Estudo da Toxicidade do Chumbo na Levedura Saccharomyces cerevisiae

O chumbo é um importante poluente ambiental. A levedura Saccharomyces cerevisiae constitui um modelo útil para o estudo dos efeitos tóxicos do chumbo. O conhecimento dos mecanismos de defesa e resistência à presença de metais pesados poderá ser útil em tecnologias de proteção ambiental, nomeadamente no desenvolvimento de novas metodologias para a biorremediação de metais pesados. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto do Pb na capacidade proliferativa, na integridade membranar e na produção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROS), na estirpe laboratorial da levedura Saccharomyces cerevisiae BY4741 (estirpe selvagem, WT). Foi também estudado o papel das mitocôndrias, como fonte de ROS induzida por Pb, e o envolvimento da H+-ATPase vacuolar (V-ATPase) e de transportadores vacuolares pertencentes à superfamília ABC (de ATP-binding cassette) na defesa contra a toxicidade do Pb. O estudo cinético do impacto de duas concentrações de Pb na viabilidade das leveduras (avaliado através de um ensaio clonogénico), na integridade da membrana celular (determinada com iodeto de propídio) e na produção intracelular de ROS (o anião superóxido foi detetado com dihidroetídio e o peróxido de hidrogénio com 2’,7’- diclorodihidrofluoresceína), revelou uma perda progressiva da capacidade proliferativa (53 e 17% de células viáveis, após a exposição durante 3h a 250 ou 1000 µmol/l de chumbo, respetivamente), coincidente com a acumulação intracelular de anião superóxido e de peróxido de hidrogénio, na ausência de perda da integridade membranar. A importância das mitocôndrias na produção de ROS, induzida por chumbo, foi levada a cabo usando um mutante deficiente respiratório desprovido de ADN mitocondrial (ƿ0). Quando comparado com a respetiva estirpe parental, o mutante ƿ0 apresentou uma maior resistência ao Pb e uma menor produção de ROS induzida por Pb. A exposição das células da estirpe BY4741 a 250 e 1000 µmol/l de chumbo originou a formação de 49 e 58% de células deficientes respiratórias, respetivamente. A função da V-ATPase, na desintoxicação de chumbo, foi avaliada utilizando mutantes com uma estrutura vacuolar normal mas defetivos em subunidades da VATPase (vma1Δ, vma2Δ, vma3Δ e vph1Δ). Comparativamente às células da estirpe WT, todos os mutantes testados, sem V-ATPase funcional, apresentaram uma maior suscetibilidade ao Pb. O papel dos transportadores vacuolares pertencentes à superfamília ABC, na defesa contra a toxicidade induzida por chumbo, foi levada a cabo utilizando mutantes sem os transportadores Ycf1p ou Vmr1p. Os resultados preliminares mostraram que quando comparadas com as células da estirpe WT, as células das estirpes ycf1Δ ou vmr1Δ não apresentavam uma maior perda da viabilidade. A modificação da morfologia vacuolar, em células expostas a chumbo, foi visualizada utilizando a estirpe Vma2p-GFP. O tratamento das células com Pb originou a fusão dos vacúolos de tamanho médio num único vacúolo de grande dimensão. Em conclusão, os estudos desenvolvidos no presente trabalho, utilizando a estirpe laboratorial BY4741, mostraram que a perda da capacidade proliferativa das leveduras, induzida pelo chumbo, pode ser atribuída à acumulação intracelular do anião superóxido e de peróxido de hidrogénio. As mitocôndrias parecem ser uma das principais fontes de ROS induzido por Pb e, simultaneamente, um dos principais alvos da sua toxicidade. Em S. cerevisiae, o vacúolo desempenha um papel importante na desintoxicação do Pb. A modificação da morfologia vacuolar após exposição ao chumbo poderá ser a consequência da acumulação de Pb no vacúolo. Enquanto os transportadores da superfamília ABC parecem não estar envolvidos na sequestração vacuolar de Pb, é necessária a presença, num estado funcional, da V-ATPase para que ocorra a compartimentação do Pb. Muito provavelmente, a compartimentação do Pb no vacúolo previne a sua acumulação no citosol e o desencadear dos respetivos efeitos tóxicos.

Lead is an important environmental pollutant. The yeast Saccharomyces cerevisiae constitutes a useful model for the study of the toxic effects of lead. The knowledge of defence and resistance mechanisms to the presence of heavy metals can be useful in technologies of environmental protection, namely in the development of new methodologies for the bioremediation of heavy metals. The aim of this work was to evaluate the impact of Pb on proliferation capacity, membrane integrity and intracellular production of reactive oxygen species (ROS), on laboratory strain of S. cerevisiae BY4741 (wild type strain, WT). The role of mitochondria, as a source of ROS Pb-induced, and the involvement of vacuolar H+- ATPase (V-ATPase) and vacuolar transporters belonging to the ATP-binding cassette (ABC) superfamily in the defence against Pb toxicity was also evaluated. The kinetic study of the impact of two Pb concentrations on yeast viability (evaluated using a clonogenic assay), cell membrane integrity (assessed using propidium iodide) and the intracellular ROS production (the superoxide anion was detected with dihydroethidium and the hydrogen peroxide with 2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate), revealed a progressive loss of proliferation capacity (53 and 17% of viable cells, after 3h of exposition to 250 or 1000 µmol/l Pb, respectively), which was coincident with the intracellular accumulation of superoxide anion and hydrogen peroxide, in the absence of the loss of cell membrane integrity. The importance of mitochondria in the production of ROS Pb-induced was carried out using a respiratory deficient mutant devoid of DNA mitochondrial (ƿ0 mutant). Comparatively to the WT strain, the ƿ0 mutant displayed an increased resistance to Pb and a reduced production of ROS Pb-induced. The exposition of cells from BY4741 strain to 250 or 1000 µmol/l Pb originated the formation of 49 or 58 % of respiratory-deficient cells, respectively. The function of V-ATPase, in Pb detoxification, was evaluated using mutants with structurally normal vacuoles but defective in subunits (vma1Δ vma2Δ, vma3Δ and vph1Δ of V-ATPase. All mutants tested, lacking a functional V-ATPase, displayed an ncreased susceptibility to Pb, comparatively to cells from WT strain. The role of vacuolar transporters belonging to ABC superfamily in the defence against Pb-induced toxicity was carried out using mutants without the transporters Ycf1p or Vmr1p. Preliminary results showed that cells from ycf1Δ or vmr1Δ strains did not display an increased loss of viability comparatively to WT strain. Modification of vacuolar morphology, in Pb-exposed cells, was visualized using a Vma2p-GFP strain. The treatment of yeast cells with Pb originated the fusion of the medium-size vacuolar lobes into one enlarged vacuole. In conclusion, the studies carried out in the present work, using the laboratory strain of S. cerevisiae BY4741, showed that the loss of yeast cells proliferation capacity Pb-induced can be attributed to the intracellular accumulation of superoxide anion and hydrogen peroxide. Mitochondria seem to be one of the main sources of ROS Pbinduced and simultaneously one of the targets of its toxicity. The vacuole plays an important role in the detoxification of Pb in S. cerevisiae. The modification of vacuolar morphology upon Pb exposition can be the consequence of Pb accumulation in the vacuole. While the ABC transporters seem not to be involved in the vacuolar sequestration of Pb, a functional V-ATPase is required for Pb compartmentalization. Most likely, Pb is compartmentalized in the vacuole preventing its accumulation in cytosol and the resultant toxic effect.