Elektrophysiologische Charakterisierung und PKC-vermittelte Regulation des humanen Transporters für basische Aminosäuren hCAT-1

ZusammenfassungDer humane kationische Aminosäure-Transporter hCAT-1 (CAT für cationic amino acid transporter) gehört zur Familie der Na+- und pH-unabhängigen Transporter für basische Aminosäuren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierfür dürfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellulären BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abhängig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalströme (Vmax) und die Leitfähigkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so groß wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitfähigkeitszustände für BAS besitzen, die von der intrazellulären BAS-Konzentration abhängig sind. Eine Leitfähigkeitszunahme durch Zugabe von extrazellulärem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten führte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitfähigkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitfähigkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu. Überraschenderweise wurden für die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Ströme in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erhöhte Leitfähigkeit für K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch völlig ungeklärt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivität untersucht. Hierfür wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivität auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfläche beruht. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivität vermutlich über einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht über eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Veränderung der Zelloberflächenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus für die CAT-Proteine dar, der erklären kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Veränderungen der Transportaktivität widerspiegeln.

Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

On the cellular stress response to Staphylococcus aureus alpha-toxin

Staphylococcus aureus alpha-hemolysin was the first bacterial toxin recognized to form pores in the plasma membrane of eukaryotic cells. It is secreted as a water-soluble monomer that upon contact with target membranes forms an amphiphatic heptameric beta-barrel which perforates the bilayer. As a consequence, red cells undergo colloidosmotic lyses, while some nucleated cells may succumb to necrosis or programmed cell death. However, most cells are capable of repairing a limited number of membrane lesions, and then respond with productive transcriptional activation of NF-kB. In the present study, by using microarray and semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), data from a previously performed serial analysis of gene expression (SAGE) were extended and verified, revealing that immediate early genes (IEGs) such as c-fos, c-jun and egr-1 are strongly induced at 2-8 h after transient toxin treatment. Activating protein 1 (AP-1: c-Fos, c-Jun) binding activity was increased accordingly. As IEGs are activated by growth factors, these findings led to the discovery that -toxin promotes cell cycle progression of perforated cells in an EGFR-dependent fashion. Although the amount of c-fos mRNA rose rapidly after toxin treatment, c-Fos protein expression was observed only after a lag of about 3 h. Since translation consumes much ATP, which transiently drops after transient membrane perforation, the suspicion arised that membrane-perforation caused global, but temporary downregulation of translation. In fact, eIF2α became heavily phosphorylated minutes after cells had been confronted with the toxin, resulting in shutdown of protein synthesis before cellular ATP levels reached the nadir. GCN2 emerged as a candidate eIF2α kinase, since its expression rapidly increased in toxin-treated cells. Two hours after toxin treatment, GADD34 transcripts, encoding a protein that targets the catalytic subunit of protein phosphatase 1 (PP1) to the endoplasmic reticulum, were overexpressed. This was followed by dephosphorylation of eIF2α and resumption of protein synthesis. Addition of tautomycetin, a specific inhibitor of PP1, led to marked hyperphosphorylation of eIF2α and significantly reduced the drop of ATP-levels in toxin-treated cells. A novel link between two major stress-induced signalling pathways emerged when it was found that both translational arrest and restart were under the control of stress-activated protein kinase (SAPK) p38. The data provide an explanation for the indispensible role of p38 for defence against the archetypal threat of membrane perforation by agents that produce small transmembrane-pores.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Studio del ruolo della Protein chinasi B/Akt nella migrazione di Cellule Staminali Mesenchimali umane

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.

Charakterisierung der biologischen Funktion der Plasmodium falciparum Calcium-abhängigen Proteinkinase 1

Im Rahmen dieser Arbeit wurden biologische Funktionen einer Proteinkinase des Erregers der Malaria tropica, genauer der „Plasmodium falciparum calcium dependent protein kinase 1“ (PfCDPK1), in parasitären Blutstadien untersucht.rnUm Einblicke in die Funktion der Kinase, die sie in den extrazellulären Kompartimenten des Parasiten übernimmt, zu gewinnen, wurden sechs Proteine untersucht, die dasselbe Translokationsignal wie PfCDPK1 besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass fünf der untersuchten Proteine mit der PfCDPK1 im Bereich der parasitophoren Vakuole sowie des tubovesikulären Systems co-lokalisiert sind. Deletionsmutanten, denen das Translokationssignal fehlte, sowie ein Peptid, das lediglich aus diesem bestand, bestätigten, dass die Translokation in die extrazellulären Kompartimente von keinen weiteren Faktoren, außer dem Signalmotiv abhängt. Mit PfCAP und PfRKIP konnten zwei Regulatoren der PfCDPK1 identifiziert werden. PfARM, Pfrab_5b sowie PfGAP45 sind Substrate der PfCDPK1. Mit Hilfe von massenspektrometrischen Messungen wurde der Phosphorylierungsstatus der untersuchten Proteine durch die PfCDPK1 sowie der Autophosphorylierungsstatus der Kinase bestimmt, um Rückschlüsse auf regulatorische Prozesse ziehen zu können.rnDie Phosphorylierung von PfGAP45 durch die PfCDPK1 steht vermutlich mit dem Invasionsprozess des Parasiten in direktem Zusammenhang, da gezeigt wurde, dass eine Hemmung der Kinase mit PP1 einen 90%igen Rückgang an neu infizierten Erythrozyten zur Folge hatte.rnrn

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Protein overexpression following lentiviral infection of primary mature neutrophils is due to pseudotransduction

Neutrophils are terminally differentiated cells with a short life-span due to constitutive apoptosis. Because of these characteristics, genetic manipulation of neutrophils has been difficult, although it is highly desired given the importance of neutrophils in the immune system. Here we demonstrate that transduction of primary human mature neutrophils with enhanced green fluorescent protein (eGFP)-encoding lentiviral particles results in GFP-containing cells as previously reported. Yet, our data further show that GFP expression in neutrophils upon transduction is largely due to protein transfer, a process called lentiviral pseudotransduction, and not due to bona fide transduction. Thus, inhibition of viral genome integration by the reverse transcriptase inhibitor 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT) or of protein biosynthesis by cycloheximide (CHX) did not abolish GFP levels in transduced neutrophils. Importantly, lentiviral pseudotransduction of the enzyme death-associated protein kinase 2 (DAPK2) into primary human mature neutrophils resulted in increased protein levels, but not enzymatic functionality. Based on our data and previous reports of unspecific viral effects on immune cells following lentiviral transduction, we discourage scientists to use lentiviral transduction methods to manipulate primary mature neutrophils.

Crohn's disease-associated polymorphism within the PTPN2 gene affects muramyl-dipeptide-induced cytokine secretion and autophagy

The single nucleotide polymorphism (SNP) rs2542151 within the gene locus region encoding protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2) has been associated with Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC), type-I diabetes, and rheumatoid arthritis. We have previously shown that PTPN2 regulates mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling and cytokine secretion in human THP-1 monocytes and intestinal epithelial cells (IEC). Here, we studied whether intronic PTPN2 SNP rs1893217 regulates immune responses to the nucleotide-oligomerization domain 2 (NOD2) ligand, muramyl-dipeptide (MDP).

Modulation of signal transduction by vitamin E

The ability of vitamin E to modulate signal transduction and gene expression has been observed in numerous studies; however, the detailed molecular mechanisms involved are often not clear. The eight natural vitamin E analogues and synthetic derivatives affect signal transduction with different potency, possibly reflecting their different ability to interact with specific proteins. Vitamin E modulates the activity of several enzymes involved in signal transduction, such as protein kinase C, protein kinase B, protein tyrosine kinases, 5-, 12-, and 15-lipoxygenases, cyclooxygenase-2, phospholipase A2, protein phosphatase 2A, protein tyrosine phosphatase, and diacylglycerol kinase. Activation of some these enzymes after stimulation of cell surface receptors with growth factors or cytokines can be normalized by vitamin E. At the molecular level, the translocation of several of these enzymes to the plasma membrane is affected by vitamin E, suggesting that the modulation of protein-membrane interactions may be a common theme for vitamin E action. In this review the main effects of vitamin E on enzymes involved in signal transduction are summarized and the possible mechanisms leading to enzyme modulation evaluated. The elucidation of the molecular and cellular events affected by vitamin E could reveal novel strategies and molecular targets for developing similarly acting compounds.

Induction of EROD activity by 1-phenylimidazole and beta-naphthoflavone in rainbow trout cultured hepatocytes: a comparative study

The classical pathway for induction of cytochrome P4501A (CYP1A) by xenobiotics is ligand binding to the aryl hydrocarbon receptor (AhR). However, several studies with mammalian cell systems point out a range of xenobiotics including imidazole derivatives, which are able to activate CYP1A through non-classical mechanisms. The objective of the present work is to compare induction of CYP1A (determined at the catalytic level as 7-ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes by the prototypic AhR ligand, beta-naphthoflavone (betaNF), and by the imidazole derivative, 1-phenylimidazole (PIM). PIM was able to induce EROD activity although its potency was clearly lower than that of betaNF. In order to assess the relative importance of classical AhR ligand binding and alternative signaling pathways in CYP1A induction by PIM, co-exposure experiments with the partial AhR antagonist alpha-naphthoflavone (alphaNF) or with inhibitors of protein kinase C (staurosporine) and tyrosine kinases (genistein, herbimicine) were performed. alphaNF and herbimicin provoked a decrease of EROD induction both by betaNF and PIM, whereas staurosporine and genistein remained without effect. The overall similarities in the response of betaNF and PIM to the various inhibitors suggest that both compounds, in apparent contrast to the behaviour of some other imidazole derivatives, induce CYP1A following similar mechanisms.

A central role for DOCK2 during interstitial lymphocyte motility and sphingosine-1-phosphate-mediated egress

Recent observations using multiphoton intravital microscopy (MP-IVM) have uncovered an unexpectedly high lymphocyte motility within peripheral lymph nodes (PLNs). Lymphocyte-expressed intracellular signaling molecules governing interstitial movement remain largely unknown. Here, we used MP-IVM of murine PLNs to examine interstitial motility of lymphocytes lacking the Rac guanine exchange factor DOCK2 and phosphoinositide-3-kinase (PI3K)gamma, signaling molecules that act downstream of G protein-coupled receptors, including chemokine receptors (CKRs). T and B cells lacking DOCK2 alone or DOCK2 and PI3Kgamma displayed markedly reduced motility inside T cell area and B cell follicle, respectively. Lack of PI3Kgamma alone had no effect on migration velocity but resulted in increased turning angles of T cells. As lymphocyte egress from PLNs requires the sphingosine-1-phosphate (S1P) receptor 1, a G(alphai) protein-coupled receptor similar to CKR, we further analyzed whether DOCK2 and PI3Kgamma contributed to S1P-triggered signaling events. S1P-induced cell migration was significantly reduced in T and B cells lacking DOCK2, whereas T cell-expressed PI3Kgamma contributed to F-actin polymerization and protein kinase B phosphorylation but not migration. These findings correlated with delayed lymphocyte egress from PLNs in the absence of DOCK2 but not PI3Kgamma, and a markedly reduced cell motility of DOCK2-deficient T cells in close proximity to efferent lymphatic vessels. In summary, our data support a central role for DOCK2, and to a lesser extent T cell-expressed PI3Kgamma, for signal transduction during interstitial lymphocyte migration and S1P-mediated egress.

Dual induction of PKR with E2F-1 and IFN-alpha to enhance gene therapy against hepatocellular carcinoma

Overexpression of the transcription factor E2F-1 induces apoptosis in tumor cells. This apoptotic effect is partly mediated through the induction of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR). Here, we investigate if agents that upregulate PKR could enhance the apoptotic effect of E2F-1 overexpression in liver tumors. In human hepatocellular carcinoma (HCC) cells (Hep3B, HepG2, Huh7), adenovirus-mediated overexpression of E2F-1 (AdCMV-E2F) transcriptionally increased PKR mRNA. The subsequent increase of total and phosphorylated PKR protein was followed by induction of apoptosis. When AdCMV-E2F was combined with the PKR modifier interferon alpha (IFNalpha), PKR was additionally upregulated and both PKR activation and apoptosis were increased. Subcutaneous xenograft tumors were selectively targeted using an adenoviral vector expressing E2F-1 under the control of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter (AdhTERT-E2F). Weekly systemic administration of AdhTERT-E2F inhibited tumor growth. The tumor suppressive effect of AdhTERT-E2F therapy was further enhanced in combination with IFNalpha.Our results demonstrate that PKR activating agents enhance the anti-tumor effect of E2F-1 overexpression in HCC in-vitro and in-vivo. Hence, modulation of PKR is a potential strategy to increase the efficacy of PKR-dependent anti-tumor therapies.

Annexin-1 regulates macrophage IL-6 and TNF via glucocorticoid-induced leucine zipper

Annexin-1 (ANXA1) is a mediator of the anti-inflammatory actions of endogenous and exogenous glucocorticoids (GC). The mechanism of ANXA1 effects on cytokine production in macrophages is unknown and is here investigated in vivo and in vitro. In response to LPS administration, ANXA1(-/-) mice exhibited significantly increased serum IL-6 and TNF compared with wild-type (WT) controls. Similarly, LPS-induced IL-6 and TNF were significantly greater in ANXA1(-/-) than in WT peritoneal macrophages in vitro. In addition, deficiency of ANXA1 was associated with impairment of the inhibitory effects of dexamethasone (DEX) on LPS-induced IL-6 and TNF in macrophages. Increased LPS-induced cytokine expression in the absence of ANXA1 was accompanied by significantly increased LPS-induced activation of ERK and JNK MAPK and was abrogated by inhibition of either of these pathways. No differences in GC effects on MAPK or MAPK phosphatase 1 were observed in ANXA1(-/-) cells. In contrast, GC-induced expression of the regulatory protein GILZ was significantly reduced in ANXA1(-/-) cells by silencing of ANXA1 in WT cells and in macrophages of ANXA1(-/-) mice in vivo. GC-induced GILZ expression and GC inhibition of NF-kappaB activation were restored by expression of ANXA1 in ANXA1(-/-) cells, and GILZ overexpression in ANXA1(-/-) macrophages reduced ERK MAPK phosphorylation and restored sensitivity of cytokine expression and NF-kappaB activation to GC. These data confirm ANXA1 as a key inhibitor of macrophage cytokine expression and identify GILZ as a previously unrecognized mechanism of the anti-inflammatory effects of ANXA1.

Cathepsin D specifically cleaves the chemokines macrophage inflammatory protein-1 alpha, macrophage inflammatory protein-1 beta, and SLC that are expressed in human breast cancer

Cathepsin D (Cath-D) expression in human primary breast cancer has been associated with a poor prognosis. In search of a better understanding of the Cath-D substrates possibly involved in cancer invasiveness and metastasis, we investigated the potential interactions between this protease and chemokines. Here we report that purified Cath-D, as well as culture supernatants from the human breast carcinoma cell lines MCF-7 and T47D, selectively degrade macrophage inflammatory protein (MIP)-1 alpha (CCL3), MIP-1 beta (CCL4), and SLC (CCL21). Proteolysis was totally blocked by the protease inhibitor pepstatin A, and specificity of Cath-D cleavage was demonstrated using a large chemokine panel. Whereas MIP-1 alpha and MIP-1 beta degradation was rapid and complete, cleavage of SLC was slow and not complete. Mass spectrometry analysis showed that Cath-D cleaves the Leu(58) to Trp(59) bond of SLC producing two functionally inactive fragments. Analysis of Cath-D proteolysis of a series of monocyte chemoattractant protein-3/MIP-1 beta hybrids indicated that processing of MIP-1 beta might start by cleaving off amino acids located in the C-terminal domain. In situ hybridization studies revealed MIP-1 alpha, MIP-1 beta, and Cath-D gene expression mainly in the stromal compartment of breast cancers whereas SLC transcripts were found in endothelial cells of capillaries and venules within the neoplastic tissues. Cath-D production in the breast carcinoma cell lines MCF-7 and T47D, as assessed by enzyme-linked immunosorbent assay of culture supernatants and cell lysates, was not affected by stimulation with chemokines such as interleukin-8 (CXCL8), SDF-1 (CXCL12), and SLC. These data suggest that inactivation of chemokines by Cath-D possibly influences regulatory mechanisms in the tumoral extracellular microenvironment that in turn may affect the generation of the antitumoral immune response, the migration of cancer cells, or both processes.