Genomic and transcriptional analysis of allergen genes in apple (Malus x domestica)

Apple consumption is highly recomended for a healthy diet and is the most important fruit produced in temperate climate regions. Unfortunately, it is also one of the fruit that most ofthen provoks allergy in atopic patients and the only treatment available up to date for these apple allergic patients is the avoidance. Apple allergy is due to the presence of four major classes of allergens: Mal d 1 (PR-10/Bet v 1-like proteins), Mal d 2 (Thaumatine-like proteins), Mal d 3 (Lipid transfer protein) and Mal d 4 (profilin). In this work new advances in the characterization of apple allergen gene families have been reached using a multidisciplinary approach. First of all, a genomic approach was used for the characterization of the allergen gene families of Mal d 1 (task of Chapter 1), Mal d 2 and Mal d 4 (task of Chapter 5). In particular, in Chapter 1 the study of two large contiguos blocks of DNA sequences containing the Mal d 1 gene cluster on LG16 allowed to acquire many new findings on number and orientation of genes in the cluster, their physical distances, their regulatory sequences and the presence of other genes or pseudogenes in this genomic region. Three new members were discovered co-localizing with the other Mal d 1 genes of LG16 suggesting that the complexity of the genetic base of allergenicity will increase with new advances. Many retrotranspon elements were also retrieved in this cluster. Due to the developement of molecular markers on the two sequences, the anchoring of the physical and the genetic map of the region has been successfully achieved. Moreover, in Chapter 5 the existence of other loci for the Thaumatine-like protein family in apple (Mal d 2.03 on LG4 and Mal d 2.02 on LG17) respect the one reported up to now was demonstred for the first time. Also one new locus for profilins (Mal d 4.04) was mapped on LG2, close to the Mal d 4.02 locus, suggesting a cluster organization for this gene family, as is well reported for Mal d 1 family. Secondly, a methodological approach was used to set up an highly specific tool to discriminate and quantify the expression of each Mal d 1 allergen gene (task of Chapter 2). In aprticular, a set of 20 Mal d 1 gene specific primer pairs for the quantitative Real time PCR technique was validated and optimized. As a first application, this tool was used on leaves and fruit tissues of the cultivar Florina in order to identify the Mal d 1 allergen genes that are expressed in different tissues. The differential expression retrieved in this study revealed a tissue-specificity for some Mal d 1 genes: 10/20 Mal d 1 genes were expressed in fruits and, indeed, probably more involved in the allergic reactions; while 17/20 Mal d 1 genes were expressed in leaves challenged with the fungus Venturia inaequalis and therefore probably interesting in the study of the plant defense mechanism. In Chapter 3 the specific expression levels of the 10 Mal d 1 isoallergen genes, found to be expressed in fruits, were studied for the first time in skin and flesh of apples of different genotypes. A complex gene expression profile was obtained due to the high gene-, tissue- and genotype-variability. Despite this, Mal d 1.06A and Mal d 1.07 expression patterns resulted particularly associated with the degree of allergenicity of the different cultivars. They were not the most expressed Mal d 1 genes in apple but here it was hypotized a relevant importance in the determination of allergenicity for both qualitative and quantitative aspects of the Mal d 1 gene expression levels. In Chapter 4 a clear modulation for all the 17 PR-10 genes tested in young leaves of Florina after challenging with the fungus V. inaequalis have been reported but with a peculiar expression profile for each gene. Interestingly, all the Mal d 1 genes resulted up-regulated except Mal d 1.10 that was down-regulated after the challenging with the fungus. The differences in direction, timing and magnitude of induction seem to confirm the hypothesis of a subfunctionalization inside the gene family despite an high sequencce and structure similarity. Moreover, a modulation of PR-10 genes was showed both in compatible (Gala-V. inaequalis) and incompatible (Florina-V. inaequalis) interactions contribute to validate the hypothesis of an indirect role for at least some of these proteins in the induced defense responses. Finally, a certain modulation of PR-10 transcripts retrieved also in leaves treated with water confirm their abilty to respond also to abiotic stress. To conclude, the genomic approach used here allowed to create a comprehensive inventory of all the genes of allergen families, especially in the case of extended gene families like Mal d 1. This knowledge can be considered a basal prerequisite for many further studies. On the other hand, the specific transcriptional approach make it possible to evaluate the Mal d 1 genes behavior on different samples and conditions and therefore, to speculate on their involvement on apple allergenicity process. Considering the double nature of Mal d 1 proteins, as apple allergens and as PR-10 proteins, the gene expression analysis upon the attack of the fungus created the base for unravel the Mal d 1 biological functions. In particular, the knowledge acquired in this work about the PR-10 genes putatively more involved in the specific Malus-V. inaequalis interaction will be helpful, in the future, to drive the apple breeding for hypo-allergenicity genotype without compromise the mechanism of response of the plants to stress conditions. For the future, the survey of the differences in allergenicity among cultivars has to be be thorough including other genotypes and allergic patients in the tests. After this, the allelic diversity analysis with the high and low allergenic cultivars on all the allergen genes, in particular on the ones with transcription levels correlated to allergencity, will provide the genetic background of the low ones. This step from genes to alleles will allow the develop of molecular markers for them that might be used to effectively addressed the apple breeding for hypo-allergenicity. Another important step forward for the study of apple allergens will be the use of a specific proteomic approach since apple allergy is a multifactor-determined disease and only an interdisciplinary and integrated approach can be effective for its prevention and treatment.

Myc-mediated control of gene transcription in cancer cells

The Myc oncoproteins belong to a family of transcription factors composed by Myc, N-Myc and L-Myc. The most studied components of this family are Myc and N-Myc because their expressions are frequently deregulated in a wide range of cancers. These oncoproteins can act both as activators or repressors of gene transcription. As activators, they heterodimerize with Max (Myc associated X-factor) and the heterodimer recognizes and binds a specific sequence elements (E-Box) onto gene promoters recruiting histone acetylase and inducing transcriptional activation. Myc-mediated transcriptional repression is a quite debated issue. One of the first mechanisms defined for the Myc-mediated transcriptional repression consisted in the interaction of Myc-Max complex Sp1 and/or Miz1 transcription factors already bound to gene promoters. This interaction may interfere with their activation functions by recruiting co-repressors such as Dnmt3 or HDACs. Moreover, in the absence of , Myc may interfere with the Sp1 activation function by direct interaction and subsequent recruitment of HDACs. More recently the Myc/Max complex was also shown to mediate transcriptional repression by direct binding to peculiar E-box. In this study we analyzed the role of Myc overexpression in Osteosarcoma and Neuroblastoma oncogenesis and the mechanisms underling to Myc function. Myc overexpression is known to correlate with chemoresistance in Osteosarcoma cells. We extended this study by demonstrating that c-Myc induces transcription of a panel of ABC drug transporter genes. ABCs are a large family trans-membrane transporter deeply involved in multi drug resistance. Furthermore expression levels of Myc, ABCC1, ABCC4 and ABCF1 were proved to be important prognostic tool to predict conventional therapy failure. N-Myc amplification/overexpression is the most important prognostic factor for Neuroblastoma. Cyclin G2 and Clusterin are two genes often down regulated in neuroblastoma cells. Cyclin G2 is an atypical member of Cyclin family and its expression is associated with terminal differentiation and apoptosis. Moreover it blocks cell cycle progression and induces cell growth arrest. Instead, CLU is a multifunctional protein involved in many physiological and pathological processes. Several lines of evidences support the view that CLU may act as a tumour suppressor in Neuroblastoma. In this thesis I showed that N-Myc represses CCNG2 and CLU transcription by different mechanisms. • N-Myc represses CCNG2 transcription by directly interacting with Sp1 bound in CCNG2 promoter and recruiting HDAC2. Importantly, reactivation of CCNG2 expression through epigenetic drugs partially reduces N-Myc and HDAC2 mediated cell proliferation. • N-Myc/Max complex represses CLU expression by direct binding to a peculiar E-box element on CLU promoter and by recruitment of HDACs and Polycomb Complexes, to the CLU promoter. Overall our findings strongly support the model in which Myc overexpression/amplification may contribute to some aspects of oncogenesis by a dual action: i) transcription activation of genes that confer a multidrug resistant phenotype to cancer cells; ii), transcription repression of genes involved in cell cycle inhibition and cellular differentiation.

Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

Role of caveolin-1 in the proliferation of solid tumours in vitro

Caveolin-1 (Cav-1), the essential structural constituent of caveolae, which are flask-shaped invaginations of the plasma membrane, has been found to play a key role in the modulation of cell proliferation and cancer development. It seems to act as an oncosuppressor or a promoter of growth, depending on the histotype, stage and grade of each tumour. The aim of this study was to analyze the effects of Caveolin-1 gene silencing on the proliferation of human lung cancer and osteosarcoma in vitro. Our data show that Cav-1 silencing blocks the growth in both metastatic lung cancer cell lines analyzed, suggesting a proliferation promoting action of the protein in these cells. A marked decrease of phospho-Akt, phospho-ERK, STAT3, cyclin D1, CDK4 and consequently of phospho-Rb expression was evident in the cells treated with Cav-1 siRNA. With regards to osteosarcoma, we demonstrated that the suppression of Cav-1 results in the blocking of MG-63 and in the slowing down of HOS proliferation, suggesting a role for Cav-1 as a promoter of tumour growth in these cell lines. A marked decrease of phospho-Akt, cyclin E, CDK2 and phospho-Rb and an increase of p21 expression levels were evident in the cells treated with Cav-1 siRNA. Our results suggest two new cell cycle inhibiting pathways, mediated by Cav-1 knock-down, and provide new insights into the molecular mechanisms underlying the tumour-promoting role of Cav-1 in lung cancer and osteosarcoma. In this work we also investigated the role of estrogens in lung cancer and the functional cross-talk between Cav-1 and estrogens/estrogen receptors in it. Our results show that 17β-estradiol induces proliferation either in RAL or in SCLC-R1 cells and that both cell lines are sensitive to 4-OHT antiproliferative effect. The sensitivity to estrogen stimulation seems to be gender- and/or histological type-independent in metastatic lung cancer in vitro.

Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

Identifizierung eines adaptiven antibakteriellen Abwehrmechanismus des marinen Schwammes Suberites domuncula

Schwämme (Porifera) sind die phylogenetisch ältesten Metazoa. Sie besitzen komplexe Abwehrsysteme, welche vor allem auf der Synthese bioaktiver niedermolekularer Sekundärmetaboliten beruhen und diese Tiere zu einer der reichhaltigsten Quellen für medizinisch nutzbare Wirkstoffe machen. Besonders der marine Einsiedler-Korkschwamm (Suberites domuncula) hat sich in den letzten Jahren zur Untersuchung der molekularen Zusammenhänge dieser Abwehrmechanismen als besonders geeignet herausgestellt. So wurden in diesem Schwamm beispielsweise zwei lyso-PAF (plättchenaktivierender Faktor) Derivate (1-O Hexadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin und 1-O-Octadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin) identifiziert und charakterisiert, sowie deren ausgeprägte antibakterielle Aktivität besonders gegenüber gramnegativen Bakterien demonstriert. Eine Behandlung mit der Modellsubstanz zur Simulation einer bakteriellen Infektion, dem Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS), für insgesamt 72 Stunden resultierte in einem Anstieg der Expressionslevel zweier an der Biosynthese dieser bioaktiven Etherphospholipide beteiligten Proteine. Unter Anwendung der Methode des Differential Display konnte einerseits das Schlüsselenzym der Etherphospholipid Biosynthese Alkyl- Dihydroxyacetonphosphat (DHAP)-Synthase und andererseits die regulatorische Untereinheit der PAF-deacetylierenden PAF Acetylhydrolase I

Mechanismen der Caveolin-Genregulation in neuralen Zellsystemen

Caveolae sind vesikuläre Invaginationen der eukaryontischen Zellmembran, die bei einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse eine bedeutende Rolle spielen. Die strukturellen und funktionellen Hauptbestandteile der Caveolae sind die Caveolin-Proteine, welche von drei homologen Genen (Caveolin-1,-2,-3) kodiert werden. Die Caveoline stellen die Struktur-Organisatoren der Caveolae dar, und regulieren direkt die Aktivität von zahlreichen Caveolae-assoziierten Rezeptorproteinen und Signalmolekülen. Oftmals werden die pleiotropen Effekte der Caveoline über eine Veränderung der Caveolin-Genexpressionsstärke moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche biologische Steuerfaktoren identifiziert, unter deren Kontrolle die Caveolin-Genexpression in neuralen Zellsystemen steht. Bei diesen Faktoren handelt es sich um das Steroidhormon Oestrogen und seine Rezeptoren, den Wachstumsfaktor TGFa und den sekundären Botenstoff zyklisches AMP (cAMP). Oestrogen wirkt über die Aktivierung von Oestrogen-Rezeptoren (ERs) im zentralen Nervensystem in der Regel als neurotropher Faktor. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, daß in humanen Neuroblastom-Zellen (SK-N-MC) die stabile, rekombinante Expression des ERa-Subtyps zu einer drastischen Reduktion der Caveolin-1/-2-Transkription führt, und daß in der Folge die zelluläre Caveolin-Biosynthese eingestellt wird. Eine Analyse des Caveolin-1-Gens ergab, daß einhergehend mit der Inaktivierung der Caveolin-1-Transkription eine Vielzahl der im Promoter enthaltenen CpG-Dinukleotide methyliert vorliegen. Durch pharmakologische Inhibition der nukleären DNA-Methyltransferasen sowie der Histon-Deacetylasen konnte die Caveolin-1-Transkription teilweise wiederhergestellt werden. Diese Befunde lassen auf die Existenz eines DNA-Methylierungs-abhängigen Stilllegungsmechanismus der Caveolin-Genexpression durch ERa schließen. Dagegen führte die Überexpression des ERb-Subtyps in SK-N-MC-Zellen zu keiner Veränderung der Caveolin-1/-2-Expression. Interessanterweise wurde die supprimierende Wirkung des ERa durch die gleichzeitige Überexpression des ERb vollständig aufgehoben. Der mitogene Wachstumsfaktor TGFa wurde als zweites extrazelluläres Signalmolekül identifiziert, welches eine Reduktion der Caveolin-1/-2-Genexpression bewirkt. In primären kortikalen Astrozyten konnte gezeigt werden, daß TGFa seine supprimierende Wirkung auf die Caveolin-1-Expression partiell über die Aktivierung des PI3-Kinase-abhängigen Signalweges vermittelt. Zudem wurde die supprimierende Wirkung von TGFa durch einen Inhibitior der Histon-Deacetylasen relativiert. Daher scheinen sowohl für den ERa als auch für TGFa epigenetische Prozesse bei der Suppression der Caveolin-1-Genexpression eine entscheidende Rolle zu spielen. Intrazellulär wirkte neben der PI3-Kinase auch der Botenstoff cAMP in kortikalen Astrozyten als Suppressor der Caveolin-Genexpression. Es wäre denkbar, daß die Caveolin-Suppression funktioneller Bestandteil des seit langem etablierten Effekts der cAMP-induzierten Astrozyten-Differenzierung ist. Desweiteren wiesen der cAMP- und TGFa-abhängige Signalweg ein überlappendes, Gehirnregion-spezifisches Regulationsprofil der Caveolin-Expression in Astrozyten auf: während in Kortex und Striatum eine Regulation durch cAMP und TGFa erfolgte, blieb diese in Klein- und Zwischenhirn aus. Somit bewirken drei zentrale regulatorische Faktoren der Proliferation und Differenzierung neuraler Zellen eine Reduktion in der Konzentration der pleiotrop funktionellen Caveoline. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit die reduzierte Caveolin-Expression für die morphologischen und biochemischen Primärwirkungen dieser Faktoren während der Entwicklung und im Zuge der Tumorgenese mitverantwortlich ist. Außerdem könnten über die Beobachtungen der zellbiologischen Auswirkungen reduzierter Caveolin-Spiegel neue Erkenntnisse über die Funktion dieser Proteine gewonnen werden.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

DNA methylation, histone modification and the transcription factor dE2F1 in Drosophila

Drosophila melanogaster enthält eine geringe Menge an 5-methyl-Cytosin. Die von mir untersuchte männliche Keimbahn von Drosophila weist jedoch keine nachweisbaren Mengen an DNA-Methylierung auf. Eine künstliche Expression der murinen de novo Methyltransferasen, DNMT3A und DNMT3B1, in den Fliegenhoden, führte nicht zu der erwarteten Methylierungszunahme und hatte keinen Effekt auf die Fruchtbarkeit der Männchen. Auch die gewebespezifische Expression unter der Verwendung des UAS/GAL4-Systems zeigte keine phenotypischen Veränderungen. Hingegen fanden wir auf Protein-Ebene des Chromatins von D. melanogaster und D. hydei spezifische Modifikationsmuster der Histone H3 und H4 in der Keimbahn, wie auch in den somatischen Zellen des Hodenschlauches. Die Modifikationsmuster der beiden Zelltypen unterscheiden sich grundlegend und weichen zudem von dem für Eu- und Heterochromatin erwarteten ab, was auf eine größere Komplexität des „Histon-Codes“ als angenommen hindeutet. Folglich liegt die epigenetische Information in Drosophila wahrscheinlich anstatt auf DNA- auf Protein-Ebene, wodurch Genexpression über die Chromatinstruktur reguliert wird. Es wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor E2F, der eine Schlüsselfunktion im Zellzyklus hat, durch unterschiedliche Transkripte offenbar quantitativ reguliert wird. Unsere Nachforschungen ergaben, dass die drei E2F1 Genprodukte in Drosophila neben ihrer Zellspezifität auch in unterschiedlichen Expressionsniveaus auftreten, was die Annahme einer quantitativen Expression unterstützt. Die verschiedenen Funktionen der multiplen Gene in Säugern, könnten so funktionell kompensiert werden. Die durch die Expression dreier dE2F1-Transkripte vermutete Synthese verschiedener Proteine konnte nicht bewiesen werden.

Sonic Hedgehog pathway impairment in Neural Precursor Cells of the Ts65Dn mouse, an animal model of Down syndrome

Mental retardation in Down syndrome (DS) has been imputed to the decreased brain volume, which is evident starting from the early phases of development. Recent studies in a widely used mouse model of DS, the Ts65Dn mouse, have shown that neurogenesis is severely impaired during the early phases of brain development, suggesting that this defect may be a major determinant of brain hypotrophy and mental retardation in individuals with DS. Recently, it has been found that in the cerebellum of Ts65Dn mice there is a defective responsiveness to Sonic Hedgehog (Shh), a potent mitogen that controls cell division during brain development, suggesting that failure of Shh signaling may underlie the reduced proliferation potency in DS. Based on these premises, we sought to identify the molecular mechanisms underlying derangement of the Shh pathway in neural precursor cells (NPCs) from Ts65Dn mice. We found that the expression levels of the Shh receptor Patched1 (Ptch1) were increased compared to controls both at the RNA and protein level. Partial silencing of Ptch1 expression in trisomic NPCs restored cell proliferation, indicating that proliferation impairment was due to Ptch1 overexpression. We further found that the overexpression of Ptch1 in trisomic NPCs is related to increased levels of AICD, a transcription-promoting fragment of amyloid precursor protein (APP). Increased AICD binding to the Ptch1 promoter favored its acetylated status, thus enhancing Ptch1 expression. Taken together, these data provide novel evidence that Ptch1 over expression underlies derangement of the Shh pathway in trisomic NPCs, with consequent proliferation impairment. The demonstration that Ptch1 over expression in trisomic NPCs is due to an APP fragment provides a link between this trisomic gene and the defective neuronal production that characterizes the DS brain.

Einfluss einer Schwerionenbestrahlung auf das Migrationsverhalten von Tumorzellen

Die Bildung von Metastasen und Rezidiven stellt ein großes Problem für eine erfolgreiche Therapie solider maligner Tumoren dar. Dabei ist die Rolle der angewendeten Therapiever-fahren in der Induktion metastasierender Zellen vor allem für eine Schwerionentherapie noch weitestgehend unklar. Die für die Metastasierung entscheidende Tumorzellmigration wurde daher unter dem Einfluss von Röntgen- und Schwerionenstrahlung untersuchen. Dazu wurden drei humane Tumorzelllinien (Gliomzelllinie U87 und kolorektale Zelllinien HCT116 und HCT116 p21-/-) unter standardisierten Bedingungen in einer Boydenkammer direkt und 24 Stunden nach Bestrahlung in vitro auf ihr Migrationsverhalten untersucht. Um mögliche Än-derungen migrationsrelevanter Proteine zu bestimmen, wurden zu denselben Zeitpunkten Zelllysate hergestellt und die Expression der Integrine b1 und b3 sowie der Proteinkinase B Isoformen Akt1 und Akt2 und deren Phosphorylierung untersucht. Gezeigt werden konnten sowohl zelllinien- als auch strahlenspezifische Unterschiede in der Migration und der Proteinexpressionen. Dabei konnten die beobachteten Migrationsänderungen nur zum Teil (vor allem nach Röntgenbestrahlung) durch die veränderte Expressionen der untersuchten Proteine erklärt werden. Daher ist zu vermuten, dass den strahleninduzierten Veränderungen der Migration der verwendeten Zelllinien verschiedene Mechanis-men zugrunde liegen, die auf der Expression unterschiedlicher Proteine beruhen. Bestrahlungen mit 12C-Ionen scheinen prinzipiell andere Expressionsmuster zu induzieren als konventionelle Strahlung und die hier untersuchten Proteine in der Migration der Zellen daher nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Auffällig waren die deutlich zelllinienspezifischen Unterschiede in der Migration nach Röntgenbestrahlung. Dort wurde ein zum Teil erhöhtes Migrationspotential nach klinisch relevanten Bestrahlungsdosen von U87 Gliomzellen festgestellt. Die Migrationsaktivität von kolorektalen Zelllinien hingegen nahm nach Bestrahlung ab. Nach Schwerionenbestrahlung wurden für alle Zelllinien signifikante Abnahmen der Migration festgestellt. Die hier erhaltenen Ergebnisse können aufgrund einer Vielzahl pro- und antimigratorischer Signale im Tumorgewebe nicht direkt in die in vivo Situation übertragen werden, doch können sie durchaus als Hinweise für die Abschätzung eines veränderten Metastasierungsrisikos dienen. Für kolorektale Zellen, unabhängig von ihrem p21-Status scheint eine Behandlung mit Röntgenstrahlen eher nicht mit einem erhöhten Migrationsrisiko einherzugehen. Anders ist dies bei den hier untersuchten Gliomzellen U87. Hier kann ein strahleninduziertes Metastasierungsrisiko aufgrund der erzielten Ergebnisse keinesfalls ausgeschlossen werden. Aus dieser Sicht scheint eine Behandlung von Gliomen mit 12C-Ionen vorteilhafter, da eine sehr gute reproduzierbare strahlenvermittelte Migrationshemmung beobachtet wurde.

Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Valutazione del ruolo dell'espressione di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di cellule di osteosarcoma ed MSCs

L’osteosarcoma (OS) è il tumore primitivo dell’osso più comune in età pediatrica e adolescenziale. L’OS è stato recentemente riconsiderato come una patologia da de-differenziamento, legata all’interruzione del processo cui vanno incontro i precursori osteoblastici, quali le cellule staminali mesenchimali (MSCs), per trasformarsi in osteoblasti maturi. Il sistema IGF è coinvolto nella regolazione della proliferazione e del differenziamento di cellule di OS. IRS-1 è un mediatore critico di tale via di segnalazione e il suo livello di espressione modula il differenziamento di cellule ematopoietiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di definire il ruolo di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di MSCs e cellule di OS. Il potenziale differenziativo di cellule di OS umano e murino e di MSCs derivate da midollo osseo è stato valutato tramite Alizarin Red staining e Real Time-PCR. Dai dati ottenuti è emerso come i livelli di espressione di IRS-1 diminuiscano durante il differenziamento osteoblastico. Conseguentemente, i livelli di espressione di IRS-1 sono stati manipolati utilizzando shRNA per down-regolare l’espressione della proteina o un plasmide per sovra-esprimerla. Sia la down-regolazione sia la sovra-espressione di IRS-1 hanno inibito il differenziamento osteoblastico delle linee cellulari considerate. Allo scopo di valutare il contributo di IRS-1 nella via di segnalazione di IGF-1R è stato utilizzato l’inibitore di tale recettore, αIR-3. Anche in questo caso è stata osservata una riduzione della capacità differenziativa. L’inibitore del proteasoma MG-132 ha portato ad un aumento dei livelli di IRS-1, portando nuovamente all’inibizione del differenziamento osteoblastico e suggerendo che l’ubiquitinazione di questa proteina potrebbe avere un ruolo importante nel mantenimento di appropriati livelli di espressione di IRS-1. I risultati ottenuti indicano la criticità dei livelli di espressione di IRS-1 nella determinazione della capacità differenziativa sia di cellule di OS umano e murino, sia delle MSCs.

Comparative DNA sequence and methylation analyses of orthologous genes in humans and non-human primates: Genetic and epigenetic footprints of evolution

Welche genetische Unterschiede machen uns verschieden von unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen, und andererseits so ähnlich zu den Schimpansen? Was wir untersuchen und auch verstehen wollen, ist die komplexe Beziehung zwischen den multiplen genetischen und epigenetischen Unterschieden, deren Interaktion mit diversen Umwelt- und Kulturfaktoren in den beobachteten phänotypischen Unterschieden resultieren. Um aufzuklären, ob chromosomale Rearrangements zur Divergenz zwischen Mensch und Schimpanse beigetragen haben und welche selektiven Kräfte ihre Evolution geprägt haben, habe ich die kodierenden Sequenzen von 2 Mb umfassenden, die perizentrischen Inversionsbruchpunkte flankierenden Regionen auf den Chromosomen 1, 4, 5, 9, 12, 17 und 18 untersucht. Als Kontrolle dienten dabei 4 Mb umfassende kollineare Regionen auf den rearrangierten Chromosomen, welche mindestens 10 Mb von den Bruchpunktregionen entfernt lagen. Dabei konnte ich in den Bruchpunkten flankierenden Regionen im Vergleich zu den Kontrollregionen keine höhere Proteinevolutionsrate feststellen. Meine Ergebnisse unterstützen nicht die chromosomale Speziationshypothese für Mensch und Schimpanse, da der Anteil der positiv selektierten Gene (5,1% in den Bruchpunkten flankierenden Regionen und 7% in den Kontrollregionen) in beiden Regionen ähnlich war. Durch den Vergleich der Anzahl der positiv und negativ selektierten Gene per Chromosom konnte ich feststellen, dass Chromosom 9 die meisten und Chromosom 5 die wenigsten positiv selektierten Gene in den Bruchpunkt flankierenden Regionen und Kontrollregionen enthalten. Die Anzahl der negativ selektierten Gene (68) war dabei viel höher als die Anzahl der positiv selektierten Gene (17). Eine bioinformatische Analyse von publizierten Microarray-Expressionsdaten (Affymetrix Chip U95 und U133v2) ergab 31 Gene, die zwischen Mensch und Schimpanse differentiell exprimiert sind. Durch Untersuchung des dN/dS-Verhältnisses dieser 31 Gene konnte ich 7 Gene als negativ selektiert und nur 1 Gen als positiv selektiert identifizieren. Dieser Befund steht im Einklang mit dem Konzept, dass Genexpressionslevel unter stabilisierender Selektion evolvieren. Die meisten positiv selektierten Gene spielen überdies eine Rolle bei der Fortpflanzung. Viele dieser Speziesunterschiede resultieren eher aus Änderungen in der Genregulation als aus strukturellen Änderungen der Genprodukte. Man nimmt an, dass die meisten Unterschiede in der Genregulation sich auf transkriptioneller Ebene manifestieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Mensch und Schimpanse untersucht. Dazu wurden die Methylierungsmuster der Promotor-CpG-Inseln von 12 Genen im Cortex von Menschen und Schimpansen mittels klassischer Bisulfit-Sequenzierung und Bisulfit-Pyrosequenzierung analysiert. Die Kandidatengene wurden wegen ihrer differentiellen Expressionsmuster zwischen Mensch und Schimpanse sowie wegen Ihrer Assoziation mit menschlichen Krankheiten oder dem genomischen Imprinting ausgewählt. Mit Ausnahme einiger individueller Positionen zeigte die Mehrzahl der analysierten Gene keine hohe intra- oder interspezifische Variation der DNA-Methylierung zwischen den beiden Spezies. Nur bei einem Gen, CCRK, waren deutliche intraspezifische und interspezifische Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung festzustellen. Die differentiell methylierten CpG-Positionen lagen innerhalb eines repetitiven Alu-Sg1-Elements. Die Untersuchung des CCRK-Gens liefert eine umfassende Analyse der intra- und interspezifischen Variabilität der DNA-Methylierung einer Alu-Insertion in eine regulatorische Region. Die beobachteten Speziesunterschiede deuten darauf hin, dass die Methylierungsmuster des CCRK-Gens wahrscheinlich in Adaption an spezifische Anforderungen zur Feinabstimmung der CCRK-Regulation unter positiver Selektion evolvieren. Der Promotor des CCRK-Gens ist anfällig für epigenetische Modifikationen durch DNA-Methylierung, welche zu komplexen Transkriptionsmustern führen können. Durch ihre genomische Mobilität, ihren hohen CpG-Anteil und ihren Einfluss auf die Genexpression sind Alu-Insertionen exzellente Kandidaten für die Förderung von Veränderungen während der Entwicklungsregulation von Primatengenen. Der Vergleich der intra- und interspezifischen Methylierung von spezifischen Alu-Insertionen in anderen Genen und Geweben stellt eine erfolgversprechende Strategie dar.

Relationship between pain and anxiety in rats

Clinically, it is well known that neuropathic pain often induces comorbid symptoms such as anxiety. In turn, also anxiety has been associated with a heightened experience of pain. Although, the link between pain and anxiety is well recognized in humans, the neurobiological basis of this relationship remains unclear. Therefore, the aim of the current study was to investigate the influence of neuropathic pain on anxiety and vice versa in rats by assessing not only pain-related behaviour but also by discovering possible key substrates which are responsible for the interrelation of pain and anxiety.rnIn rats with a chronic constriction of the sciatic nerve (CCI model) anxiety-like behaviour was observed. Since anxiety behaviour could be completely abolished after the treatment of the pure analgesic drugs gabapentin and morphine, we concluded that anxiety was caused by the strong persistent pain. Furthermore, we found that the neuropeptides oxytocin and vasopressin were upregulated in the amygdala of CCI rats, and the intra-amygdala treatment of an oxytocin antagonist but not the vasopressin antagonist could reduce anxiety-like behaviour in these animals, while no effect on mechanical hypersensitivity was observed. These data indicate that oxytocin is implicated in the underlying neuronal processes of pain-induced anxiety and helps to elucidate the pathophysiological mechanisms of neuropathic pain. rnTo assess the influence of trait anxiety on pain sensation in rats, we determined mechanical hypersensitivity after sciatic nerve lesion (CCI) in animals selectively bred for high anxiety or low anxiety behaviour. The paw withdrawal thresholds were significantly decreased in high anxiety animals in comparison to low anxiety animals 2 and 3 weeks after surgery. In a second model state anxiety was induced by the sub-chronic injection of the anxiogenic drug pentylentetrazol in naive rats. Pain response to mechanical stimuli was increased after pharmacologically-induced anxiety. These results provided evidence for the influence of both trait and state anxiety on pain sensation. rnThe studies contribute to the elucidation of the relationship between pain and anxiety. We investigated that the neuropathic pain model displays sensory as well as emotional factors of peripheral neuropathy. Changes in expression levels of neuropeptides in the central nervous system due to neuropathic pain may contribute to the pathophysiology of neuropathic pain and its related symptoms in animals which might also be relevant for human scenarios. The results of the current study also confirm that anxiety plays an important role in the perception of pain. rnA better understanding of pain behaviour in animals might improve the preclinical profiling of analgesic drugs during development. The study highlights the potential use of the rat model as a new preclinical tool to further investigate the link between pain and anxiety by determining not only the sensory reflexes after painful stimuli but also the more complex pain-related behaviour such as anxiety.rn