Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Caratterizzazione citogenetico-molecolare alla diagnosi di pazienti con leucemia mieloide cronica in fase cronica trattati con inibitori delle tirosinchinasi: ruolo prognostico.

L’applicazione della citogenetica convenzionale e molecolare può identificare: Ph-negatività, traslocazioni t(9;22) varianti e alterazioni citogenetiche addizionali (ACA) al cromsoma Ph in pazienti con LMC alla diagnosi. Prima dell’introduzione della terapia con Imatinib, esse mostravano un impatto prognostico negativo o non chiaro. Nel nostro studio, 6 casi di LMC Ph- erano trattati con Imatinib. La FISH identificava 4 casi con riarrangiamento BCR/ABL sul der(9q), 1 sul der(22q) e 1 su entrambi i derivativi. Quattro pazienti (66,7%) raggiungevano la RCgC, 2 fallivano il trattamento e 1 sottoposto a TMO. A causa dello scarso numero di casi, non era possibile nessuna correlazione con la prognosi. Nell’ambito di studi prospettici multicentrici del GIMEMA-WP, abbiamo valutato: traslocazioni varianti e ACA. Dei 559 pazienti arruolati, 30(5%) mostravano traslocazioni varianti, 24 valutabili in FISH: 18(75%) mostravano meccanismo 1-step, 4(16,7%) meccanismo 2-step e 2(8,3%) meccanismo complesso. Abbiamo confermato che le varianti non influenzano la risposta e la sopravvivenza dei pazienti trattati con Imatinib. Dei 378 pazienti valutabili alla diagnosi con citogenetica convenzionale, 21(5,6%) mostravano ACA: 9(43%) avevano la perdita del cromosoma Y, 3(14%) trisomia 8, 2(10%) trisomia 19, 6(28%) altre singole anomalie e 1 cariotipo complesso. La presenza di ACA influenzava la risposta: le RCgC e RMolM erano significativamente più basse rispetto al gruppo senza ACA e le curve di sopravvivenza EFS e FFS non erano significativamente diverse. Le curve di PFS e OS erano sovrapponibili nei due gruppi, per il basso numero di eventi avversi oppure perché alcuni raggiungevano la risposta con TKI di seconda generazione. Le anomalie “major route” mostravano decorso clinico peggiore, ma non è stato possibile determinare l’impatto prognostico in relazione al tipo di alterazione. Pertanto, le ACAs alla diagnosi rivestono un ruolo negativo nella prognosi dei pazienti trattati con Imatinib, che quindi rappresentano una categoria più a rischio per la risposta.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

The search for Multiple Myeloma Stem cells: molecular characterization and self-renewal mechanisms involved in the disease persistence

The existence of Multiple Myeloma Stem cells (MMSCs)is supposed to be one of the major causes of MM drug-resistance. However, very little is known about the molecular characteristics of MMSCs, even if some studies suggested that these cells resembles the memory B cells. In order to molecularly characterize MMSCs, we isolated the 138+138- population. For each cell fraction we performed a VDJ rearrangement analysis. The complete set of aberrations were performed by SNP Array 6.0 and HG-U133 Plus 2.0 microarray analyses (Affymetrix). The VDJ rearrangement analyses confirmed the clonal relationship between the 138+ clone and the immature clone. Both BM and PBL 138+ clones showed exactly the same genomic macroalterations. In the BM and PBL 138-19+27+ cell fractions several micro-alterations (range: 1-350 Kb) unique of the memory B cells clone were highlighted. Any micro-alterations detected were located out of any genomic variants region and are presumably associated to the MM pathogenesis, as confirmed by the presence of KRAS, WWOX and XIAP genes among the amplified regions. To get insight into the biology of the clonotypic B cell population, we compared the gene expression profile of 8 MM B cells samples 5 donor B cells vs, thus showing a differential expression of 11480 probes (p-value: <0,05). Among the self-renewal mechanisms, we observed the down-regulation of Hedgehog pathway and the iperactivation of Notch and Wnt signaling. Moreover, these immature cells showed a particular phenotype correlated to resistance to proteasome inhibitors (IRE1α-XBP1: -18.0; -19.96. P<0,05). Data suggested that the MM 138+ clone might resume the end of the complex process of myelomagenesis, whereas the memory B cells have some intriguing micro-alterations and a specific transcriptional program, supporting the idea that these post germinal center cells might be involved in the transforming event that originate and sustain the neoplastic clone.

Exploring the biofilm of Streptococcus agalactiae to identify virulence factors

Streptococcus agalactiae, also known as Group B Streptococcus (GBS) is the primary colonizer of the anogenital mucosa of up to 40% of healthy women and an important cause of invasive neonatal infections worldwide. Among the 10 known capsular serotypes, GBS type III accounts for 30-76% of the cases of neonatal meningitis. Biofilms are dense aggregates of surface-adherent microorganisms embedded in an exopolysaccharide matrix. Centers for Disease Control and Prevention estimate that 65% of human bacterial infections involve biofilms (Post et al., 2004). In recent years, the ability of GBS to form biofilm attracted attention for its possible role in fitness and/or virulence. Here, a new in vitro biofilm formation protocol was developed to guarantee more stringent conditions, to better discriminate between strong-, low- and non- biofilm forming strains and reduce ambiguous data interpretation. This protocol was applied to screen the in vitro biofilm formation ability of more than 350 GBS clinical isolates from pregnant women and neonatal infections belonging to different serotype, in relation to media composition and pH. The results showed the enhancement of GBS biofilm formation in acidic condition and identified a subset of isolates belonging to serotypes III and V that forms strong biofilms in these conditions. Interestingly, the best biofilm formers belonged to the serotype III hypervirulent clone ST-17.It was also found that pH 5.0 induces down-regulation of the capsule but that this reduction is not enough by itself to ensure biofilm formation. Moreover, the ability of proteinase K to strongly inhibit biofilm formation and to disaggregate mature biofilms suggested that proteins play an essential role in promoting GBS biofilm formation and contribute to the biofilm structural stability. Finally, a set of proteins potentially expressed during the GBS in vitro biofilm formation were identified by mass spectrometry.

Charakterisierung und Analyse der geschlechtsbestimmenden Region von Chironomus riparius

Die durch eine männchenspezifisch auftretende heterochromatische Bande und ein hemizygotes Cla-Element-Cluster gekennzeichnete geschlechtsbestimmende Region („sex determining region“: SDR) auf Chromosom III von C. riparius stellt ein frühes Stadium in der Evolution von Geschlechtschromosomen dar. Diese eindeutig lokalisierte chromosomale Region, die den molekular noch unbekannten männchen¬bestimmenden Faktor M enthalten muss, ist im Vergleich zu den Y-Chromosomen anderer Dipterenarten wie unter anderem M. domestica, die ebenfalls einen dominanten Männchenbestimmer besitzen, relativ klein. Aus diesem Grund bietet die SDR von C. riparius eine Möglichkeit, den männchenbestimmenden Faktor einzugrenzen und zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit konnte ein Bereich einer Größe von ca. 200 kb aus der SDR von C. riparius charakterisiert und analysiert werden. Durch bioinformatische Sequenzanalysen konnten an 20 Stellen der SDR mögliche Genstrukturen nachgewiesen werden. Von den gefundenen möglichen Genen ist bisher die Funktion in C. riparius unbekannt. Bei den Genen mit vermuteter Funktion deutet nichts eindeutig auf eine Beteiligung an der Geschlechtsbestimmung von C. riparius hin. Da allerdings davon auszugehen ist, dass für die Funktion des Männchenbestimmers M ein Gen rekrutiert wurde, welches zur Interaktion mit dem nachgeschalteten Gen der Geschlechts¬bestimmungskaskade fähig ist, muss die geschlechtsbestimmende Funktion des Gens M nicht unbedingt offensichtlich sein. Aus geschlechtsbestimmenden Genkaskaden anderer Dipteren bekannte Gene wie transformer und doublesex konnten im analysierten Bereich nicht nachgewiesen werden, obwohl zumindest zu doublesex homologe Gene im Genom von C. riparius vorkommen. Um möglicherweise proto-X- und proto-Y-Chromosom miteinander vergleichen zu können und einen Hinweis auf die chromosomale Herkunft der analysierten Sequenzen aus der SDR zu erlangen, wurden Sequenzen von 31 teilweise parallel liegenden BAC-Klonen aus der untersuchten Region verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Klone zwei Gruppen bilden, deren Sequenzen sich durch 500 SNPs und 110 Indels unterschiedlicher Größe (1-800 Bp) unterscheiden, was für eine Herkunft von zwei sich erst seit kurzer Zeit unterscheidenden Geschlechtschromosomen spricht. Die zwölf größten dieser Indels wurden auf geschlechtsspezifische Unterschiede hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Unterschiede zwischen den beiden Klongruppen zwar im 30 Jahre alten Laborstamm, der auch für die Konstruktion der durchsuchten BAC-Bibliotheken verwendet wurde, tatsächlich geschlechtsspezifisch sind, in zwei Wildfangpopulationen jedoch keine derartige Geschlechtsspezifität aufweisen. Somit kann keine Aussage zur Herkunft der untersuchten Klone aus der SDR von C. riparius getroffen werden, und es bleibt unklar, ob die analysierten Sequenzen vom proto-X oder vom proto-Y-Chromosom stammen.

Isolierung, Charakterisierung und Nachweis methanogener Archaea aus laufenden Praxis-NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Beruecksichtigung der Gattung Methanobacterium

Im Verlauf der Forschungsarbeit wurden Proben aus fünf, mit nachwachsenden Rohstoffen (NawaRo) beschickten, landwirtschaftlichen Biogasanlagen (BGA) auf die Biozönose methanogener Archaea hin molekularbiologisch untersucht. Über „amplified rDNA restriction analysis“-Screening (ARDRA) von Bibliotheken auf Basis von 16S rRNA-Genfragmenten konnte anhand zweier beispielhafter BGA das Vorkommen von Vertretern der Gattungen Methanoculleus (Mcu.), Methanobacterium (Mb.), Methanosarcina (Msc.) und Methanosaeta (Mst.) nachgewiesen werden. Mittels denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) wurde das Vorkommen dieser Mikroorganismen auch in den übrigen Anlagen gezeigt. Ergänzend dazu wurde in drei Anlagen Methanospirillum hungatei nachgewiesen. Nach Ausarbeitung gattungsspezifischer Isolierungsstrategien konnten insgesamt zehn Vertreter der Gattung Methanobacterium (Isolate Mb1 bis Mb10) und jeweils ein Vertreter der Gattungen Methanoculleus (Isolat Mcu(1)), Methanosarcina (Isolat NieKK) und Methanosaeta (Isolat Mst1.3) aus den BGA-Proben isoliert werden. Durch in silico-Abgleich der partiellen 16S rRNA-Gensequenzen wurden diese als Verwandte von Mb. formicicum MFT, Mcu. bourgensis MS2T, Msc. mazei S-6T und Mst. concilii FE mit einer Sequenzidentität > 97% identifiziert. Im Laufe weiterer molekularbiologischer Untersuchungen mittels DGGE und ARDRA-Analyse konnten die Isolate den Referenzstämmen zugeordnet werden. In Bezug auf die Gattung Methanobacterium ergaben sich jedoch leichte Abweichungen. Diese bestätigten sich in vergleichenden Analysen des genomischen Fingerabdrucks in der „specifically amplified polymorphic DNA“-PCR (SAPD-PCR), welche im Rahmen dieser Arbeit erstmalig erfolgreich auf archaeelle Organismen angewandt wurde. Hier zeigten die Isolate zwei von den Fingerabdrücken der untersuchten Referenzstämme verschiedene Hauptamplifikationsmuster. Aufgrund der Vielzahl der Isolate sowie dem signifikanten Vorkommen in qPCR-Analysen und Klonbibliotheken fokussierten sich die weiteren Arbeiten zur genauen Untersuchung dieser Abweichungen auf phylogenetische Analysen der Gattung Methanobacterium und die Entwicklung von Nachweissystemen. Die Aufklärung eines Großteils der 23S rRNA-Gensequenzen der Isolate und von ausgewählten Typstämmen ermöglichte ergänzende phylogenetische Untersuchungen zu durchgeführten 16S rRNA-Analysen. Dabei wurden die Isolate jeweils in einem eigenen Cluster abseits der meisten Referenzstämme aus der Gattung Methanobacterium positioniert. Analog zur Musterbildung im Rahmen der SAPD-Analyse zeigte sich eine Differenzierung in zwei Äste und ergab in Übereinstimmung mit den in silico-Sequenzabgleichen den höchsten Verwandtschaftsgrad mit Mb. formicicum MFT. Die Eignung der SAPD-PCR zur Ableitung spezifischer Primerpaare konnte erstmals auch für methanogene Archaea gezeigt werden. Die Ableitung zweier Primerpaare mit Spezifität für die Methanobacterium-Isolate Mb1 bis Mb10 sowie für den Typstamm Mb. formicicum MFT gelang und konnte im Rahmen eines Direkt-PCR-Nachweises erfolgreich auf Reinkulturen und Fermenterproben angewandt werden. Unter Einbezug der sequenzierten 23S rRNA-Genfragmente gelang die Erstellung von Oligonukleotid-Sonden für den Einsatz in Fluoreszenz in situ-Hybridisierungsexperimenten. Im Praxistest ergab sich für diese Sonden eine Spezifität für alle getesteten Vertreter der Gattung Methanobacterium sowie für Methanosphaera stadtmanae MCB-3T und Methanobrevibacter smithii PST.rnSomit konnten im Laufe der Arbeit die dominanten methanogenen Archaea in NawaRo-BGA in mehrphasigen Experimenten nachgewiesen, quantifiziert und auf nur wenige Gattungen eingegrenzt werden. Vertreter der vier dominanten Gattungen wurden isoliert und Nachweissysteme für Arten der Gattung Methanobacterium erstellt.rn

Hot Clones, Maintaining a Link Between Software Clones Across Repositories

Code duplication is common in current programming-practice: programmers search for snippets of code, incorporate them into their projects and then modify them to their needs. In today's practice, no automated scheme is in place to inform both parties of any distant changes of the code. As code snippets continues to evolve both on the side of the user and on the side of the author, both may wish to benefit from remote bug fixes or refinements --- authors may be interested in the actual usage of their code snippets, and researchers could gather information on clone usage. We propose maintaining a link between software clones across repositories and outline how the links can be created and maintained.

Extensive clonal spread and extreme longevity in saw palmetto, a foundation clonal plant

The lack of effective tools have hampered our ability to assess the size, growth and ages of clonal plants. With Serenoa repens (saw palmetto) as a model, we introduce a novel analytical framework that integrates DNA fingerprinting and mathematical modelling to simulate growth and estimate ages of clonal plants. We also demonstrate the application of such life-history information of clonal plants to provide insight into management plans. Serenoa is an ecologically important foundation species in many Southeastern United States ecosystems; yet, many land managers consider Serenoa a troublesome invasive plant. Accordingly, management plans have been developed to reduce or eliminate Serenoa with little understanding of its life history. Using Amplified Fragment Length Polymorphisms, we genotyped 263 Serenoa and 134 Sabal etonia (a sympatric non-clonal palmetto) samples collected from a 20 X 20 m study plot in Florida scrub. Sabal samples were used to assign small field-unidentifiable palmettos to Serenoa or Sabal and also as a negative control for clone detection. We then mathematically modelled clonal networks to estimate genet ages. Our results suggest that Serenoa predominantly propagate via vegetative sprouts and 10000-year-old genets may be common, while showing no evidence of clone formation by Sabal. The results of this and our previous studies suggest that: (i) Serenoa has been part of scrub associations for thousands of years, (ii) Serenoa invasion are unlikely and (ii) once Serenoa is eliminated from local communities, its restoration will be difficult. Reevaluation of the current management tools and plans is an urgent task.

Extensive clonal spread and extreme longevity in saw palmetto, a foundation clonal plant

The lack of effective tools has hampered our ability to assess the size, growth and ages of clonal plants. With Serenoa repens (saw palmetto) as a model, we introduce a novel analytical frame work that integrates DNA fingerprinting and mathematical modelling to simulate growth and estimate ages of clonal plants. We also demonstrate the application of such life-history information of clonal plants to provide insight into management plans. Serenoa is an ecologically important foundation species in many Southeastern United States ecosystems; yet, many land managers consider Serenoa a troublesome invasive plant. Accordingly, management plans have been developed to reduce or eliminate Serenoa with little understanding of its life history. Using Amplified Fragment Length Polymorphisms, we genotyped 263 Serenoa and 134 Sabal etonia (a sympatric non-clonal palmetto) samples collected from a 20 x 20 m study plot in Florida scrub. Sabal samples were used to assign small field-unidentifiable palmettos to Serenoa or Sabal and also as a negative control for clone detection. We then mathematically modelled clonal networks to estimate genet ages. Our results suggest that Serenoa predominantly propagate via vegetative sprouts and 10000-year-old genets maybe common, while showing no evidence of clone formation by Sabal. The results of this and our previous studies suggest that: (i) Serenoa has been part of scrub associations for thousands of years, (ii) Serenoa invasions are unlikely and (ii) once Serenoa is eliminated from local communities, its restoration will be difficult. Reevaluation of the current management tools and plans is an urgent task.

Antagonistic TSC22D1 variants control BRAF(E600)-induced senescence

Oncogene-induced cellular senescence (OIS) is an increasingly recognized tumour suppressor mechanism that confines the outgrowth of neoplastic cells in vivo. It relies on a complex signalling network, but only few components have been identified so far. Gene-expression profiling revealed a >100-fold increase in the levels of the transcription factor and putative tumour suppressor gene TGFβ-stimulated clone 22 (TSC22D1) in BRAF(E600)-induced senescence, in both human fibroblasts and melanocytes. Only the short TSC22D1 transcript was upregulated, whereas the abundance of the large protein variant was suppressed by proteasomal degradation. The TSC22D1 protein variants, in complex with their dimerization partner TSC22 homologue gene 1 (THG1), exerted opposing functions, as selective depletion of the short form, or conversely, overexpression of the large variant, resulted in abrogation of OIS. This was accompanied by the suppression of several inflammatory factors and p15(INK4B), with TSC22D1 acting as a critical effector of C/EBPβ. Our results demonstrate that the differential regulation of antagonistic TSC22D1 variants is required for the establishment of OIS and suggest distinct contributions of TSC22 family members to the progression of BRAF(E600)-driven neoplasia.

Characterization of Aggregatibacter actinomycetemcomitans strains in periodontitis patients in Germany

Aggregatibacter actinomycetemcomitans strains of serotype b and with a deletion of 530 bp in the promoter region of the leukotoxin gene (JP2 clone) are known to be associated with severe periodontitis. Our study was aimed to detect virulence genes of A. actinomycetemcomitans strains obtained from patients living in four German cities with different proportions of immigrants.

Patterns of molecular response to and relapse after combination of sorafenib, idarubicin, and cytarabine in patients with FLT3 mutant acute myeloid leukemia

BACKGROUND: FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a class III receptor tyrosine kinase involved in hematopoietic progenitor cell development. Mutations of FLT3 have been reported in about a third of patients with acute myeloid leukemia (AML), and inhibitors of FLT3 are of clinical interest. Sorafenib is an orally active multikinase inhibitor with potent activity against FLT3 and the Raf/ERK/MEK kinase pathway. METHODS: We studied the patterns of molecular response and relapse in 18 patients with mutated FLT3 treated with the combination of sorafenib, idarubicin, and cytarabine. RESULTS: The median follow-up was 9 months. Sixteen patients achieved complete remission (CR), and the other 2 patients achieved CR but lacked platelet recovery for an overall response rate of 100%. Ten patients had their FLT3-mutated clone eradicated, with 6 patients who showed some residual FLT3-mutated cells, and 2 patients who showed persistent FLT3-mutated cells. The elimination of FLT3-mutated population at the time of morphologic CR, however, was not predictive of relapse. After a median follow-up of 9 months (range, 1-16 months), 10 (55%) patients had relapsed, with a median CR duration of 8.8 months (range, 1-9.5 months). By DNA sequencing, there was no evidence of an acquired FLT3 point mutation at the time of relapse in 7 patients tested, which suggested the presence of other mechanisms of sorafenib resistance. CONCLUSION: Sorafenib, combined with chemotherapy, is effective in attaining CR, but relapses still occur.

Low rate of methicillin-resistant coagulase-positive staphylococcal colonization of veterinary personnel in Hong Kong

Elevated rates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) carriage have been reported in veterinary personnel, suggesting an occupational colonization risk. Hong Kong veterinary personnel (n = 150) were sampled for coagulase-positive staphylococci (CPS) nasal colonization. Risk factors for colonization were assessed by questionnaire. Isolates were identified and antibiotic susceptibility determined. All CPS isolates were investigated for mecA carriage, SCCmec type and PVL genes. Two subjects were colonized with methicillin-resistant CPS: one with MRSA (spa type t002 (CC5), SCCmec type II) and one with methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) (MLST type ST71, SCCmec type II-III). MLST type ST71 S. pseudintermedius strain is the predominant MRSP clone circulating in dogs in Europe and in Hong Kong. The low MR-CPS colonization rate may be associated with low levels of large animal exposure or low rates of MRSA colonization of companion animals in Hong Kong. Colonization with non-aureus CPS, which may cause human infection, must also be considered in veterinary personnel.