Nuovo copoliestere alifatico del PBS da fonte rinnovabile biocompatibile e bioriassorbibile per impiego nell’ Ingegneria dei tessuti molli

L’enorme progresso nel campo della biologia cellulare ha consentito lo sviluppo di tecnologie per la ricostruzione in vitro di tessuti, definendo una nuova branca di scienze biomediche: l’ingegneria dei tessuti. Tra le sue numerose applicazioni, la riparazione del tessuto cardiaco infartuato rappresenta un’importante obiettivo. Tra i polimeri sintetici sperimentati per questa applicazione, il poli(butilene succinato) (PBS) rappresenta un ottimo candidato. Nonostante i promettenti risultati già ottenuti dal punto di vista di biodegradabilità e biocompatibilità, il PBS presenta proprietà meccaniche poco adatte a questo impiego: l’applicazione miocardica richiede particolari caratteristiche di modulo di Young (E) e un ritorno elastico comparabile a quello del miocardio. Al fine di conferire al PBS proprietà meccaniche funzionali all’MTE (Miocardial Tissue Engineering), in questa Tesi è stato sintetizzato e caratterizzato un nuovo copolimero statistico a base di PBS contenente subunità Pripol 1009, un diacido prodotto dalla Croda, biobased e biodegradabile. Sono stati preparati film attraverso pressofusione e scaffold tramite elettrofilatura. Oltre alla caratterizzazione molecolare, volta a determinare il peso molecolare, la struttura e la composizione, film e scaffold sono stati sottoposti anche ad analisi termica, diffrattometrica, meccanica e a studi di degradazione idrolitica in condizioni fisiologiche. I risultati ottenuti hanno evidenziato che l’inserimento di segmenti Pripol all’interno della catena polimerica ha portato, oltre che a un incremento della stabilità termo-ossidativa, anche a un importante miglioramento delle proprietà meccaniche: il materiale sintetizzato, sia sotto forma di film che di scaffold, possiede le caratteristiche di elastomero termoplastico che lo rendono adatto ad applicazioni nell’ingegneria tissutale. Da ultimo, rispetto al PBS, il copolimero statistico mostra una maggiore velocità di degradazione in condizioni fisiologiche.

Electrospun scaffolds for regeneration of musculoskeletal interface tissues

L’apparato muscolo scheletrico è composto da strutture muscolari, articolari e ossee. Tali tessuti sono molto diversi tra loro e hanno proprietà meccaniche estremamente variabili, pertanto presentano una transizione graduale in corrispondenza della loro giunzione, onde evitare l’insorgere di concentrazioni di tensione. L’evoluzione ha portato alla formazione di particolari interfacce che permettono la corretta trasmissione dei carichi distribuendo le tensioni su una superficie più ampia in corrispondenza della giunzione. Le interfacce che vanno a inserirsi nell’osso vengono definite entesi e in particolare, in questa review, analizzeremo il caso di quelle tra tendini/legamenti e osso. In questo lavoro ci siamo anche concentrati sulla giunzione miotendinea, ovvero tra muscolo e tendine. Sono numerose le lesioni che riguardano muscoli, ossa, tendini o legamenti e molto spesso l’infortunio avviene a livello della giunzione. Quando ciò accade vi sono diverse strade, ciascuna con i suoi vantaggi e svantaggi: sutura, autograft, allograft o xenograft. Oltre a queste soluzioni si è fatta gradualmente più spazio la possibilità di realizzare degli scaffold che vadano temporaneamente a sostituire la parte danneggiata e a promuovere la sua rigenerazione, degradandosi man mano. L’elettrofilatura (Elettrospinning) è un processo produttivo che negli ultimi decenni si è affermato come tecnica per la fabbricazione di questi scaffold, fino a diventare uno tra i principali processi utilizzati dai ricercatori in questo campo. Questa tecnica infatti permette di realizzare scaffold di nanofibre porose utilizzando polimeri biodegradabili e soprattutto biocompatibili. Lo scopo della review è proprio quello di scoprire tutti i lavori e gli studi che utilizzano l’elettrofilatura per realizzare degli scaffold per interfacce, delineando così lo stato dell’arte sui progressi fatti e sulle varie tecniche utilizzate.

Biomateriali per la somministrazione di vaccini per la terapia immuno-oncologica

Il cancro è una delle principali cause di morte al mondo. Nel 2019, solo negli Stati Uniti, i nuovi casi di cancro sono stati 1.762.450 con 606.880 decessi. Ad oggi, sono numerosi gli studi interdisciplinari in atto aventi come fine ultimo quello di trovare una cura per il cancro più efficiente ed efficace di quelle tradizionali. La seguente trattazione descrive una soluzione che coniuga le conoscenze mediche del campo immuno-terapico con quelle ingegneristiche del settore dei biomateriali. Nello specifico, vengono analizzati scaffold e nanoparticelle biomateriali utilizzati per la somministrazione di vaccini contro il cancro. Gli obiettivi principali, infatti, risultano essere il raggiungimento di una memoria immunitaria, per contrastare metastasi e ricadute, e la diminuzione degli effetti collaterali che i pazienti oncologici sono costretti a sopportare sottoponendosi alle terapie convenzionali. I risultati mostrano dati molto promettenti, poiché l’utilizzo combinato dei biomateriali con fattori caratterizzanti il sistema immunitario permette di ottenere vaccini somministrabili in maniera sicura, seppur le indagini cliniche per molte tipologie di cancro siano ancora in atto.

Novel hydroxystearoyl-, heterocyclic and carbocyclic derivatives: synthesis and applications in biological field

This PhD project has been mainly focused on the synthesis of novel organic compounds containing heterocyclic and/or carbocyclic scaffold and on the study of stearic acid derivatives and their applications in biological field. The synthesis of novel derivatives of 9-hydroxystearic acid (9-HSA) evidenced how the presence of substituents on C9, able to make hydrogen bonds is of crucial importance for the biological activity. Also the position of the hydroxy group along the chain of hydroxystearic acids was investigated: regioisomers with the hydroxy group bound to odd carbons resulted more active than those bearing the hydroxy group on even carbons. Further, the insertion of (R)-9-HSA in magnetic nanoparticles gave a novel material which characterization remarked its suitability for drug delivery. Structural hybrids between amino aza-heterocycles and azelaic acid have been synthesized and some of them showed a selective activity towards osteosarcoma cell line U2OS. Several Apcin analogues bearing indole, benzothiazole, benzofurazan moieties connected to tryptaminyl-, amino pyridinyl-, pyrimidinyl- and pyrazinyl ring through a 1,1,1-trichloroethyl group were synthesized. Biological tests showed the importance of both the tryptaminyl and the pyrimidinyl moieties, confirming the effectiveness against acute leukemia models. The SNAr between 2-aminothiazole derivatives and 7-chlorodinitrobenzofuroxan revealed different behaviour depending from amino substituent of the thiazole. The reaction with 2-N-piperidinyl-, 2-N-morpholinyl-, or 2-N-pyrrolidinyl thiazole gave two isomeric species derived from the attack on C-5 of thiazole ring. Thiazoles substituted with primary- or not-cyclic secondary amines reacted with the exocyclic amino nitrogen atom giving a series of compounds whose biological activity have highlighted as they might be promising candidates for further development of antitumor agents. A series of 9-fluorenylidene derivatives, of interest in medical and optoelectronic field as organic scintillators, was synthesized through Wittig or Suzuky reaction and will be analyzed to test their potential scintillatory properties.

Advanced cell culture platforms: methods for drug testing with microfluidics and microstructured devices

Advanced cell cultures are developing rapidly in biomedical research. Nowadays, various approaches and technologies are being used, however, these culturing systems present limitations from increasing complexity, requiring high costs, and not easily customization. We present two versatile and cost-effective methods for developing culturing systems that integrate 3D cell culture and microfluidic platforms. Firstly, for drug screening applications, many high-quality cell spheres of homogeneous size and shape are required. Conventional approaches usually have a dearth of control over the size and geometry of cell spheres and require sample collection and manipulation. To overcome this difficulty, in this study, hundreds of spheroids of several cell lines were generated using multi-well plates that housed our microdevices. Tumor spheroids grow at a uniform rate (in scaffolded or scaffold-free environments) and can be harvested at will. Microscopy imaging are done in real time during or after the culture. After in situ immunostaining, fluorescence imaging can be conducted while keeping the spatial distribution of spheroids in the microwells. Drug effects were successfully observed through viability, growth, and morphologic investigations. Also, we fabricated a microfluidic device suitable for directed and selective cell culture treatments. The microfluidic device was used to reproduce and confirm in vitro investigations carried out using normal culture methods, using a microglia cell line. The device layout and the syringe pump system, entirely designed in our lab, successfully allowed culture growth and medium flow regulation. Solution flows can be finely controlled, allowing treatments and immunofluorescence in one single chamber selectively. To conclude, we propose the development of two culturing platforms (microstructured well devices and in-flow microfluidic chip), which are the result of separate scientific investigations but have the primary goal of performing treatments in a reproducible manner. Our devices shall improve future studies on drug exposure testing, representing adjustable and versatile cell culture systems.

Design and synthesis of E3 ligase RNF5 inhibitors as innovative strategy to trigger mutant CFTR rescue in Cystic Fibrosis

In Cystic Fibrosis (CF) the deletion of phenylalanine 508 (F508del) in the CFTR anion channel is associated to misfolding and defective gating of the mutant protein. Among the known proteins involved in CFTR processing, one of the most promising drug target is the ubiquitin ligase RNF5, which normally promotes F508del-CFTR degradation. In this context, a small molecule RNF5 inhibitor is expected to chemically mimic a condition of RNF5 silencing, thus preventing mutant CFTR degradation and causing its stabilization and plasma membrane trafficking. Hence, by exploiting a virtual screening (VS) campaign, the hit compound inh-2 was discovered as the first-in-class inhibitor of RNF5. Evaluation of inh-2 efficacy on CFTR rescue showed that it efficiently decreases ubiquitination of mutant CFTR and increases chloride current in human primary bronchial epithelia. Based on the promising biological results obtained with inh-2, this thesis reports the structure-based design of potential RNF5 inhibitors having improved potency and efficacy. The optimization of general synthetic strategies gave access to a library of analogues of the 1,2,4-thiadiazol-5-ylidene inh-2 for SAR investigation. The new analogues were tested for their corrector activity in CFBE41o- cells by using the microfluorimetric HS-YFP assay as a primary screen. Then, the effect of putative RNF5 inhibitors on proliferation, apoptosis and the formation of autophagic vacuoles was evaluated. Some of the new analogs significantly increased the basal level of autophagy, reproducing RNF5 silencing effect in cell. Among them, one compound also displayed a greater rescue of the F508del-CFTR trafficking defect than inh-2. Our preliminary results suggest that the 1,2,4-thiadiazolylidene could be a suitable scaffold for the discovery of potential RNF5 inhibitors able to rescue mutant CFTRs. Biological tests are still ongoing to acquire in-depth knowledge about the mechanism of action and therapeutic relevance of this unprecedented pharmacological strategy.

Electrospun hierarchical artificial muscle for soft robotics applications

Nowadays, one of the most ambitious challenges in soft robotics is the development of actuators capable to achieve performance comparable to skeletal muscles. Scientists have been working for decades, inspired by Nature, to mimic both their complex structure and their perfectly balanced features in terms of linear contraction, force-to-weight ratio, scalability and flexibility. The present Thesis, contextualized within the FET open Horizon 2020 project MAGNIFY, aims to develop a new family of innovative flexible actuators in the field of soft-robotics. For the realization of this actuator, a biomimetic approach has been chosen, drawing inspiration from skeletal muscle. Their hierarchical fibrous structure was mimicked employing the electrospinning technique, while the contraction of sarcomeres was designed employing chains of molecular machines, supramolecular systems capable of performing movements useful to execute specific tasks. The first part deals with the design and production of the basic unit of the artificial muscle, the artificial myofibril, consisting in a novel electrospun core-shell nanofiber, with elastomeric shell and electrically conductive core, coupled with a conductive coating, for the realization of which numerous strategies have been investigated. The second part deals instead with the integration of molecular machines (provided by the project partners) inside these artificial myofibrils, preceded by the study of several model molecules, aimed at simulating the presence of these molecular machines during the initial phases of the project. The last part concerns the realization of an electrospun multiscale hierarchical structure, aimed at reproducing the entire muscle morphology and fibrous organization. These research will be joined together in the near future like the pieces of a puzzle, recreating the artificial actuator most similar to biological muscle ever made, composed of millions of artificial myofibrils, electrically activated in which the nano-scale movement of molecular machines will be incrementally amplified to the macro-scale contraction of the artificial muscle.

Analytical approaches for the measurement of sulfide in biological and pharmaceutical fields

Hydrogen sulfide (H2S) is a widely recognized gasotransmitter, with key roles in physiological and pathological processes. The accurate quantification of H2S and reactive sulfur species (RSS) may hold important implications for the diagnosis and prognosis of various diseases. However, H2S species quantification in biological matrices is still a challenge. Among the sulfide detection methods, monobromobimane (MBB) derivatization coupled with reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) is one of the most reported. However, it is characterized by a complex preparation and time-consuming process, which may alter the actual H2S level. Moreover, quantitative validation has still not been described based on a survey of previously published works. In this study, we developed and validated an improved analytical protocol for the MBB RP-HPLC method. Main parameters like MBB concentration, temperature, reaction time, and sample handling were optimized, and the calibration method was further validated using leave-one-out cross-validation (CV) and tested in a clinical setting. The method shows high sensitivity and allows the quantification of H2S species, with a limit of detection (LOD) of 0.5 µM and a limit of quantification (LOQ) of 0.9 µM. Additionally, this model was successfully applied in measurements of H2S levels in the serum of patients subjected to inhalation with vapors rich in H2S. In addition, a properly procedure was established for H2S release with the modified MBB HPLC-FLD method. The proposed analytical approach demonstrated the slow-release kinetics of H2S from the multilayer Silk-Fibroin scaffolds with the combination of different H2S donor’s concentration with respect to the weight of PLGA nanofiber. In the end, some efforts were made on sulfide measurements by using size exclusion chromatography fluorescence/ultraviolet detection and inductively coupled plasma-mass spectrometry (SEC-FLD/UV-ICP/MS). It’s intended as a preliminary study in order to define the feasibility of a separation-detection-quantification platform to analyze biological samples and quantify sulfur species.

A 3D biomimetic in vitro model: a novel strategy to investigate glioma biology

Gliomas are one of the most frequent primary malignant brain tumors. Acquisition of stem-like features likely contributes to the malignant nature of high-grade gliomas and may be responsible for the initiation, growth, and recurrence of these tumors. In this regard, although the traditional 2D cell culture system has been widely used in cancer research, it shows limitations in maintaining the stemness properties of cancer and in mimicking the in vivo microenvironment. In order to overcome these limitations, different three-dimensional (3D) culture systems have been developed to mimic better the tumor microenvironment. Cancer cells cultured in 3D structures may represent a more reliable in vitro model due to increased cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Several attempts to recreate brain cancer tissue in vitro are described in literature. However, to date, it is still unclear which main characteristics the ideal model should reproduce. The overall goal of this project was the development of a 3D in vitro model able to reproduce the brain ECM microenvironment and to recapitulate pathological condition for the study of tumor stroma interactions, tumor invasion ability, and molecular phenotype of glioma cells. We performed an in silico bioinformatic analysis using GEPIA2 Software to compare the expression level of seven matrix protein in the LGG tumors with healthy tissues. Then, we carried out a FFPE retrospective study in order to evaluate the percentage of expression of selected proteins. Thus, we developed a 3D scaffold composed by Hyaluronic Acid and Collagen IV in a ratio of 50:50. We used two astrocytoma cell lines, HTB-12 and HTB-13. In conclusion, we developed an in vitro 3D model able to reproduce the composition of brain tumor ECM, demonstrating that it is a feasible platform to investigate the interaction between tumor cells and the matrix.

Inhibition and characterization of two-metal ion enzymes to treat cancer: dna polymerase Ƞ and topoisomerase II α

Chemotherapeutic drugs can in many ways disrupt the replication machinery triggering apoptosis in cancer cells: some act directly on DNA and others block the enzymes involved in preparing DNA for replication. Cisplatin-based drugs are common as first-line cancer chemotherapics. Another example is etoposide, a molecule that blocks topoisomerase II α leading to the inhibition of dsDNA replication. Despite their efficacy, cancer cells can respond to these treatments over time by overtaking their effects, leading to drug resistance. Chemoresistance events can be triggered by the action of enzymes like DNA polymerase ƞ (Pol η). This polymerase helps also to bypass drug-induced damage in cancer cells, allowing DNA replication and cancer cells proliferation even when cisplatin-based chemotherapeutic drugs are in use. Pol ƞ is a promising drug discovery target, whose inhibition would help in overcoming of drug resistance. This study aims to identify a potent and selective Pol ƞ inhibitor able to improve the efficacy of platinum-based chemotherapeutic drugs. We report the discovery of compound 64 (ARN24964), after an extensive SAR reporting 35 analogs. We evaluated compound 64 on four different cell lines. Interestingly, the molecule is a Pol η inhibitor able to act synergistically with cisplatin. Moreover, we also synthesized a prodrug form that allowed us to improve its stability and the bioavailability. This compound represents an advanced scaffold featuring good potency and DMPK properties. In addition to this central theme, this thesis also describes our efforts in developing and characterize a novel hybrid inhibitor/poison for the human topoisomerase II α enzyme. In particular, we performed specific assays to study the inhibiton of Topoisomesare II α and we evaluated compounds effect on three cancer cell lines. These studies allowed us to identify a compound that is able to inhibit the enzyme with a good pK and a good potency.

Low-molecular-weight gels: from the rational design to the application of versatile soft materials

Low-molecular-weight (LMW) gels are a versatile class of soft materials that gained increasing interest over the last few decades. They are made of a small percentage, often lower than 1.0 %, of organic molecules called gelators, dispersed in a liquid medium. Such molecules have a molecular weight usually lower than 1 kDa. The gelator molecules start to interact after the addition of a trigger, and form fibres, whose entanglement traps the solvent through capillary forces. A plethora of LMW gelators have been designed, including short peptides. Such gelators present several advantages: the synthesis is easy and can be easily scaled up; they are usually biocompatible and biodegradable; the gelation phenomenon can be rationalised by making small variation on the peptide scaffold; they find application in several fields. In this thesis, an overview of several peptide based LMW gels is presented. In each study, the gelation conditions were carefully studied, and the final materials were thoroughly investigated. First, the gelation ability of a fluorinated phenylalanine was assessed, to understand how the presence of a rigid moiety and the presence of fluorine may influence the gelation. In this context, a method for the dissolution of sensitive gelators was studied. Then, the control over the gel formation was studied both over time and space, taking advantage of either the pH-annealing of the gel or the reaction-diffusion of a hydrolysing reagent. Some gels were probed for various applications. Due to their ability of trapping water and organic solvents, we used gels for trapping pollutants dissolved in water, as well as a medium for the controlled release of either fragrances or bioactive compounds. Finally, the interaction of the gel matrix with a light-responsive molecule was assessed to understand wether the gel properties or the interaction of the additive with light were affected.

Specifiche generali dei biomateriali di interesse per l'ingegneria dei tessuti del distretto uterino

Lo scopo di questa trattazione è quello di fornire una panoramica sui metodi di ingegnerizzazione dell’utero ad oggi sperimentati. L’obiettivo degli studi qui analizzati è quello di creare in vitro uno scaffold per l’utero umano con adeguate caratteristiche strutturali e determinati componenti al fine di permettere ai tessuti vicini di rigenerarsi e per poterne studiare le proprietà in vivo. Gli scaffold analizzati sono a base di collagene, fatti di materiali sintetici o costituiti dalle dECM. Per effettuare la decellularizzazione delle ECM sono stati impiegati detergenti come SDS e Triton X-100 o alta pressione idrostatica. Le impalcature realizzate sono state poi valutate per quanto riguarda le proprietà istologiche, IHC, strutturali e meccaniche e tramite angiografia è stata esaminata la conservazione delle reti vascolari negli scaffold dECM. I risultati hanno confermato l'efficacia del protocollo di decellularizzazione tramite HHP o l’utilizzo combinato di SDS e Triton X-100 per fornire scaffold dell’utero con caratteristiche e componenti della ECM simili all'utero nativo. Per quanto riguarda i materiali sintetici, i polimeri sono risultati particolarmente idonei date le loro caratteristiche, quali elevata porosità e proprietà biomeccaniche regolabili; per i materiali naturali invece, il collagene è stato quello più utilizzato e che ha portato ad ottimi risultati, anche in quanto componente principale dell’ECM. Gli studi in vivo hanno poi dimostrato la biocompatibilità e il potenziale rigenerativo degli scaffold e hanno suggerito un percorso di segnalazione come meccanismo di base per il processo rigenerativo. Tra i vari studi è stato analizzato anche il primo protocollo di decellularizzazione efficiente basato sulla perfusione per ottenere scaffold dell’intero utero umano. I risultati raccolti potrebbero essere impiegati in futuri studi di ingegneria del tessuto uterino umano che potrebbero portare allo sviluppo di nuovi trattamenti per pazienti sterili.

Analysis of the state of the art of the biofabrication strategies for the regeneration of the myotendinous junction

La giunzione miotendinea (MTJ) è una struttura anatomica specializzata che collega il muscolo al tendine. La sua funzione è quella di permettere la trasmissione della forza generata dal muscolo al tendine, permettendo il movimento. Essendo una struttura di interfaccia che funge da raccordo tra due tipi di tessuti molto differenti, tende a risentire di una forte concentrazione di tensione, questo la rende fortemente suscettibile a rottura. Le tecniche ad oggi utilizzare per riparare lesioni alla MTJ risultano inadatte ad una completa ed ottimale ripresa meccanica. Al fine di trovare una soluzione a questo problema, l’ingegneria tissutale sta lavorando alla fabbricazione di strutture tridimensionali che siano in grado di imitare al meglio la struttura nativa della MTJ. Le tecniche utilizzate per la produzione di tali strutture sono, principalmente, stampa 3D ed elettrofilatura. Il vantaggio di queste tecniche è la loro elevata risoluzione, che permette di controllare finemente l’architettura di tali strutture artificiali. Nella seguente tesi verrà presentato lo stato dell’arte sulle tecniche utilizzate per la fabbricazione di scaffolds per la rigenerazione della MTJ, soffermandosi in particolare sui metodi di fabbricazione e sulle prestazioni morfologiche, meccaniche e cellulari effettuando un confronto tra i diversi studi che se ne sono occupati, individuandone punti di forza, debolezze e possibili studi futuri che potranno essere effettuati su tali scaffolds. In questo modo, sarà possibile rendersi conto di quale di queste tecniche risulti essere più promettente per il futuro.

Mechanical characterization of 3D bioprinted meniscus

Le lesioni del menisco sono le più comuni nella società di oggi: si verificano per un trauma meccanico o per cambiamenti degenerativi nella composizione dei tessuti. In caso di rottura o danneggiamento si interviene mediante riparazione del menisco, menisectomia parziale o totale, o allotrapianto, ma tali tecniche portano a degenerazione della cartilagine articolare, aumento dello stress sull'articolazione tibiale e infiammazione. Gli impianti di sostituzione presenti in commercio non riescono a ricreare il tessuto naturale del ginocchio o a prevenire malattie degenerative della cartilagine; si cerca quindi di creare un menisco meccanicamente e chimicamente simile a quello nativo. In questo studio è realizzato, tramite stampante 3D, uno scaffold di alginato e nanocellulosa, con condrociti umani al suo interno. Le cellule sono opportunamente coltivate, raggruppate a formare sferoidi di diverse concentrazioni (5000 e 10000 cellule/sferoide) e inserite all'interno di scaffold caratterizzati rispettivamente da 4000 e 2000 sferoidi/ml di inchiostro. Le loro proprietà meccaniche, insieme a quelle del campione costituito dal solo bio-inchiostro, sono caratterizzate mediante nanoindentazione. Un'analisi statistica (0.05% di significatività), ha appurato una differenza nelle proprietà meccaniche dei campioni con diverse concentrazioni di sferoidi, e tra questi e il campione senza sferoidi. Il modulo elastico e la durezza riscontrati (kPa): E=23.97±13.05, H=3.15±1.23 nel controllo negativo, E=35.34±7.28, H=4.37±0.79 nel campione da 2000 sferoidi/ml e E=49.28±9.75, H=5.44±0.87 nel campione da 4000 sferoidi/ml. In conclusione, la formazione di agglomerati di cellule e la loro introduzione all'interno di uno scaffold è possibile ed è un buon metodo per controllare il numero di cellule inserite, in termini di sferoidi. Gli organoidi contribuiscono al modulo elastico e alla durezza del campione, determinando un incremento e una maggiore equità nelle proprietà meccaniche.

Histochemical characterization of 3D bioprinted meniscus

La cartilagine ad oggi rappresenta ancora una sfida per la medicina rigenerativa a causa della sua scarsa capacità di rigenerarsi quando sottoposta a gravi lesioni tissutali. Inoltre, la sua struttura complessa e l'ambiente biologico che offre sono ancora difficili da riprodurre con precisione mediante l’utilizzo di strutture bioartificiali e biomimetiche. Sebbene gli interventi per riparare i danni al tessuto cartilagineo siano ancora prevalentemente di stampo chirurgico, si stanno aprendo nuove strade nel campo dell'ingegneria tissutale volte a ricreare una struttura simile a quella originaria, che possa indurre la rigenerazione o sostituire direttamente il tessuto danneggiato. Lo studio condotto e discusso in questo elaborato mira a soddisfare quest'ultimo intento, ponendo le basi per un'eventuale evoluzione sperimentale della stampa del menisco. La ricerca si è basata sulla biostampa 3D di campioni di menisco, di dimensioni pari a circa 1 cm2, realizzati mediante un bioinchiostro a base di alginato e nanocellulosa, al cui interno sono stati immersi sferoidi/microtessuti di condrociti con diversa concentrazione. La stampa dei campioni è avvenuta in tre diverse condizioni: i) solo bioinchiostro, ii) bioinchiostro contenente sferoidi da 5000 cellule, iii) bioinchiostro contenente sferoidi da 10000 cellule. Al termine della stampa sono stati analizzati i campioni per verificare la sopravvivenza delle cellule e investigare l'attitudine di queste di ricreare matrice extracellulare cartilaginea nelle condizioni ambientali in cui sono state introdotte. A questo proposito, sono state eseguite delle analisi istochimiche, quali la RT-PCR e l’analisi istologica. Inoltre, a partire dalle immagini al microscopio degli sferoidi a seguito della loro formazione e dalle sezioni istologiche, sono state analizzate le dimensioni dei campioni per confrontare l'eventuale variazione volumetrica di questi prima della stampa e a seguito del processo di estrusione.