In vivo phosphorus spectroscopy in human subjects on a clinical 3T MRI system

Alors que l’Imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir un large éventail de données anatomiques et fonctionnelles, les scanneurs cliniques sont généralement restreints à l’utilisation du proton pour leurs images et leurs applications spectroscopiques. Le phosphore jouant un rôle prépondérant dans le métabolisme énergétique, l’utilisation de cet atome en spectroscopie RM présente un énorme avantage dans l’observation du corps humain. Cela représente un certain nombre de déEis techniques à relever dus à la faible concentration de phosphore et sa fréquence de résonance différente. L’objectif de ce projet a été de développer la capacité à réaliser des expériences de spectroscopie phosphore sur un scanneur IRM clinique de 3 Tesla. Nous présentons ici les différentes étapes nécessaires à la conception et la validation d’une antenne IRM syntonisée à la fréquence du phosphore. Nous présentons aussi l’information relative à réalisation de fantômes utilisés dans les tests de validation et la calibration. Finalement, nous présentons les résultats préliminaires d’acquisitions spectroscopiques sur un muscle humain permettant d’identiEier les différents métabolites phosphorylés à haute énergie. Ces résultats s’inscrivent dans un projet de plus grande envergure où les impacts des changements du métabolisme énergétique sont étudiés en relation avec l’âge et les pathologies.

Caractérisation et évaluation de textiles antifongiques

Hypothèse: L’impression sur textile d’une formulation de microparticules lipidiques avec un principe actif (éconazole nitrate) permet de conserver ou d’améliorer son activité pharmaceutique ex vivo et in vitro. Méthode: Une formulation de microparticules d’éconazole nitrate (ECN) a été formulée par homogénéisation à haut cisaillement, puis imprimée sur un textile LayaTM par une méthode de sérigraphie. La taille des microparticules, la température de fusion des microparticules sur textile et la teneur en éconazole du tissu ont été déterminées. La stabilité de la formulation a été suivie pendant 4 mois à 25°C avec 65% humidité résiduelle (RH). L’activité in vitro des textiles pharmaceutiques a été mesurée et comparée à la formulation commerciale 1% éconazole nitrate (w/w) sur plusieurs espèces de champignons dont le C. albicans, C. glabrata, C. kefyr, C. luminisitae, T. mentagrophytes et T. rubrum. La thermosensibilité des formulations a été étudiée par des tests de diffusion in vitro en cellules de Franz. L’absorption cutanée de l’éconazole a été évaluée ex vivo sur la peau de cochon. Résultats: Les microparticules d’éconazole avaient des tailles de 3.5±0.1 μm. La température de fusion était de 34.8°C. La thermosensibilité a été déterminée par un relargage deux fois supérieur à 32°C comparés à 22°C sur 6 heures. Les textiles ont présenté une teneur stable pendant 4 mois. Les textiles d’ECN in vitro ont démontré une activité similaire à la formulation commerciale sur toutes ii espèces de Candida testées, ainsi qu’une bonne activité contre les dermatophytes. La diffusion sur peau de cochon a démontré une accumulation supérieure dans le stratum corneum de la formulation textile par rapport à la formulation Pevaryl® à 1% ECN. La thermo-sensibilité de la formulation a permis un relargage sélectif au contact de la peau, tout en assurant une bonne conservation à température ambiante.

Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH

Problématique: Le virus du papillome humain (VPH) est présent dans près de 50% des cancers de l’oropharynx. Le potentiel oncogénique du VPH est encodé dans les oncoprotéines E6 et E7, qui agissent en modulant différents gènes, dont les gènes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives démontrent une altération au niveau de la signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (RDA), un mécanisme de contrôle dans l’arrêt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothèse et objectifs : Nous croyons que les défauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent être exploités afin de sensibiliser préférentiellement les cellules cancéreuses aux traitements de radiothérapie. Cette stratégie de recherche nécessite l’élaboration d’un modèle cellulaire de carcinogenèse isogénique pour le cancer de l’oropharynx que nous proposons de développer et de caractériser. L’étude vise à dériver des lignées isogéniques à partir de kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx pour ensuite valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro & in vivo Méthodologie : Des lignées cellulaires de kératinocytes primaires et de cellules épithéliales de l’oropharynx ont été successivement modifiées par transduction afin de présenter les mutations associées aux cancers de l’oropharynx induits par le VPH. Les cellules ont été modifiées avec des lentivirus codants pour la télomérase (hTERT), les oncogènes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancérogenèse in vitro de notre modèle, des études d’invasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont été réalisées. Les populations cellulaires transformées ont été ensuite introduites dans des souris immunodéficientes afin d’évaluer leur tumorogénicité in vivo. Résultats : À partir des plasmides recombinés construits par méthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison « Gateway », nous avons produit des lentivirus codants pour la télomérase humaine (hTERT), les oncogènes viraux E6 et E7 et l’oncogène Ras. Les kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx ont été infectés successivement par transduction et sélectionnés. Nous avons validé l’expression de nos transgènes par méthode d’immunofluorescence, de Western Blot et de réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR). Nous avons établi trois lignées des cellules épithéliales de l’oropharynx (HNOE) à partir d’échantillons tissulaires prélevés lors d’amygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de l’oncogène RasV12 ont présenté un changement morphologique compatible avec une sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras. En exprimant des quantités plus faibles du RasV12 mutant, la lignée cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a réussi à échapper à la sénescence induite par l’oncogène Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a présenté un phénotype malin en culture et à l’étude d'invasion, mais n’a pas démontré de résultats positifs à l’étude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xénogreffe en souris immunodéficientes. Conclusion : Nos résultats démontrent qu’en présence des oncogènes viraux E6 et E7, il y a un troisième mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la sénescence induite par l’oncogène Ras. Nous avons identifié que la présence de E6 seule ne suffit pas à immortaliser les kératinocytes primaires humains (HEKn). Nous n’avons pas réussi à créer un modèle in vitro de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH.

Spectroscopic Investigation of Tooth Caries and Demineralization

Dental caries persists to be the most predominant oral disease in spite of remarkable progress made during the past half- century to reduce its prevalence. Early diagnosis of carious lesions is an important factor in the prevention and management of dental caries. Conventional procedures for caries detection involve visual-tactile and radiographic examination, which is considered as “gold standard”. These techniques are subjective and are unable to detect the lesions until they are well advanced and involve about one-third of the thickness of enamel. Therefore, all these factors necessitate the need for the development of new techniques for early diagnosis of carious lesions. Researchers have been trying to develop various instruments based on optical spectroscopic techniques for detection of dental caries during the last two decades. These optical spectroscopic techniques facilitate noninvasive and real-time tissue characterization with reduced radiation exposure to patient, thereby improving the management of dental caries. Nonetheless, a costeffective optical system with adequate sensitivity and specificity for clinical use is still not realized and development of such a system is a challenging task.Two key techniques based on the optical properties of dental hard tissues are discussed in this current thesis, namely laser-induced fluorescence (LIF) and diffuse reflectance (DR) spectroscopy for detection of tooth caries and demineralization. The work described in this thesis is mainly of applied nature, focusing on the analysis of data from in vitro tooth samples and extending these results to diagnose dental caries in a clinical environment. The work mainly aims to improve and contribute to the contemporary research on fluorescence and diffuse reflectance for discriminating different stages of carious lesions. Towards this, a portable and compact laser-induced fluorescence and reflectance spectroscopic system (LIFRS) was developed for point monitoring of fluorescence and diffuse reflectance spectra from tooth samples. The LIFRS system uses either a 337 nm nitrogen laser or a 404 nm diode laser for the excitation of tooth autofluorescence and a white light source (tungsten halogen lamp) for measuring diffuse reflectance.Extensive in vitro studies were carried out on extracted tooth samples to test the applicability of LIFRS system for detecting dental caries, before being tested in a clinical environment. Both LIF and DR studies were performed for diagnosis of dental caries, but special emphasis was given for early detection and also to discriminate between different stages of carious lesions. Further the potential of LIFRS system in detecting demineralization and remineralization were also assessed.In the clinical trial on 105 patients, fluorescence reference standard (FRS) criteria was developed based on LIF spectral ratios (F500/F635 and F500/F680) to discriminate different stages of caries and for early detection of dental caries. The FRS ratio scatter plots developed showed better sensitivity and specificity as compared to clinical and radiographic examination, and the results were validated with the blindtests. Moreover, the LIF spectra were analyzed by curve-fitting using Gaussian spectral functions and the derived curve-fitted parameters such as peak position, Gaussian curve area, amplitude and width were found to be useful for distinguishing different stages of caries. In DR studies, a novel method was established based on DR ratios (R500/R700, R600/R700 and R650/R700) to detect dental caries with improved accuracy. Further the diagnostic accuracy of LIFRS system was evaluated in terms of sensitivity, specificity and area under the ROC curve. On the basis of these results, the LIFRS system was found useful as a valuable adjunct to the clinicians for detecting carious lesions.

Development of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish Clarias gariepinus

A growth medium with Leibovitz-15 L-15.as the base, supplemented with foetal bovine serum 10% vrv., fish muscle extract 10% vrv., prawn muscle extract 10% vrv., lectin concanavalin A. 0.02 mg mly1., lipopolysaccharide 0.02 mg mly1., glucose D 0.2 mg mly1., ovary extract 0.5% vrv.and prawn haemolymph 0.5%. has been formulated with 354"10 mOsm for the development and maintenance of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish, Clarias gariepinus. For its subculturing, a cell dissociationrextracting solution, composed of equal portions of trypsin phosphate versene glucose TPVG. containing 0.0125% wrv.trypsin and 25% vrv.non-enzymatic cell dissociation solution 1 and 2, has also been developed with which the cell culture can be passaged 15 times after which they cease to multiply and consequently perish. The cell cultures can be maintained for 12–15 days without fluid change between the passages. This is the first report of a cell culture system from the ovarian tissues of African catfish

A novel medium for the development of in vitro cell culture system from Penaeus monodon

Lack of a valid shrimp cell line has been hampering the progress of research on shrimp viruses. One of the reasons identified was the absence of an appropriate medium which would satisfy the requirements of the cells in vitro. We report the first attempt to formulate an exclusive shrimp cell culture medium (SCCM) based on the haemolymph components of Penaeus monodon prepared in isosmotic seawater having 27 % salinity. The SCCM is composed of 22 amino acids, 4 sugars, 6 vitamins, cholesterol, FBS, phenol red, three antibiotics, potassium dihydrogen phosphate and di-sodium hydrogen phosphate at pH 6.8–7.2. Osmolality was adjusted to 720 ± 10 mOsm kg-1 and temperature of incubation was 25 8C. The most appropriate composition was finally selected based on the extent of attachment of cells and their proliferation by visual observation. Metabolic activity of cultured cells was measured by MTT assay and compared with that in L-15 (29), modified L-15 and Grace’s insect medium, and found better performance in SCCM especially for lymphoid cells with 107 % increase in activity and 85 ± 9 days of longevity. The cells from ovary and lymphoid organs were passaged twice using the newly designed shrimp cell dissociation ‘‘cocktail’’.

Biochemical Characterization and Bio-evaluation of Collagen and Collagen Peptides Extracted and Purified from Fish Skin: In vitro and In vivo Studies on Antiarthritic and Wound Healing Properties

In fish processing plants, there is huge amount of skin that is left as the waste. When this skin is taken and processed into fish collagen, it will save large amount of money that is used for extraction of collagen from other animal s.Fish collagen can be used as an alternative to replace mammalian collagen, especially collagen extracted from bovine, when we consider the outbreak of bovine spongiform encephalopathy (BSE), transmissible spongiform encephalopathy (TSE) and the foot - and-mouth disease (FMD) issues. BSE and TSE are progressive neurological disorders affecting cattles caused by proteinacious infectious particles called prions.The study aims in producing collagen that has been extracted from fish skin to replace other animal collagen so as to overcome the problem of other animal collagen issues. Also the study utilized the abandoned fish waste produced by fish processing industry since bone, skin, fin and scales of fish can be a useful source of collagen.

Evaluación a largo plazo en mujeres tratadas con laser para depilación facial en uniláser medica

El vello facial no deseado es un problema común en las mujeres, los tratamientos láser han mostrado efectividad para su manejo. Objetivo: Evaluar los resultados de la depilación láser en cara de las pacientes tratadas a largo plazo (20 sesiones o más ) luego de un seguimiento de 6 meses durante los años 1997 y 2012. Metodología: 55 mujeres que con tipo de piel II a V recibieron 20 o más sesiones de láser con seguimiento mayor a 6 meses posterior al la última sesión. Resultados: la edad promedio fue (32 ± 9,3 años), el 18,2 % presentaban SOP o Hiperandrogenismo el número de sesiones en cara fue de (30,84 ± 12,132), un promedio de disparos de (6,330 ± 7,804), los Kilojulios acumulados tuvieron un promedio de (126,5 ± 161,4) la fluencia promedio fue (18,5 ± 3,2 Julios/cm2), el láser de Alexandrita fue utilizado en el 98% de las pacientes. Se encontró cambios significativos entre el conteo inicial y el final de vello facial (484,9 ± 568.9 (med=300) vs. 103,33± 138,63 (med=60), p<0.001, Test de Wilcoxon). El 32.7% mostraron reducción > 90% (5,5% reducción del 100%). Conclusión : El tratamiento con de depilación con láser mostro una reducción significativa del vello facial, en mujeres mayores de 14 años con un tratamiento a largo plazo (20 sesiones o más), con una tasa de reducción mayor del 90% en 32.7% de las pacientes y un promedio de reducción del grupo de 79,36 ±15,51 %, similar a lo reportado en los diferentes estudios (77%).

16/6-idiotype expressing antibodies induce brain inflammation and cognitive impairment in mice: the mosaic of central nervous system involvement in lupus

Background: The 16/6-idiotype (16/6-Id) of the human anti-DNA antibody was found to induce experimental lupus in naive mice, manifested by production of autoantibodies, leukopenia and elevated inflammatory markers, as well as kidney and brain involvement. We assessed behavior and brain pathology of naive mice injected intracerebra-ventricularly (ICV) with the 16/6-Id antibody. Methods: C3H female mice were injected ICV to the right hemisphere with the human 16/6-Id antibody or commercial human IgG antibodies (control). The mice were tested for depression by the forced swimming test (FST), locomotor and explorative activity by the staircase test, and cognitive functions were examined by the novel object recognition and Y-maze tests. Brain slices were stained for inflammatory processes. Results: 16/6-Id injected mice were cognitively impaired as shown by significant differences in the preference for a new object in the novel object recognition test compared to controls (P = 0.012). Similarly, the preference for spatial novelty in the Y-maze test was significantly higher in the control group compared to the 16/6-Id-injected mice (42% vs. 9%, respectively, P = 0.065). Depression-like behavior and locomotor activity were not significantly different between the16/6-Id-injected and the control mice. Immunohistochemistry analysis revealed an increase in astrocytes and microglial activation in the hippocampus and amygdala, in the 16/6-Id injected group compared to the control. Conclusions: Passive transfer of 16/6-Id antibodies directly into mice brain resulted in cognitive impairments and histological evidence for brain inflammation. These findings shed additional light on the diverse mosaic pathophysiology of neuropsychiatric lupus.

Polimorfismos del gen Butirilcolinesterasa responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína”

La butirilcolinesterasa humana (BChE; EC 3.1.1.8) es una enzima polimórfica sintetizada en el hígado y en el tejido adiposo, ampliamente distribuida en el organismo y encargada de hidrolizar algunos ésteres de colina como la procaína, ésteres alifáticos como el ácido acetilsalicílico, fármacos como la metilprednisolona, el mivacurium y la succinilcolina y drogas de uso y/o abuso como la heroína y la cocaína. Es codificada por el gen BCHE (OMIM 177400), habiéndose identificado más de 100 variantes, algunas no estudiadas plenamente, además de la forma más frecuente, llamada usual o silvestre. Diferentes polimorfismos del gen BCHE se han relacionado con la síntesis de enzimas con niveles variados de actividad catalítica. Las bases moleculares de algunas de esas variantes genéticas han sido reportadas, entre las que se encuentra las variantes Atípica (A), fluoruro-resistente del tipo 1 y 2 (F-1 y F-2), silente (S), Kalow (K), James (J) y Hammersmith (H). En este estudio, en un grupo de pacientes se aplicó el instrumento validado Lifetime Severity Index for Cocaine Use Disorder (LSI-C) para evaluar la gravedad del consumo de “cocaína” a lo largo de la vida. Además, se determinaron Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs) en el gen BCHE conocidos como responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína” mediante secuenciación del gen y se predijo el efecto delos SNPs sobre la función y la estructura de la proteína, mediante el uso de herramientas bio-informáticas. El instrumento LSI-C ofreció resultados en cuatro dimensiones: consumo a lo largo de la vida, consumo reciente, dependencia psicológica e intento de abandono del consumo. Los estudios de análisis molecular permitieron observar dos SNPs codificantes (cSNPs) no sinónimos en el 27.3% de la muestra, c.293A>G (p.Asp98Gly) y c.1699G>A (p.Ala567Thr), localizados en los exones 2 y 4, que corresponden, desde el punto de vista funcional, a la variante Atípica (A) [dbSNP: rs1799807] y a la variante Kalow (K) [dbSNP: rs1803274] de la enzima BChE, respectivamente. Los estudios de predicción In silico establecieron para el SNP p.Asp98Gly un carácter patogénico, mientras que para el SNP p.Ala567Thr, mostraron un comportamiento neutro. El análisis de los resultados permite proponer la existencia de una relación entre polimorfismos o variantes genéticas responsables de una baja actividad catalítica y/o baja concentración plasmática de la enzima BChE y algunas de las reacciones adversas ocurridas en pacientes consumidores de cocaína.

Hallazgos radiológicos de la enfermedad pulmonar en pacientes Colombianos con esclerodermia

La esclerosis sistémica (ES) es una enfermedad autoinmune multisistémica que afecta principalmente la piel, los pulmones, el tracto gastrointestinal, el corazón y los riñones. La enfermedad pulmonar, presente en casi el 100% de los casos, es el factor con mayor influencia en la mortalidad. El propósito de este estudio es realizar un análisis detallado de la enfermedad pulmonar por tomografía computarizada de alta resolución(TCAR) en pacientes Colombianos con ES, para lo cual se realizó un estudio de prevalencia analítica en 44 pacientes con ES valorados en el Hospital Universitario Mayor Méderi en los últimos 7 años. Los resultados mostraron características demográficas y clínicas similares a las previamente descritas. La prevalencia de enfermedad pulmonar intersticial fue alta, y los hallazgos de fibrosis pulmonar como vidrio esmerilado y panal de abejas se asociaron con la presencia del autoanticuerpo antiSCL70. La medida del diámetro esofágico por TCAR fue mayor en los pacientes con disfagia, antiSCL 70 y linfopenia, los cuales son marcadores de mal pronóstico.

Topical delivery of a naproxen-dithranol co-drug: in vitro skin penetration, permeation, and staining

Purpose This work probed the topical delivery and skin-staining properties of a novel co-drug, naproxyl-dithranol (Nap-DTH), which comprises anti-inflammatory (naproxen) and anti-proliferative (dithranol) moieties. Method Freshly excised, full-thickness porcine ear skin was dosed with saturated solutions of the compounds. After 24 h, the skin was recovered and used to prepare comparative depth profiles by the tape-stripping technique and to examine the extent of skin staining. Results Depth profiles showed that Nap-DTH led to a 5-fold increase in drug retention in the skin compared to dithranol. The application of Nap-DTH also demonstrated improved stability, resulting in lower levels of dithranol degradation products in the skin. Furthermore, significantly less naproxen from hydrolysed Nap-DTH permeated into the receptor phase compared to naproxen when applied alone (0.08 ± 0.03 nmol cm-² and 180 ± 60 nmol cm-², respectively). Moreover, the reduced staining of the skin was very apparent for Nap-DTH compared to dithranol. Conclusions Topical delivery of Nap-DTH not only improves the delivery of naproxen and dithranol, but also reduces unwanted effects of the parent moieties, in particular the skin staining, which is a major issue concerning the use of dithranol.

Difference in competence for in vitro proliferation and ex vitro growth of genetically identical mature and juvenile clones of apomictic Malus species

The apomictic system in Malus wits Used Is a model to examine rejuvenation by generating genetically identical tissue culture lines that had two entirely different developmental origins: either embryo-derived tissues (juvenile clones) or somatic tissue from the adult/mature tree (mature clones). These two lines were then subsequently used to examine in vitro difference between mature (M) and juvenile (J) tissues in potential for shoot, root proliferation and ex vitro (glasshouse) growth. The M clones of M. hupehensis and M. toringoides in vitro had significantly fewer total shoots and shoot more than 2 cm in length per proliferating explant than the J clones and also rooted less efficiently. Ex vitro (glasshouse) juvenile clones had shorter internodes, a greater number of leaves and more dry weight compared to their mature counterparts.

In vitro fermentation of carbohydrates by porcine faecal inocula and their influence on Salmonella Typhimurium growth in batch culture systems

The aim of this study was to evaluate in vitro the influence of fermentable carbohydrates on the activity of porcine microbiota and survival of Salmonella Typhimurium in a batch culture system simulating the porcine hindgut. The carbohydrates tested were xylooligosaccharides, a mixture of fructooligosaccharides/inulin (FIN), fructooligosaccharides (FOS), gentiooligosaccharides (GEO) and lactulose (LAC). These ingredients stimulated the growth of selected Bifidobacterium and Lactobacillus species in pure cultures. In batch cultures, the carbohydrates influenced some fermentation parameters. For example, GEO and FIN significantly increased lactic acids compared with the control (no added carbohydrate). With the exception of LAC, the test carbohydrates increased the production of short-chain fatty acid (SCFA) and modified SCFA profiles. Quantitative analysis of bacterial populations by FISH revealed increased counts of the Bifidobacterium group compared with control and, with exception of FOS, increased Lactobacillus, Leuconostoc and Weissella spp. counts. Salmonella numbers were the lowest during the fermentation of LAC. This work has looked at carbohydrate metabolism by porcine microbiota in a pH-controlled batch fermentation system. It provides an initial model to analyse interactions with pathogens.