Stability of the Transthyretin Molecule as a Key Factor in

Transthyretin (TTR) protects against A-Beta toxicity by binding the peptide thus inhibiting its aggregation. Previous work showed different TTR mutations interact differently with A-Beta, with increasing affinities correlating with decreasing amyloidogenecity of the TTR mutant; this did not impact on the levels of inhibition of A-Beta aggregation, as assessed by transmission electron microscopy. Our work aimed at probing differences in binding to A-Beta by WT, T119M and L55P TTR using quantitative assays, and at identifying factors affecting this interaction. We addressed the impact of such factors in TTR ability to degrade A-Beta. Using a dot blot approach with the anti-oligomeric antibody A11, we showed that A-Beta formed oligomers transiently, indicating aggregation and fibril formation, whereas in the presence of WT and T119M TTR the oligomers persisted longer, indicative that these variants avoided further aggregation into fibrils. In contrast, L55PTTR was not able to inhibit oligomerization or to prevent evolution to aggregates and fibrils. Furthermore, apoptosis assessment showed WT and T119M TTR were able to protect against A-Beta toxicity. Because the amyloidogenic potential of TTR is inversely correlated with its stability, the use of drugs able to stabilize TTR tetrameric fold could result in increased TTR/ABeta binding. Here we showed that iododiflunisal, 3-dinitrophenol, resveratrol, [2-(3,5-dichlorophenyl)amino] (DCPA) and [4- (3,5-difluorophenyl)] (DFPB) were able to increase TTR binding to A-Beta; however only DCPA and DFPB improved TTR proteolytic activity. Thyroxine, a TTR ligand, did not influence TTR/A-Beta interaction and A-Beta degradation by TTR, whereas RBP, another TTR ligand, not only obstructed the interaction but also inhibited TTR proteolytic activity. Our results showed differences between WT and T119M TTR, and L55PTTR mutant regarding their interaction with A-Beta and prompt the stability of TTR as a key factor in this interaction, which may be relevant in AD pathogenesis and for the design of therapeutic TTR-based therapies.

Cytotoxicity in L929 fibroblasts and inhibition of herpes simplex virus type 1 Kupka by estuarine cyanobacteria extracts

The cyanobacteria are known to be a rich source of metabolites with a variety of biological activities in different biological systems. In the present work, the bioactivity of aqueous and organic (methanolic and hexane) crude extracts of cyanobacteria isolated from estuarine ecosystems was studied using different bioassays. The assessment of DNA damage on the SOS gene repair region of mutant PQ37 strain of Escherichia coli was performed. Antiviral activity was evaluated against influenza virus, HRV-2, CVB3 and HSV-1 viruses using crystal violet dye uptake on HeLa, MDCK and GMK cell lines. Cytotoxicity evaluation was performed with L929 fibroblasts by MTT assay. Of a total of 18 cyanobacterial isolates studied, only the crude methanolic extract of LEGE 06078 proved to be genotoxic (IF > 1.5) in a dose-dependent manner and other four were putative candidates to induce DNA damage. Furthermore, the crude aqueous extract of LEGE 07085 showed anti- herpes type 1 activity (IC50 = 174.10 μg dry extract mL−1) while not presenting any cytotoxic activity against GMK cell lines. Of the 54 cyanobacterial extracts tested, only the crude methanolic and hexane ones showed impair on metabolic activity of L929 fibroblasts after long exposure (48–72 h). The inhibition of HSV-1 and the strong cytotoxicity against L929 cells observed emphasizes the importance of evaluating the impact of those estuarine cyanobacteria on aquatic ecosystem and on human health. The data also point out their potential application in HSV-1 treatment and pharmacological interest.

Onychomycosis caused by Scytalidium dimidiatum. Report of two cases. Review of the taxonomy of the synanamorph and anamorph forms of this coelomycete

The authors report two cases of onychomycosis in the dystrophic form, one of them involving an HIV-positive patient, provoked by Scytalidium dimidiatum, previously called Scytalidium lignicola. The subject is reviewed from the taxonomic viewpoint, considering the anamorph Hendersonula toruloidea as a synonym of Nattrassia mangiferae, and having Scytalidium dimidiatum as the major synanamorph. According to many mycologists, Scytalidium hyalinum may be a separate species or a hyaline mutant of Scytalidium dimidiatum. Scytalidium lignicola Pesante 1957 was considered to be the type-species of the genus by ELLIS (1971)13 and later to be a "conidial state" of Hendersonula toruloidea by the same author, today known as Nattrassia mangiferae. The microorganism lives only on the roots of certain plants (mainly Platanus and Pinus). It produces pycnidia and is not considered to be a pathogen, although it is considered as a possible emerging agent capable of provoking opportunistic fungal lesions. The importance of this topic as one of the most outstanding in fungal taxonomy, so likely to be modified over time, as well as its interest in the field of dermatologic mycology, are emphasized.

Avaliação do papel da glutationa e do vacúolo como mecanismos de defesa contra a toxicidade induzida pelo chumbo na levedura Saccharomyces cerevisiae

A presença de metais pesados no meio ambiente deve-se, principalmente, a actividades antropogénicas. Ao contrário do Cu e do Zn, que em baixas concentrações são essenciais para o normal funcionamento celular, não se conhece para o chumbo nenhuma função biológica. O chumbo apresenta efeitos tóxicos, e considerado possível agente carcinogéneo, sendo classificado como poluente prioritário pela Agencia de Protecção Ambiental dos EUA (US-EPA). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel da glutationa e do vacúolo, como mecanismos de defesa, contra os efeitos tóxicos induzidos pelo chumbo, usando como modelo a levedura Saccharomyces cerevisiae. A levedura S. cerevisiae quando exposta a varias concentrações de chumbo, durante 3h, perde a viabilidade e acumula espécies reativas de oxigénio (ROS). O estudo comparativo da perda de viabilidade e acumulação de ROS em células de uma estirpe selvagem (WT) e de estirpes mutantes, incapazes de produzir glutationa devido a uma deficiência no gene GSH1 (gsh1) ou GSH2 (gsh2) mostrou que as estirpes gsh1 ou(gsh2 não apresentavam um aumento da sensibilidade ao efeito toxico do chumbo. No entanto, o tratamento de células da estirpe WT com iodoacetamida (um agente alquilante que induz a depleção de glutationa) aumentou a sensibilidade das células a presença de chumbo. Pelo contrário, o enriquecimento em GSH, através da incubação de células WT com glucose e uma mistura de aminoácidos que constituem a GSH (acido L-glutâmico, L-cisteína e glicina), reduziu o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. A importância do vacúolo, como mecanismo de defesa, foi avaliada através da utilização de um mutante sem qualquer estrutura vacuolar (vps16) ou de mutantes deficientes na subunidade catalítica A (vma1) ou B (vma2) ou no proteolítico - subunidade C (vma3) da V-ATPase. As células da estirpe ƒ´vps16 apresentaram uma elevada suscetibilidade a presença de chumbo. As células das estirpes deficientes na subunidade A, B ou c da V-ATPase, apresentaram uma maior perda de viabilidade, quando expostas a chumbo, do que as células da estirpe WT, mas menor do que a da estirpe vps16 Em conclusão, os resultados obtidos, no seu conjunto, sugerem que a glutationa esta envolvida na defesa contra a toxicidade provocada por chumbo; todavia, a glutationa, por si só, parece não ser suficiente para suster o stress oxidativo e a perda de viabilidade induzida por chumbo. O vacúolo parece constituir um importante mecanismo de defesa contra a toxicidade provocada por chumbo. A V-ATPase parece estar envolvida na compartimentação de chumbo no vacúolo.

Juvenile Parkinson disease caused by parkin mutations: large deletions and pathogenic mechanisms

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Role of the DHH1 Gene in the Regulation of Monocarboxylic Acids Transporters Expression in Saccharomyces cerevisiae

Previous experiments revealed that DHH1, a RNA helicase involved in the regulation of mRNA stability and translation, complemented the phenotype of a Saccharomyces cerevisiae mutant affected in the expression of genes coding for monocarboxylic-acids transporters, JEN1 and ADY2 (Paiva S, Althoff S, Casal M, Leao C. FEMS Microbiol Lett, 1999, 170∶301–306). In wild type cells, JEN1 expression had been shown to be undetectable in the presence of glucose or formic acid, and induced in the presence of lactate. In this work, we show that JEN1 mRNA accumulates in a dhh1 mutant, when formic acid was used as sole carbon source. Dhh1 interacts with the decapping activator Dcp1 and with the deadenylase complex. This led to the hypothesis that JEN1 expression is post-transcriptionally regulated by Dhh1 in formic acid. Analyses of JEN1 mRNAs decay in wild-type and dhh1 mutant strains confirmed this hypothesis. In these conditions, the stabilized JEN1 mRNA was associated to polysomes but no Jen1 protein could be detected, either by measurable lactate carrier activity, Jen1-GFP fluorescence detection or western blots. These results revealed the complexity of the expression regulation of JEN1 in S. cerevisiae and evidenced the importance of DHH1 in this process. Additionally, microarray analyses of dhh1 mutant indicated that Dhh1 plays a large role in metabolic adaptation, suggesting that carbon source changes triggers a complex interplay between transcriptional and post-transcriptional effects.

ABCC Subfamily Vacuolar Transporters are Involved in Pb (Lead) Detoxification in Saccharomyces cerevisiae

The present work has as objective to contribute for the elucidation of the mechanism associated with Pb detoxification, using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism. The deletion of GTT1 or GTT2 genes, coding for functional glutathione transferases (GST) enzymes in S. cerevisiae, caused an increased susceptibility to high Pb concentrations (500-1000 μmol L(-1)). These results suggest that the formation of glutathione-Pb conjugate (GS-Pb), dependent of GSTs, is important in Pb detoxification. The involvement of ATP-binding cassette (ABC) vacuolar transporters, belonging to class C subfamily (ABCC) in vacuolar compartmentalization of Pb, was evaluated. For this purpose, mutant strains disrupted in YCF1, VMR1, YBT1 or BPT 1 genes were used. All mutants tested, without vacuolar ABCC transporters, presented an increased sensitivity to 500-1000 μmol L(-1) Pb comparative to wild-type strain. Taken together, the obtained results suggest that Pb detoxification, by vacuolar compartmentalization, can occur as a result of the concerted action of GSTs and vacuolar ABCC transporters. Pb is conjugated with glutathione, catalysed by glutathione transferases and followed to the transport of GS-Pb conjugate to the vacuole by ABCC transporters.

Candida glabrata susceptibility to antifungals and phagocytosis is modulated by acetate

Candida glabrata is considered a major opportunistic fungal pathogen of humans. The capacity of this yeast species to cause infections is dependent on the ability to grow within the human host environment and to assimilate the carbon sources available. Previous studies have suggested that C. albicans can encounter glucose-poor microenvironments during infection and that the ability to use alternative non-fermentable carbon sources, such as carboxylic acids, contributes to the virulence of this fungus. Transcriptional studies on C. glabrata cells identified a similar response, upon nutrient deprivation. In this work, we aimed at analyzing biofilm formation, antifungal drug resistance, and phagocytosis of C. glabrata cells grown in the presence of acetic acid as an alternative carbon source. C. glabrata planktonic cells grown in media containing acetic acid were more susceptible to fluconazole and were better phagocytosed and killed by macrophages than when compared to media lacking acetic acid. Growth in acetic acid also affected the ability of C. glabrata to form biofilms. The genes ADY2a, ADY2b, FPS1, FPS2, and ATO3, encoding putative carboxylate transporters, were upregulated in C. glabrata planktonic and biofilm cells in the presence of acetic acid. Phagocytosis assays with fps1 and ady2a mutant strains suggested a potential role of FPS1 and ADY2a in the phagocytosis process. These results highlight how acidic pH niches, associated with the presence of acetic acid, can impact in the treatment of C. glabrata infections, in particular in vaginal candidiasis.

Estudo da Toxicidade do Chumbo na Levedura Saccharomyces cerevisiae

O chumbo é um importante poluente ambiental. A levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um modelo útil para o estudo dos efeitos tóxicos do chumbo. O conhecimento dos mecanismos de defesa e resistência à presença de metais pesados poderá ser útil em tecnologias de proteção ambiental, nomeadamente no desenvolvimento de novas metodologias para a biorremediação de metais pesados. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto do Pb na capacidade proliferativa, na integridade membranar e na produção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS), na estirpe laboratorial da levedura Saccharomyces cerevisiae BY4741 (estirpe selvagem, WT). Foi também estudado o papel das mitocôndrias, como fonte de ROS induzida por Pb, e o envolvimento da H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) e de transportadores vacuolares pertencentes à superfamília ABC (de ATP-binding cassette) na defesa contra a toxicidade do Pb. O estudo cinético do impacto de duas concentrações de Pb na viabilidade das leveduras (avaliado através de um ensaio clonogénico), na integridade da membrana celular (determinada com iodeto de propídio) e na produção intracelular de ROS (o anião superóxido foi detetado com dihidroetídio e o peróxido de hidrogénio com 2’,7’- diclorodihidrofluoresceína), revelou uma perda progressiva da capacidade proliferativa (53 e 17% de células viáveis, após a exposição durante 3h a 250 ou 1000 µmol/l de chumbo, respetivamente), coincidente com a acumulação intracelular de anião superóxido e de peróxido de hidrogénio, na ausência de perda da integridade membranar. A importância das mitocôndrias na produção de ROS, induzida por chumbo, foi levada a cabo usando um mutante deficiente respiratório desprovido de ADN mitocondrial (ƿ0). Quando comparado com a respetiva estirpe parental, o mutante ƿ0 apresentou uma maior resistência ao Pb e uma menor produção de ROS induzida por Pb. A exposição das células da estirpe BY4741 a 250 e 1000 µmol/l de chumbo originou a formação de 49 e 58% de células deficientes respiratórias, respetivamente. A função da V-ATPase, na desintoxicação de chumbo, foi avaliada utilizando mutantes com uma estrutura vacuolar normal mas defetivos em subunidades da VATPase (vma1Δ, vma2Δ, vma3Δ e vph1Δ). Comparativamente às células da estirpe WT, todos os mutantes testados, sem V-ATPase funcional, apresentaram uma maior suscetibilidade ao Pb. O papel dos transportadores vacuolares pertencentes à superfamília ABC, na defesa contra a toxicidade induzida por chumbo, foi levada a cabo utilizando mutantes sem os transportadores Ycf1p ou Vmr1p. Os resultados preliminares mostraram que quando comparadas com as células da estirpe WT, as células das estirpes ycf1Δ ou vmr1Δ não apresentavam uma maior perda da viabilidade. A modificação da morfologia vacuolar, em células expostas a chumbo, foi visualizada utilizando a estirpe Vma2p-GFP. O tratamento das células com Pb originou a fusão dos vacúolos de tamanho médio num único vacúolo de grande dimensão. Em conclusão, os estudos desenvolvidos no presente trabalho, utilizando a estirpe laboratorial BY4741, mostraram que a perda da capacidade proliferativa das leveduras, induzida pelo chumbo, pode ser atribuída à acumulação intracelular do anião superóxido e de peróxido de hidrogénio. As mitocôndrias parecem ser uma das principais fontes de ROS induzido por Pb e, simultaneamente, um dos principais alvos da sua toxicidade. Em S. cerevisiae, o vacúolo desempenha um papel importante na desintoxicação do Pb. A modificação da morfologia vacuolar após exposição ao chumbo poderá ser a consequência da acumulação de Pb no vacúolo. Enquanto os transportadores da superfamília ABC parecem não estar envolvidos na sequestração vacuolar de Pb, é necessária a presença, num estado funcional, da V-ATPase para que ocorra a compartimentação do Pb. Muito provavelmente, a compartimentação do Pb no vacúolo previne a sua acumulação no citosol e o desencadear dos respetivos efeitos tóxicos.

Cilia motility studies in zebrafish embryos

A thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Masters in Molecular Genetics and Biomedicine

Deletions within COL11A1 in Type 2 Stickler Syndrome Detected by Multiplex Ligation - Syndrome Detected by Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA)

Background: COL11A1 is a large complex gene around 250 kb in length and consisting of 68 exons. Pathogenic mutations in the gene can result in Stickler syndrome, Marshall syndrome or Fibrochondrogenesis. Many of the mutations resulting in either Stickler or Marshall syndrome alter splice sites and result in exon skipping, which because of the exon structure of collagen genes usually leaves the message in-frame. The mutant protein then exerts a dominant negative effect as it co-assembles with other collagen gene products. To date only one large deletion of 40 kb in the COL11A1, which was detected by RT-PCR, has been characterized. However, commonly used screening protocols, utilizing genomic amplification and exon sequencing, are unlikely to detect such large deletions. Consequently the frequency of this type of mutation is unknown. Case presentations: We have used Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) in conjunction with exon amplification and sequencing, to analyze patients with clinical features of Stickler syndrome, and have detected six novel deletions that were not found by exon sequencing alone. Conclusion: Exon deletions appear to represent a significant proportion of type 2 Stickler syndrome. This observation was previously unknown and so diagnostic screening of COL11A1 should include assays capable of detecting both large and small deletions, in addition to exon sequencing.

Hiperlordose Lombar

Objectivos: Pretendeu-se fazer uma revisão da literatura disponível sobre hiperlordose lombar: apresentar uma definição, abordar a etiopatogenia, o diagnóstico e enunciar a classificação etiológica, descrevendo para cada forma as suas particularidades, fisiopatologia, clínica e tratamento, incidindo na reabilitação. Material e Métodos: Foram pesquisados livros de texto de referência de Medicina Física e de Reabilitação (MFR) e artigos de bases de dados electrónicas, utilizando os termos “hiperlordose lombar”, “hiperlordose”, “lordose lombar” e “lordose”. Limitou-se a procura a artigos de revisão publicados na língua inglesa ou francesa, em que o termo utilizado constasse no título, resumo e/ou palavras-chave e em que estivesse disponível o resumo e o artigo completo. Após a selecção de informação, o suporte bibliográfico constou em 4 capítulos de livros de texto e 40 artigos científicos. Resultados: A lordose lombar é uma curva no plano sagital da coluna lombar com vértice anterior, que pode ser medida na radiografia de perfil, utilizando o método de Cobb. A Scoliosis Research Society (SRS) estipulou como ângulos fisiológicos o intervalo entre 31º e 79º. O diagnóstico de hiperlordose lombar é estabelecido quando se identifica uma curva com um ângulo superior ao fisiológico. Esta patologia é mais frequentemente assintomática, embora se possa manifestar por lombalgia e diminuição da flexibilidade da coluna lombar. De acordo com a SRS, pode ser classificada em postural (forma mais frequente), congénita (devido a anomalias do desenvolvimento embrionário vertebral), pós-laminectomia (iatrogénica), neuromuscular (resultando de desequilíbrios do tónus e da força muscular), secundária a contractura em flexão da anca e associada a outras causas. As formas associadas a espondilólise (frequente em adolescentes que praticam desportos que envolvem hiperextensão lombar repetitiva) e espondilolistese (atribuível a múltiplas etiologias) foram incluídas na classificação por vários autores. A abordagem da MFR no tratamento da hiperlordose lombar pode envolver medidas gerais, cinesiterapia e utilização de ortóteses; alguns casos têm indicação cirúrgica. Conclusões: A hiperlordose lombar é uma alteração estática da coluna de diagnóstico simples, assente no exame físico e confirmação radiológica. A intervenção da MFR tem um papel preponderante na detecção desta patologia e no benefício das suas opções terapêuticas, visando a melhoria da qualidade de vida dos doentes.

Studies on BolA and ribonuclease R: two important factors in the control of bacterial gene expression

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

MOLECULAR SURVEILLANCE OF Plasmodium vivax AND Plasmodium falciparum DHFR MUTATIONS IN ISOLATES FROM SOUTHERN IRAN

In Iran, both Plasmodium vivax and P. falciparum malaria have been detected, but P. vivax is the predominant species. Point mutations in dihydrofolate reductase (dhfr) gene in both Plasmodia are the major mechanisms of pyrimethamine resistance. From April 2007 to June 2009, a total of 134 blood samples in two endemic areas of southern Iran were collected from patients infected with P. vivax and P. falciparum. The isolates were analyzed for P. vivax dihydrofolate reductase (pvdhfr) and P. falciparum dihydrofolate reductase (pfdhfr) point mutations using various PCR-based methods. The majority of the isolates (72.9%) had wild type amino acids at five codons of pvdhfr. Amongst mutant isolates, the most common pvdhfr alleles were double mutant in 58 and 117 amino acids (58R-117N). Triple mutation in 57, 58, and 117 amino acids (57L/58R/117N) was identified for the first time in the pvdhfr gene of Iranian P. vivax isolates. All the P. falciparumsamples analyzed (n = 16) possessed a double mutant pfdhfrallele (59R/108N) and retained a wild-type mutation at position 51. This may be attributed to the fact that the falciparum malaria patients were treated using sulfadoxine-pyrimethamine (SP) in Iran. The presence of mutant haplotypes in P. vivax is worrying, but has not yet reached an alarming threshold regarding drugs such as SP. The results of this study reinforce the importance of performing a molecular surveillance by means of a continuous chemoresistance assessment.

Transplante hepático sequencial com preservação da veia cava inferior (técnica de "Duplo Piggyback") : uma técnica original

RESUMO:Desde a declaração de Bethesda em 1983, a transplantação hepática é considerada um processo válido e aceite na prática clínica para muitos doentes com doença hepática terminal, relativamente aos quais não houvesse outra alternativa terapêutica. Em 1991, por proposta de Holmgren, professor de genética, o cirurgião sueco Bo Ericzon realizou em Huntingdon (Estocolmo) o primeiro transplante hepático num doente PAF (Polineuropatia Amilloidótica Familiar), esperando que a substituição do fígado pudesse frenar a evolução da doença. Nesta doença hereditária autossómica dominante, o fígado, apesar de estrutural e funcionalmente normal, produz uma proteína anormal (TTR Met30) responsável pela doença. A partir de então, a transplantação hepática passou a ser a única terapêutica eficaz para estes doentes. Portugal é o país do mundo com mais doentes PAF, tendo sido o médico neurologista português Corino de Andrade quem, em 1951, identificou e descreveu este tipo particular de polineuropatia hereditária, também conhecida por doença de Andrade. Com o início da transplantação hepática programada em Setembro de 1992, o primeiro doente transplantado hepático em Portugal, no Hospital Curry Cabral, foi um doente PAF. Desde logo se percebeu que a competição nas listas de espera em Portugal, entre doentes hepáticos crónicos e doentes PAF viria a ser um problema clínico e ético difícil de compatibilizar. Em 1995, Linhares Furtado, em Coimbra, realizou o primeiro transplante dum fígado dum doente PAF num doente com doença hepática metastática, ficando este tipo de transplante conhecido como transplante sequencial ou “em dominó”. Fê-lo no pressuposto de que o fígado PAF, funcional e estruturalmente normal, apesar de produzir a proteína mutada causadora da doença neurológica, pudesse garantir ao receptor um período razoável de vida livre de sintomas, tal como acontece na história natural desta doença congénita, cujas manifestações clínicas apenas se observam na idade adulta. A técnica cirúrgica mais adequada para transplantar o doente PAF é a técnica de “piggyback”, na qual a hepatectomia é feita mantendo a veia cava do doente, podendo o transplante ser feito sem recorrer a bypass extracorporal. Antes de 2001, para fazerem o transplante sequencial, os diferentes centros alteraram a técnica de hepatectomia no doente PAF, ressecando a cava com o fígado conforme a técnica clássica, recorrendo ao bypass extracorporal. No nosso centro imaginámos e concebemos uma técnica original, com recurso a enxertos venosos, que permitisse ao doente PAF submeter-se à mesma técnica de hepatectomia no transplante, quer ele viesse a ser ou não dador. Essa técnica, por nós utilizada pela primeira vez a nível mundial em 2001, ficou conhecida por Transplante Sequencial em Duplo Piggyback. Este trabalho teve como objectivo procurar saber se a técnica por nós imaginada, concebida e utilizada era reprodutível, se não prejudicava o doente PAF dador e se oferecia ao receptor hepático as mesmas garantias do fígado de cadáver. A nossa série de transplantes realizados em doentes PAF é a maior a nível mundial, assim como o é o número de transplantes sequenciais de fígado. Recorrendo à nossa base de dados desde Setembro de 1992 até Novembro de 2008 procedeu-se à verificação das hipóteses anteriormente enunciadas. Com base na experiência por nós introduzida, a técnica foi reproduzida com êxito em vários centros internacionais de referência, que por si provaram a sua reprodutibilidade. Este sucesso encontra-se publicado por diversos grupos de transplantação hepática a nível mundial. Observámos na nossa série que a sobrevivência dos doentes PAF que foram dadores é ligeiramente superior àqueles que o não foram, embora sem atingir significância estatística. Contudo, quando se analisaram, apenas, estes doentes após a introdução do transplante sequencial no nosso centro, observa-se que existe uma melhor sobrevida nos doentes PAF dadores (sobrevida aos 5 anos de 87% versus 71%, p=0,047).Relativamente aos receptores observámos que existe um benefício a curto prazo em termos de morbi-mortalidade (menor hemorragia peri-operatória) e a longo prazo alguns grupos de doentes apresentaram diferenças de sobrevida, embora sem atingir significância estatística, facto este que pode estar relacionado com a dimensão das amostras parcelares analisadas. Estes grupos são os doentes com cirrose a vírus da hepatite C e os doentes com doença hepática maligna primitiva dentro dos critérios de Milão. Fora do âmbito deste trabalho ficou um aspecto relevante que é a recidiva da doença PAF nos receptores de fígado sequencial e o seu impacto no longo prazo. Em conclusão, o presente trabalho permite afirmar que a técnica por nós introduzida pela primeira vez a nível mundial é exequível e reprodutível e é segura para os doentes dadores de fígado PAF, que não vêem a sua técnica cirúrgica alterada pelo facto de o serem. Os receptores não são, por sua vez, prejudicados por receberem um fígado PAF, havendo mesmo benefícios no pós-operatório imediato e, eventualmente, alguns grupos específicos de doentes podem mesmo ser beneficiados.---------ABSTRACT: Ever since Bethesda statement in 1983, Liver Transplantation has been accepted as a clinical therapeutic procedure for many patients with advanced hepatic failure Holmgren, professor of genetics, suggested that one could expect that transplanting a new liver could lead to improve progressive neurological symptoms of Familial Amyloidotic Polyneuropathy (PAF). Bo Ericzon, the transplant surgeon at Huddinge Hospital in Stockholm, Sweden, did in 1991 the first Liver Transplant on a FAP patient. FAP is an inherited autosomal dominant neurologic disease in which the liver, otherwise structural an functionally normal, produces more than 90% of an abnormal protein (TTR Met30) whose deposits are responsible for symptoms. Liver Transplantation is currently the only efficient therapy available for FAP patients. Portugal is the country in the world where FAP is most prevalent. The Portuguese neurologist Corino de Andrade was the first to recognize in 1951 this particular form of inherited polyneuropathy, which is also known by the name of Andrade disease. Liver Transplantation started as a program in Portugal in September 1992. The first patient transplanted in Lisbon, Hospital Curry Cabral, was a FAP patient. From the beginning we did realize that competition among waiting lists of FAP and Hepatic patients would come to be a complex problem we had to deal with, on clinical and ethical grounds. There was one possible way-out. FAP livers could be of some utility themselves as liver grafts. Anatomically and functionally normal, except for the inherited abnormal trace, those livers could possibly be transplanted in selected hepatic patients. Nevertheless the FAP liver carried with it the ability to produce the mutant TTR protein. One could expect, considering the natural history of the disease that several decades would lapse before the recipient could suffer symptomatic neurologic disease, if at all. In Coimbra, Portugal, Linhares Furtado performed in 1995 the first transplant of a FAP liver to a patient with metastatic malignant disease, as a sequential or “domino” transplant. FAP Liver Transplant patients, because of some dysautonomic labiality and unexpected reactions when they are subjected to surgery, take special advantage when piggyback technique is used for hepatectomy. This technique leaves the vena cava of the patient undisturbed, so that return of blood to the heart is affected minimally, so that veno-venous extracorporeal bypass will not be necessary. The advantages of piggyback technique could not be afforded to FAP patients who became donors for sequential liver transplantation, before we did introduce our liver reconstruction technique in 2001. The hepatectomy took the vena cava together with the liver, which is the classical technique, and the use of extracorporeal veno-venous bypass was of necessity in most cases. The reconstruction technique we developed in our center and used for the first time in the world in 2001 consists in applying venous grafts to the supra-hepatic ostia of piggyback resected FAP livers so that the organ could be grafted to a hepatic patient whose liver was itself resected with preservation of the vena cava. This is the double piggyback sequential transplant of the liver. It is the objective of this thesis to evaluate the results of this technique that we did introduce, first of all that it is reliable and reproducible, secondly that the FAP donor is not subjected to any additional harm during the procedure, and finally that the recipient has the same prospects of a successful transplant as if the liver was collected from a cadaver donor. Our series of liver transplantation on FAP patients and sequential liver transplants represent both the largest experience in the world. To achieve the analysis of the questions mentioned above, we did refer to our data-base from September 1992 to November 2008. The reconstructive technique that we did introduce is feasible: it could be done with success in every case ion our series. It is also reproducible. It has been adopted by many international centers of reference that did mention it in their own publications. We do refer to our data-base in what concerns the safety for the FAP donor.Five years survival of FAP transplanted patients that have been donors (n=190) has been slightly superior to those who were not (n=77), with no statistical significance. However, if we consider five year survival of FAP transplanted patients after the beginning of sequential transplant program in our center, survival is better among those patients whose liver was used as a transplant (87% survival versus 71%, p=0.047). In what concerns recipients of FAP livers: Some short-term benefit of less perioperative morbi-mortality mainly less hemorrhage. In some groups of particular pathologies, there is a strong suggestion of better survival, however the scarcity of numbers make the differences not statistically significant. Patients with cirrhosis HVC (83% versus73%) and patients with primitive hepatic cancer within Milan criteria (survival of 70% versus 58%) are good examples. There is one relevant problem we left beyond discussion in the present work: this is the long-term impact of possible recurrence of FAP symptoms among recipients of sequential transplants. In Conclusion: The reconstruction technique that we did develop and introduce is consistently workable and reproducible. It is safe for FAP donors with the advantage that removal of vena cava can be avoided. Hepatic patients transplanted with those livers suffer no disadvantages and have the benefit of less hemorrhage. There is also a suggestion that survival could be better in cirrhosis HVC and primary liver cancer patients.