forma, serem considerados como filmes ativos.

Extração de oleuropeína de folhas de oliva com solvente hidroalcoólico e efeito dos extratos sobre a estabilidade oxidativa de óleos vegetais

A oleuropeína é o composto fenólico mais abundante presente nas folhas da oliveira, sendo que muitos estudos vêm demonstrando que este composto apresenta importantes propriedades antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, entre outras, surgindo o interesse em estudos de métodos para sua extração e aplicação em produtos na área alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo deste estudo foi a extração da oleuropeína à partir de folhas de oliva, utilizando solvente não tóxico, para posterior aplicação dos extratos em óleos vegetais a fim de se verificar seu efeito sobre a estabilidade oxidativa dos mesmos. O solvente selecionado para o estudo foi uma mistura de etanol e água (70:30, em massa, condição obtida através de um trabalho prévio), na presença de 1 % de ácido acético. Em uma primeira etapa, foram realizados experimentos de extração utilizando-se as técnicas de maceração (tipo I) e ultrassom (tipo II), em diferentes condições de temperatura (20, 30, 40, 50 e 60°C). Em uma segunda etapa, através de experimentos com maceração à temperatura ambiente, estudou-se o efeito da razão folhas:solvente (1:8, 1:6 e 1:3) e a influência da presença de ácido acético sobre o processo de extração (tipo III). Por fim, realizando-se a maceração na presença de ácido acético, temperatura ambiente e proporção folhas: solvente igual a 1:3, realizaram-se extrações sequenciadas a partir de uma mesma matéria-prima (tipo IV). Os resultados desses experimentos foram expressos em rendimento de oleuropeína (RO), teor de oleuropeína nos extratos (TO) e rendimento global (RG). Analisando-se os experimentos I e II, verificou-se que a temperatura não exerceu influência significativa sobre as respostas RO, TO e RG. Além disso, verificou-se que os valores das respostas para os experimentos com a maceração foram um pouco maiores do que os valores obtidos para as extrações com o auxílio do ultrassom. Nos experimentos tipo III, em linhas gerais, observou-se a influência positiva da presença do ácido acético sobre as respostas estudadas. Verificou-se também que, na presença de ácido, o aumento da quantidade de solvente na extração conduz ao aumento de RO e RG, e à diminuição de TO. Através do experimento tipo IV, constatou-se que mesmo após quatro extrações sequenciadas, ainda não foi possível esgotar a oleuropeína da matéria-prima. Após a obtenção de todos os extratos hidroalcoólicos, selecionou-se um contendo aproximadamente 19 % de oleuropeína para o estudo da estabilidade oxidativa em óleos vegetais (oliva e girassol) utilizando o método Rancimat. A presença de extrato aumentou em 3 horas o tempo de indução do azeite de oliva extra-virgem, e em 2 horas o tempo de indução do azeite de oliva comum. Os óleos de girassol bruto e refinado não apresentaram melhora na estabilidade oxidativa quando adicionados dos extratos. Foram realizados também testes de estabilidade oxidativa através da adição direta de folhas de oliva em pó nos azeites de oliva extra-virgem e comum. Para o azeite extra-virgem, a adição das folhas não proporcionou melhora da estabilidade oxidativa, porém para o azeite comum, houve um aumento de mais de 2 horas no tempo de indução.Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que é possível obter extratos contendo teores significativos de oleuropeína utilizando-se um solvente renovável. Além disso, constatou-se que os mesmos podem ser utilizados como um antioxidante natural em azeite de oliva, melhorando sua estabilidade oxidativa.

Compostos fenólicos de resíduos agroindustriais: identificação, propriedades biológicas e aplicação em matriz alimentar de base lipídica

A geração de resíduos sólidos pelas atividades agroindustriais tem criado a demanda por um reaproveitamento tecnológico desses materiais. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial bioativo e tecnológico de resíduos agroindustriais, como fontes naturais de compostos fenólicos com atividade antioxidante. Foram analisados resíduos agroindustriais vinícolas, de indústrias produtoras de polpas congeladas de frutas (açaí, cajá, cupuaçu e graviola) e provenientes do beneficiamento de café e de laranja. Inicialmente, foi realizado um estudo para a determinação das condições ótimas de extração, empregando planejamento experimental multivariado com delineamento composto central rotacional, cujos resultados foram avaliados empregando a técnica de superfície de resposta. Na sequência, foram feitos a triagem dos resíduos, baseada na atividade antioxidante, e a caracterização fenólica dos extratos hidroalcoólicos obtidos dos resíduos agroindustriais. De acordo com os resultados de atividade antioxidante, engaço de uva da variedade Chenin Blanc (EC) e semente de açaí (SA) foram os resíduos selecionados, os quais seguiram para as etapas de concentração e fracionamento bioguiado de sua(s) molécula(s) bioativa(s), as quais foram posteriormente identificadas por UHPLC-ESI-LTQ-MS. Extratos brutos e concentrados foram avaliados in vitro quanto à capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio (radicais peroxila, ânion superóxido e ácido hipocloroso) e então, aplicados em óleo de soja, emulsão e suspensão de lipossomos, a fim de se avaliar a efetividade desses extratos como antioxidante natural em matrizes lipídicas. Concentrações intermediárias de etanol (40-60%) e alta temperatura (96°C), exceto para semente de açaí (25°C), foram as condições ótimas para a extração de antioxidantes dos resíduos agroindustriais. Epicatequina, ácido gálico, catequina e procianidina B1 foram os compostos de maior ocorrência, quando avaliados pela técnica de HPLC-DAD. O EC apresentou a maior atividade antioxidante global e SA a maior atividade entre os resíduos de polpas de frutas, laranja e café. A concentração dos extratos brutos de EC e SA, pela resina Amberlite XAD®-2, produziu aumento significativo da atividade antioxidante. Além disso, extratos brutos e concentrados apresentaram atividade antiproliferativa e anti-inflamatória. Os extratos concentrados foram fracionados por meio de Sephadex LH-20, a partir da qual foi possível identificar quatro frações de maior bioatividade para o EC e três para o SA. Procianidina B1, catequina, epicatequina e resveratrol foram identificados no extrato concentrado e frações de EC. Dezoito procianidinas poliméricas, catequina, epicatequina foram os principais compostos identificados em SA, por meio de UHPLC-ESI-LTQ-MS. Resveratrol também foi encontrado em SA pela primeira vez. Quando avaliados em óleo de soja, EC e SA demonstraram atividade pro-oxidante. Contudo, elevada atividade antioxidante foi verificada quando essas amostras foram aplicadas em sistemas lipídicos coloidais, pois retardaram o consumo de oxigênio em uma emulsão óleo/água e o período de indução na produção de dienos conjugados em uma suspensão de lipossomos. Portanto, os resíduos agroindustriais EC e SA possuem potencial tecnológico de reaproveitamento industrial podendo ser considerados possíveis matérias-primas para a obtenção de extratos ricos em antioxidantes ou pela extração de antioxidantes naturais de uso pelas indústrias farmacêutica e/ou de alimentos.

Microwave-Assisted Extraction of Phenolic Compounds from Almond Skin Byproducts (Prunus amygdalus): A Multivariate Analysis Approach

A microwave-assisted extraction (MAE) procedure to isolate phenolic compounds from almond skin byproducts was optimized. A three-level, three-factor Box–Behnken design was used to evaluate the effect of almond skin weight, microwave power, and irradiation time on total phenolic content (TPC) and antioxidant activity (DPPH). Almond skin weight was the most important parameter in the studied responses. The best extraction was achieved using 4 g, 60 s, 100 W, and 60 mL of 70% (v/v) ethanol. TPC, antioxidant activity (DPPH, FRAP), and chemical composition (HPLC-DAD-ESI-MS/MS) were determined by using the optimized method from seven different almond cultivars. Successful discrimination was obtained for all cultivars by using multivariate linear discriminant analysis (LDA), suggesting the influence of cultivar type on polyphenol content and antioxidant activity. The results show the potential of almond skin as a natural source of phenolics and the effectiveness of MAE for the reutilization of these byproducts.

Extracts made from the records of the Humane Society, 1800

Contains notes from Humane Society meeting discussions relating to the construction of a bath on the Charles River to prevent bathing accidents. In November 1800, four hundred dollars from the Society was allotted to Harvard College Steward Caleb Gannett toward this project.

Sundry extracts on the subject of the taxation of College &c., ca. 1798-1801

Notebook with brown paper cover containing handwritten extracts from the charters and related legislation of New England academic, charitable, and commercial institutions regarding their ability to hold real estate and related tax exemptions. Most of the listed documents are dated in the 1780s and 1790s. The notebook also contains extracts from "Argument in the case of Poor's rate, charged on the College of Christ & Emmanuel in the University of Cambridge 1768." The item title is transcribed from a handwritten inscription on the back cover.