转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

大蒜、绊根草中重金属抗性分子机制的研究

日益加剧的重金属污染已经危害到了全球的生态环境以及人类健康。在分子水平上阐明植物中的重金属抗性机制并应用于环境修复和绿色农业是植物科学和环境科学以及农业科学的交叉点和新的生长点。为了了解植物重金属抗性的分子机制，我们的研究主要是从重金属抗性植物材料大蒜(Allium sativumL．)和绊根草(Cynodon dactylon)中分离重金属抗性相关基因，并研究它们在重金属抗性机制中的功能。 在高等植物中有迹象表明，一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白．类金属硫蛋白 (Metallothioneins Like，MTs Like)和一类具有Y-(Glu-Cys) n-Gly特殊结构的多肽一植物络合素(Phytochelatins，PCs)在重金属抗性机制中占有重要地位。然而人们对于同一种植物中这两种重金属结合肽作用的相互关系还缺乏了解，同时对于MT Like基因以及PCs合酶基因在同一种植物中的表达模式如金属离子专一性、时空表达特点等，还投有文献报道，因此本文将首先以这两个基因为切入点进行研究。 本研究采用RACE的方法，从大蒜中分离得到了类金属硫蛋白(MT-Like)的cDNA序列(GenBank Accession No.AY050510)，PCR和SoutheLrn Blot分析表明，大蒜基因组中不仅存在类金属硫蛋白基因，而且可能以基因家族的形式存在。对获得的MT Like cDNA进行的序列分析及同源性分析表明，大蒜MT Like cDNA含有一个完整的开放阅读框架，编码73个氨基酸，其中12个为半胱氨酸，占氨基酸总数的1 6.4%，并与其他植物如水稻、小麦、紫羊茅草中的类金属硫蛋白基因同源性较高，其中最高达89%。对该基因编码的氨基酸序列和结构分析表明在N-端、c-端结构域中分别含有3个典型的金属硫蛋白的结构模式Cys-Xaa-Cys，属于典型的Type-1类金属硫蛋白。这些Cys-Xaa-Cys特征结构表明大蒜MT Like基因编码的蛋白可以结合二价金属离子。重金属胁迫下大蒜根中MT Like基因在转录水平的表达检测表明，MT Like基因的表达受重金属离子Cu2+、Cd2+的诱导，暗示MT Like基因在大蒜对重金属的抗性中有重要作用。此外，用能谱电镜技术研究大蒜中重金属的积累与分布，以及用组织原位杂交技术分析MT Like基因的表达定位与重金属的积累、转运的关系已在进行之中。 植物络合素也是富含巯基的多肽化合物，在重金属抗性中起重要作用。由植物络合素结构中存在的Y一酰胺键或β-Ala可知PCs不是基因表达的直接产物，而是以GSH为前体的酶促反应产物。目前已知y一谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶(简称为PCs合酶，phytochelatin synthase，PCS)是PCs合成途径的关键酶，编码这一关键酶的基因目前已在小麦、拟南芥菜和裂殖酵母中克隆。由于这一基因在不同物种中的保守性较低，其克隆较困难。本研究通过设计植物络合素台酶基因简并引物，从大蒜中扩增得到了345bp的cDNA序列。序列分析和推测的氨基酸序列同源性比较表明，此序列的翻译产物与已知的植物络合素合酶同源性最高，此cDNA序列应为大蒜植物络合素合酶基因的部分cDNA序列(GenBank Accession No.AF384110)。目前大蒜植物络台素合酶基因的全长序列的扩增，以及这两种与重金属抗性有关的基因(MT Like，PCS)的表达模式仍在研究中。 本文还尝试了利用酵母重金属敏感突变株M379/8功能互补的方法从重金属抗性植物绊根革中分离新的重金属抗性相关基因。构建了用于转化的酵母质粒表达文库，探索了酵母转化体系建立的条件。曾尝试多种转化方法，并对其中的条件进行了优化改进。下一步的工作将集中在合适的酵母突变体的筛选或穿梭表达载体的选择标记基因替换上

青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究-金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析

第一部分：青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究 青蒿素是从中药青蒿中分离出的倍半萜内酯化合物，目前是世界上唯一有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿植株中青蒿素含量在开花期最高，但是目前尚不清楚开花与青蒿素生物合成的关系。为此，我们用光周期（短日照）诱导青蒿提前开花，不仅同时获得了开花与不开花的青蒿植株，而且还成功地在同一植株上诱导部分分枝开花，另一部分分枝保持营养生长状态。这一实验体系为研究青蒿开花与青蒿素生物合成的相关性奠定了基础。实验结果表明，开花与不开花青蒿植株青蒿素含量有明显差异。开花植株的青蒿素含量在前2周内逐渐提高，第三周（开花期）达到最高，并保持一周左右，在随后的2周内下降。青蒿植株开花后，叶片便开始老化变黄，逐渐死亡。未开花青蒿植株的青蒿素含量动态在前三周内与开花植株类似，但是这种高青蒿素含量状态能保持较长时间，至少在随后的2周内没有下降。未开花植株的叶片依然保持绿色。这一结果表明，开花不是导致青蒿素含量提高的直接原因。 扫描电镜观察结果表明，幼嫩叶片上的毛状腺体( trichrome)结构是完整的，而在老化的叶片上，则观察到了相当比例(40-50%)破损的腺体。这可能是导致青蒿素含量下降的直接原因。 不同生态型青蒿对光周期的反应是不同的。在北京地区，本地青蒿在8月初便开始开花，而来自四川武陵的青蒿则要到9月份才能开花。根据这一特性，采用“南蒿北栽”的方法，能够使青蒿保持较长时间的营养生长状态，延长适于采收的时间。 第二部分：金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析 植物次生代谢物山屯酮( Xanthones)仅存在于龙胆科和藤黄科植物中。它们具有抑制单胺氧化酶，细胞毒素及抗肿瘤活性。 含有1 3个碳原子的二苯甲酮是山屯酮生物合成的中间产物，是由二苯甲酮合酶催化合成的，这一反应是山屯酮生物合成的关键步骤。二苯甲酮合酶已经在金丝桃和百金花细胞悬浮培养系统中检测到，并进行了细致的生化水平上的研究。本研究是在上述研究的基础上，进一步克隆该酶的基因，并进行异源表达及功能分析工作，以便更好地了解和调控山屯酮的生物合成。 用PCR和RT-PCR技术，从金丝桃cDNA文库和逆转录产物中分别克隆到一个基因HBPS1和HBPS2，从百金花cDNA文库中克隆到一个基因CBPS1。HBPS1含有1402个碱基，其开放阅读框架编码390个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为6.55。HBPS2含有1398个碱基，其开放阅读框架编码395个氨基酸，分子量为42.8 kDa，等电点为5.78。CBPS1含有1383个碱基，其开放阅读框架编码389个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为7.88。与GenBank中序列同源性比较结果表明：在氨基酸水平上，HBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性高达92%，HBPS2与萝卜（Raphanus sativus）查尔酮合酶的同源性为64%，CBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性为71%。HBPS1与HBPS2的同源性仅为62%。 将三个新克隆的基因的ORF整合到载体pGEX-G上的谷胱甘肽还原酶S基因下游，构建成转化质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，这三个基因的ORF片段均能被表达成约68 kDa的产物，这与期望的结果一致。 活性检测结果表明，HBPS1是查尔酮合成酶，其底物为香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：香豆酰辅酶A 2.8μM，丙二酸单酰辅酶A，11.2μM。最适反应条件是350C，pH7.0，DTT浓度10 μM。 HBPS2是二苯甲酮合酶，其底物是苯甲丙氨酰辅酶A，和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：苯甲丙氨酰辅酶A 2.4 μM，丙二酸单酰辅酶A 9.6μM。最适反应条件是350C，pH 6.5，DTT浓度50 μM。而CBPS1则没有检测到任何活性。从同一种植物中同时获得了查尔酮合酶和二苯甲酮合酶，对研究这两种十分相近的酶的差异表达，酶促反应机制等问题将非常有利。

小麦春化相关基因元件克隆分析与小麦矮化突变体的研究

一、 春化相关基因全长cDNA序列及其启动子的克隆与分析研究 通过建立小麦（Triticum aestivum. L. cv Jingdong No.1）胚芽春化cDNA文库，以春化相关基因VER2的3’端序列为探针，筛选获得全长1195 bp cDNA序列，它编码300个氨基酸。在VER2中存在植物疾病抗性反应蛋白和茉莉酸诱导凝集素两种蛋白的结构域。另外在VER2蛋白中存在核定位信号和多种磷酸酶的作用位点，VER2可能参与了多种调控途径。 以VER2基因的cDNA为探针，利用改进的池式PCR以及高密度膜杂交筛选的方法，从小麦TAC基因组文库中获得41,788 bp的基因组克隆，该序列含有11个基因，其中VER2基因位于第三个基因。VER2基因组序列含有3个内含子，4个外显子与cDNA序列100%同源。通过对转录起始点和转录终止点的分析，进一步证明从cDNA文库筛选得到的VER2基因为全长序列。 对VER2基因的上游启动子区域进行分析，发现基因上游启动子区存在三个小的重复序列，每个片段有482 bp，另有两个较大的重复序列，每个片段有2,161 bp。对上游2.8 kb启动子区（不含重复序列）的响应元件分析，其包括ABA响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（Me-JARE）、胚乳特异性表达元件、参与淀粉酶合成的元件以及存在类似GA响应元件（ATAACAAAC）如ATAACATAC等等。根据VER2基因上游6 kb序列结构特点，将VER2启动子区域进行缺失突变形成10个片段，分别以GUS和GFP为报告基因构建成瞬间表达载体和植物表达载体等四类质粒。通过基因枪方法将最大片段（6 kb）驱动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中，结果发现GFP在春化处理的幼叶中表达，而在未春化处理的幼叶中不表达，说明VER2基因的启动子驱动基因转录受春化处理调控。 二、 小麦矮化突变体的研究 通过对小麦矮化突变体gaid遗传生理分析发现该突变体为半显性阻断GA信号途径，由此发现在赤霉素信号途径中，α-淀粉酶的诱导一定程度上通过某些与株高相关的基因控制。突变体gaid呈现对高浓度的脱落酸更敏感，当ABA浓度达到10-6M时，突变体的生长几乎完全受到了抑制，而野生型的生长需要ABA浓度达到10-5M时才能完全受到抑制。通过突变体gaid对乙烯等抑制型生长调节剂的响应实验研究，首次提出GA调控植物伸长生长存在两条信号途径，即GA基础水平信号途径（GA basal level signaling pathway）和GA正常水平信号途径（GA normal level signaling pathway），而乙烯以及高浓的GA合成抑制剂（如PAC）是通过第一条途径（GA基础水平信号途径）起作用。光形态建成中对植株生长的抑制作用存在独立于GA的信号途径。 突变体gaid的根系在强光照（63.5 Es-1m-2）和培养基内（低氧）的生长条件下，表现出弯曲、变短、加粗等异常性状，而随光照强度的减弱，这种根系异常生长的表型也减弱，在暗培养中则完全消失，但无论在哪种环境条件下，相对野生型对照而言，突变体的种子根短、侧根少。低浓度的ABA（10-8M）可以恢复突变体gaid根系在强光低氧条件下的正常生长发育。然而利用IAA及其极性运输的抑制剂（TIBA）、乙烯生物合成前提物（ACC）及合成抑制剂（AOA）处理突变体gaid，并没有发现突变体根系的生长发育得到恢复。 突变体gaid可能是一个新的属于小麦GA信号途径中的负调控基因（GAID）发生了突变或超表达，导致其负调控作用增强，呈现半显性的矮化突变。在与另一已知小麦GA信号途径中的负调控基因RHT的关系研究上发现，GAID可能对RHT蛋白磷酸化后的降解途径起抑制作用。通过双向电泳发现突变体gaid与野生型对照（京冬1号）在生长过程中存在差异蛋白，这将有助于对GA信号途径分子机理的深入研究。

大蒜中植物络合素合酶基因的克隆及功能分析

随着现代工业的发展，重金属污染已经成为一个非常严重的问题。 传统的重金属治理方法花费较高并且过程非常繁琐。植物修复技术是一种经济并且有效的利用植物进行环境污染治理的新方法。植物络合素是一类植物体内络合重金属离子的多肽，它已经发现于多种植物与微生物中。植物络合素合酶是催化GSH合成 植物络合素的关键酶。因此揭示植物络合素合酶的分子机理对于了解植物对重金属抗性的机制又很重要的意义。迄今为止，关于植物络合素合酶基因的研究主要集中在两种非重金属的植物中：拟南芥与小麦。许多关于该基因结构与功能的问题依然很不清楚。大蒜是一种能够抗很高浓度重金属的植物。在本研究中，我们利用大蒜这种重金属抗性植物对以下问题做了较为系统的研究： 1. 测量了大蒜在重金属胁迫下的生理表现，并得出大蒜是一种具有重金属抗性的植物; 2. 我们从大蒜中克隆出一个新的植物络合素合酶基因。该基因全长1868bp，包含一个 506个氨基酸的开放读码框并编码一个55.8KD的蛋白。该基因转译的氨基酸序列与其他十二种物种的植物络合素合酶氨基酸序列具有很高的同源性; 3. 酵母功能互补试验证明表达AsPCS的酵母可以比对照耐受更高浓度的镉与砷。这表明AsPCS的转译产物在酵母与植物的重金属的耐受过程中起很重要的作用; 4. RT-PCR的结果表明，经过重金属Cd2＋的胁迫，AsPCS在根中与茎中的表达量都有提高，这说明AsPCS的调控是发生在转录水平上的。另外通过比较该基因在相同处理条件下根中与茎中的表达量，我们发现AsPCS在根中的表达量远高于茎中; 5. 原位杂交显示AsPCS主要表达于根的表皮、顶端分生组织、韧皮部，并且当重金属压力提高后，表皮的表达量明显提高。

小麦茉莉酸诱导基因的克隆及表达模式分析

茉莉酸（JA）以及茉莉酸甲醋（MeJA）统称为茉莉素（jasmonates），是由 亚麻酸起始合成的一类具环戊酮基的广泛存在于植物界的类激素，它们对于植物 的发育和抗逆性等都起着重要的作用。为了进一步的了解茉莉酸的生物合成以及 功能，我们对”冬小麦中的茉莉酸生物合成、低温环境中的作用及对拟南芥开花时 间的影响等方面进行了研究。 为了方便分离茉莉酸诱导的基因，我们构建了一个高质量的小麦茉莉酸诱导 文库。未扩增时滴度为3一4xlo6pfu/ml，平均插入的长度为1.2kb。TaJIP是一个 JA诱导的基因，进一步的Northern分析发现它亦可以被低温诱导表达，这给了 我们一个提示，JA信号系统可能参与了植物对低温反应的过程。当外源施加JA于拟南芥时，无论是春化处理或者没有春化处理，无论是C24 还是Col生态型，开花时间都有所增加，而且进一步的NOrthern实验证明，这 种外源的JA的处理延迟开花的现象是与开花抑制基因FLC表达水平的增加相平 行，与长日促进途径中的主效基因CO的表达水平无关。这种JA处理延迟开花的 现象与FLC表达水平增加相平行的现象，表明了JA有可能是通过作用于FLC， 使它的表达水平增加来延迟开花。 Aos（Allene oxide synthase）是茉莉酸合成的脂氧合酶途径中的第一个关 键酶。我们克隆了小麦中的该基因并作了表达分析。它的开放阅读框（ORF）约 1410 bp，编码的多肤长约470个氨基酸，推测其蛋白分子量为51.9 kDa，pI为 9.39。Southern分析表明其在基因组中的拷贝数为3个。其mRNA表达可被外源 的JA强烈的诱导。处理10小时达到高峰。RNA原位杂交表明，该基因在幼苗 中组织特异表达，主要集中在幼叶，特别是在维管束区域，与大麦中的AOS不 同的是，它还在胚芽鞘和茎尖的维管束区域有强烈的表达信号。原位杂交还显示 La3十并不能阻断JA对它的诱导表达

植物对重金属砷和镉胁迫适应的分子机理初探

随着现代工业的发展，重金属污染日趋严重。重金属污染引发的环境和健康问题在许多国家都有报道，我国的重金属污染状况也不容乐观。土壤和水体中的重金属污染可以通过食物链进入人体，对人类健康造成很大的危害，如诱发癌症 和畸胎等。 植物修复是一种利用植物对重金属或有机污染物的超富集能力清除或减低污染的环境生物技术。植物修复的生物学机制的研究为这项技术走向实用化奠定了基础。植物修复近期的进展可能来自于可更有效地富集重金属的植物品种的选择、土壤条件的改善等;但长远看来，植物修复技术的巨大进步将取决于新的可更好地抵抗重金属或降解有机毒物的基因的鉴定和克隆，并通过转基因技术创造一批新的植物品种，如可迅速大量富集重金属的高生物量的用作环境净化的植物，以及可排拒重金属吸收的粮食、蔬菜和水果等作物。 本研究针对砷污染的植物修复机制，以超富集砷的凤尾蕨属植物——蜈蚣草为试材取得了如下进展： 1． 以从砷污染地区采集的蜈蚣草（Pteris vittataL．）为植物材料，利用抑制消减杂交(SSH)分离了经砷诱导处理与其对照间表达有差异的cDNA片段，以期得到与砷富集密切相关的基因。其中筛选到的一个cDNA片段与ABC transporter (ATP-binding cassette transporter)有较高的同源性。通过RACE方法对该基因进行了克隆，并进行了初步的结构和功能分析。结果表明所获得的PvABCTl (Accession No. AY496966)为一全长cDNA，长度为2165 bp，其中开读框架为1791 bp，编码597个氨基酸。该基因所编码的蛋白中含有2个ABC transporter特性结构域，1个ATP-binding cassette和2个ATP/GTP结合位点(P-loop)，没有明显的跨膜区。 2． 对蜈蚣草在砷胁迫下PvABCT1基因的表达模式进行了研究。转录水平分析表明PvABCT1的表达受砷的诱导。进一步通过PvABCTl-GFP融合基因在洋葱细胞中的表达进行亚细胞定位，结果显示该基因可能定位于细胞质中。 3． 为了研究所克隆的PvABCT1基因的功能，本研究构建了PvABCT1的酵母表达载体，把该基因转入因ACR3基因缺失而对砷敏感的酵母突变株。酵母功能互补实验表明PvABCT1不仅不能与ACR3基因功能互补，反而使酵母对砷的敏感性增加，同时酵母细胞中的砷含量较未转化的酵母细胞增加。即在转入PvABCT1后，酵母细胞吸收了更多的砷。这暗示该基因与蜈蚣草中砷的高吸收有关。 针对食品重金属污染问题，本研究探讨了减低蔬菜对重金属吸收的方法及其 作用机理，取得了如下进展： 1．研究了钙离子和镧离子对镉离子胁迫下生菜种子萌发和植株生长的影响，结果表明在种子萌发时外施4 mM CaCI2或0.04 mg/L La(N03)3均可提高生菜对重金属镉的抗性。 2．通过检测0.5 mM CdCl2胁迫下生菜植株中的镉含量以及外施钙离子或镧离子后相应的镉含量，发现4 mM CaCl2可以增加镉胁迫下生菜植株中镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3可以降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。 3．对生菜中植物络合素合酶基因进行了克隆，通过RT-PCR分析以及植物络合素( phytochelatins，PCs)的检测，探讨了外施钙离子或镧离子对镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达量、植物络合素含量以及镉的积累三者之间的关系。结果表明：4 mM CaCl2可以提高镉胁迫下生菜植株中植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，增加镉的积累;而0.04 mg/L La(N03)3虽然同样可以提高植物络合素合酶基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量，却能降低镉胁迫下生菜植株中镉的积累。这暗示外施钙离子可以促进用于重金属污染环境修复的植物对重金属的吸收，而外施镧离子可以用于降低叶菜类蔬菜中重金属镉的积累。

青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草的转化

利用反义技术研究生物代谢途径以及对其生物合成进行调控成为植物次生代谢研究领域内一个重要手段之一，并与新兴的RNAi技术一起成为本领域内重要的研究热点。在植物类异戊二烯代谢途径中存在着羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）等几种关键的分支酶，他们被认为在异戊二烯类的生物合成中发挥着关键的调节作用。其中，鲨烯合酶处于HMGR和FPS的下游，并与倍半萜合酶等利用共同的前体－法呢基二磷酸（FPP），以FPP起始合成一系列的下游产物。因此，FPP成为类异戊二烯途径中的关键调节点之一。本论文基于此目的，利用反义技术研究了FPP合成鲨烯这一途径受到抑制对其他以FPP为生物合成前体的代谢支路的影响。 利用植物双元转化载体pBI121，将青蒿中鲨烯合酶基因的cDNA（约1.5kb）序列插入到pBI121中，取代原有的GUS序列，构建成植物转化载体pBIASS。以根癌农杆菌为介导，将青蒿鲨烯合酶反义基因序列导入到烟草，整合到其基因组中 ，成功获得转基因植株。对转基因烟草进行分子检测表明，外源鲨烯合酶基因的序列已经稳定整合到烟草基因组中，并对内源的烟草鲨烯合酶基因表达产生影响。转基因烟草中检测到内源鲨烯合酶基因的mRNA的水平降低。对鲨烯合酶下游产物之一的胆固醇的含量分析显示，活性减低的鲨烯合酶使胆固醇的生物合成下降约40％左右。同时，另一条以FPP为共同前体的二萜代谢途径产物之一GA3的含量得到了提高，比对照提高约30％。

水稻GA3应答基因表达谱微阵列分析与OsGAS1功能初步研究

利用反义技术研究生物代谢途径以及对其生物合成进行调控成为植物次生代谢研究领域内一个重要手段之一，并与新兴的RNAi技术一起成为本领域内重要的研究热点。在植物类异戊二烯代谢途径中存在着羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）等几种关键的分支酶，他们被认为在异戊二烯类的生物合成中发挥着关键的调节作用。其中，鲨烯合酶处于HMGR和FPS的下游，并与倍半萜合酶等利用共同的前体－法呢基二磷酸（FPP），以FPP起始合成一系列的下游产物。因此，FPP成为类异戊二烯途径中的关键调节点之一。本论文基于此目的，利用反义技术研究了FPP合成鲨烯这一途径受到抑制对其他以FPP为生物合成前体的代谢支路的影响。 利用植物双元转化载体pBI121，将青蒿中鲨烯合酶基因的cDNA（约1.5kb）序列插入到pBI121中，取代原有的GUS序列，构建成植物转化载体pBIASS。以根癌农杆菌为介导，将青蒿鲨烯合酶反义基因序列导入到烟草，整合到其基因组中 ，成功获得转基因植株。对转基因烟草进行分子检测表明，外源鲨烯合酶基因的序列已经稳定整合到烟草基因组中，并对内源的烟草鲨烯合酶基因表达产生影响。转基因烟草中检测到内源鲨烯合酶基因的mRNA的水平降低。对鲨烯合酶下游产物之一的胆固醇的含量分析显示，活性减低的鲨烯合酶使胆固醇的生物合成下降约40％左右。同时，另一条以FPP为共同前体的二萜代谢途径产物之一GA3的含量得到了提高，比对照提高约30％。

植物络合素合酶基因的功能分析及其应用

植物络合素（phytochelatins，PCs）是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽，其结构通式为：（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）。植物络合素（PCs）由植物络合素合酶（PCS）催化谷胱甘肽（GSH）聚合而成，能够络合重金属离子而具有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草（Cynodon dactylon cv Goldensun）的植物络合素合酶基因，通过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复（phytoremediation）的工程植株。同时，在水稻（Oryza sativa）种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1，其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1（cup1Δ）中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A（acr-3Δ）中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草，共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系，其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析，其中抗性实验表明，在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后，转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后，Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后，转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi，其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明：一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中，OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。

青蒿高效遗传转化体系的建立与青蒿素生物合成的分子调控

青蒿素是从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药。青蒿素在国际市场上供不应求，而青蒿植株中青蒿素的含量很低，因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。通过基因工程获得转基因青蒿高产株系是提高青蒿素产量的最有潜力的途径之一。 对不同基因型青蒿进行不同的激素浓度配比的比较研究，得到丛生芽诱导率较高、生根诱导率较高的激素配比，从而建立了青蒿高效再生体系。然后系统地分析了青蒿丛生芽诱导、丛生芽生长、丛生芽生根诱导对Kan的敏感性。对影响根癌农杆菌介导青蒿转化的转化效率的两个主要因素，即农杆菌类型和青蒿基因型，以及其它影响因素，即预培养时间、侵染液的组成、共培养的方式和时间进行比较研究，建立了根癌农杆菌介导的青蒿高效转化体系。本高效转化和再生体系的转基因植株的得率为4%至10%，而且转基因植株再生周期短，再生能力强。 通过基因工程，在青蒿高产株系中过量表达本实验室从青蒿中克隆的FPS基因，结果转基因青蒿中FPS的酶活性是非转基因青蒿的2-3倍;转基因青蒿的青蒿素含量最高可达0.9%（DW），是非转基因青蒿中青蒿素含量的1.34倍。这些结果进一步论证了FPS在青蒿素生物合成代谢中的调控作用。

水母雪莲类黄酮次生代谢分子调控研究—cDNA 文库构建、关键酶及Myb 转录因子基因的克隆及其功能的初步鉴定

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim）为名贵珍稀中药材，其主要药用成分为类黄酮，尤其是3-脱氧类黄酮。目前关于雪莲的研究主要集中在采用细胞培养生产类黄酮等方面，但对于雪莲类黄酮生物合成的分子机制了解甚少，极大限制了这一珍贵资源的利用。本研究采用水母雪莲红色系愈伤组织及悬浮细胞为材料，构建cDNA文库，从中克隆水母雪莲类黄酮次生代谢中的相关基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转基因研究初步确定其功能，以期了解雪莲类黄酮次生代谢的分子机制，为提高类黄酮的合成奠定基础。主要结果如下： 1. 成功地构建了水母雪莲红色系愈伤组织与悬浮细胞cDNA文库，原始文库滴度达到4×106pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml，重组率达98%。PCR检测插入片段，均在0.5kb到3kb之间，1kb以上占62%。从文库中检测到了chs、dfr及Myb转录因子SmP，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 采用部分简并引物，通过RT-PCR克隆了水母雪莲查尔酮异构酶基因Smchi特异探针，并根据这一探针序列设计特异引物，采用TD-PCR法筛选cDNA文库，获得Smchi cDNA序列，全长831bp，编码一个232氨基酸残基的蛋白。根据cDNA序列克隆了Smchi DNA序列，结果表明Smchi基因无内含子。Smchi cDNA序列与翠菊chi基因高度同源，ORF区域同源性高达84%，但推测氨基酸序列则只有79.3%。Smchi mRNA具有复杂的二级结构。SmCHI具有典型的Chalcone结构域，其二级结构与苜蓿CHI蛋白十分相似，7个α-螺旋与8个延伸链由随机结构联系起来。但其活性中心的第三个关键氨基酸残基N115为M115所取代，这一取代可能导致该蛋白无生物活性，也可能使它具有一般CHI不同的功能。构建Smchi正义、反义真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，获得转正义、反义Smchi基因的烟草。转基因烟草花色未改变，但叶片总黄酮发生了显著的变化，50%转正义基因烟草总黄酮含量显著提高，最高比对照提高6倍，70%转反义基因烟草总黄酮含量显著下降，最多达85.1%，初步证明Smchi具有功能，并能有效调控烟草类黄酮次生代谢。因此，SmCHI可能是不同于已知CHI的一类新的CHI蛋白，它催化的反应可能与花色素合成无关，其反应机制也可能有所不同。 3. 伴随Smchi的克隆获得了一个黄烷酮3-羟化酶类似基因Smf3h的cDNA，全长1334bp，编码一个343aa的蛋白。根据这一cDNA序列克隆了Smf3h DNA序列，全长1630bp，结果表明该基因由4个外显子和3个内含子组成。Smf3h mRNA具有十分复杂的二级结构。 推测蛋白氨基酸同源性分析表明，SmF3H属于2OG-FeII_Oxy家族，与同一家族的的颠茄H6H的同源性为45%，与拟南芥F3H的同源性为40%，但对SmF3H、典型F3H及典型H6H推测蛋白二级结构、活性中心关键氨基酸残基的位置与相对距离、软件进行功能预测分析，发现SmF3H与F3H更相似。构建Smf3h的正义与反义真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，但只获得一批转正义基因的烟草，反义基因导致烟草不能再生而未获得转反义基因烟草。转基因烟草花色未改变，叶片总黄酮也与对照相似，初步确认Smf3h与烟草类黄酮生物合成无关，而是一个既不属于f3h也不属于h6h的功能未确定的新基因。 4. 采用与克隆Smchi基因相似的方法，从cDNA文库中克隆了SmP基因cDNA，全长969bp，编码一个256 aa的蛋白质。根据cDNA序列克隆了SmP基因的DNA序列，结果表明，SmP基因无内含子。SmP基因cDNA 一级结构及mRNA二级结构预测分析表明，该基因A+T含量很高（63%），所形成二级结构以A-T配对为主，其稳定性可能较差。SmP推测蛋白序列具有R2R3-Myb转录因子的典型特征，在N-端具有两个Myb DNA-binding Domain，其二级结构与鸡Myb转录因子1A5J十分相似，与其他基因如水稻OsMYB、番茄ThMYB的同源区域主要集中在这一结构域，分别为71.3%和70.8%;C-端富含丝氨酸，与烟草NtMYB、葡萄VlMYB等类黄酮调控因子相似，都呈寡聚体分布，并具有相同的保守磷酸化位点S170与S206。构建SmP基因真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，获得大量转基因烟草。转基因烟草花色未发生改变，但51%的转基因烟草叶片总黄酮含量都显著提高（0.5-6倍），表明SmP具有促进烟草类黄酮生物合成的功能，但所调控的支路与花色素合成无关。初步试验结果表明，转SmP基因烟草对蚜虫具有很高的抗性，可有效地抑制蚜虫在烟草上的生长，抑制率最高可达92%-100%。这一抗性与烟草中类黄酮的积累可能具有直接的联系，但还需要进一步的试验证明。 5. 与美国俄亥俄州立大学Erich Grotewold 博士实验室合作，完成了微型EST库50个克隆的测序并进行了分析，从中获得了水母雪莲花色素合酶基因SmANS及醛脱氢酶基因SmALDH的特异探针。根据SmANS特异探针设计引物，采用PCR从这50个克隆中筛选获得了SmANS的cDNA序列，全长1229bp，编码一个356aa的蛋白质。SmANS在cDNA水平上与同属的翠菊ANS基因高度同源，但同源区域集中在ORF区域，达到80%，mRNA 预测二级结构十分复杂;推测氨基酸序列与翠菊ANS同源性达到82.9%。SmANS属于2OG-FeII_Oxy家族，在2OG-FeII_Oxy结构域高度保守，与翠菊、甜橙ANS保守结构域同源性达到94%。预测蛋白二级结构以α-螺旋-β-折叠为主，由7个主螺旋和11个主β-折叠及随机结构连接而成，并具有2OG-FeII_Oxy家族活性中心的三个保守的组氨酸残基（His84、His235、His291）和一个天冬氨酸残基（Asp237）。 6. 根据微型EST库中获得的SmALDH特异探针设计引物，采用PCR从这50个克隆中筛选获得了SmALDH基因cDNA 序列，全长1664bp，编码一个491aa的蛋白质。SmALDH基因cDNA具有独特的碱基组成，3/-UTR富含A+T，占该区域碱基总量的80%，5/-UTR的A+T和G+C各占50%，比ORF区域（52%）还低，因此其mRNA二级结构中5/-UTR可以单独形成自身二级结构并且十分稳定，这可能影响基因的表达。这一现象在水稻、玉米等植物中也存在。SmALDH在cDNA水平上在ORF区域与拟南芥、藏红花、水稻等具有较高同源性，分别为64.03%、63.89%、63.72%，但在推测蛋白氨基酸序列水平上同源性反而较低，分别为54.9%、54.3%、54.0%。SmALDH缺少线粒体定位信号，为胞质醛脱氢酶，具有一个Aldedh 保守结构域，还具有与1OF7-H相似的以α-螺旋-β-折叠为主的二级结构，由10个主螺旋和15个主β-折叠及随机结构连接而成。由于ALDH在植物细胞乙醇发酵中具有解除醛类物质毒害的功能，因此SmALDH基因的克隆为改造细胞自身以适应发酵培养条件，解决水母雪莲细胞大规模培养中需氧问题提供了可能。

大蒜重金属抗性基因的克隆及其功能分析

金属硫蛋白（metallothionein，MT）和植物络合素（phytochelatin，PC）是植物中能够与金属离子结合的两大类多肽。二者均富含Cys，但前者是mRNA的编码产物，后者是酶促反应的产物，植物络合素合酶（PCS）则是合成PC的关键酶之一。目前已发现许多植物同时存在金属硫蛋白基因和植物络合素合酶基因。研究重金属胁迫下这两类基因的表达对了解植物的重金属抗性的分子机制具有重要意义，同时还可以为培育能用于植物修复的品种提供新思路。 本论文从大蒜中克隆了一个type 2 MT基因，命名为AsMT2a，将其在大蒜中的表达模式与大蒜的植物络合素合酶基因（AsPCS1）进行了比较，并对二者的过表达转基因拟南芥的重金属抗性进行研究。其主要结果如下： 1． AsMT2a基因全长525 bp，编码79个氨基酸，其中有14个Cys 残基。 推测的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和数目与来自其它植物的type 2 MT蛋白的完全一致。 2． RT-PCR的结果显示，大蒜根部AsPCS1的表达在Cd处理的短期（1 hr）内迅速增强，同时PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表达在Cd处理10 hr后才有明显的增加。说明AsPCS1可能在植物对重金属的急性解毒方面起主要作用，而AsMT2a则在植物对重金属长久耐性中的离子平衡方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd胁迫的不同时期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相协调而对重金属胁迫作出反应。此外，在不同胁迫条件下，AsPCS1和AsMT2a的表达模式不同，其中Cd、As和热激可以促进根中AsPCS1的表达和PCs的积累。 3．将AsPCS1和AsMT2a转入对砷和镉敏感的酵母菌株 FD236-6A中，RT-PCR的结果显示这两个基因均可在酵母中稳定表达，对转化子的重金属抗性实验表明这两个基因均可提高转化子对砷和镉的抗性。 4．将AsPCS1和AsMT2a 置于 CaMV 35S启动子下转入拟南芥中，RT-PCR结果表明，这两个基因均可在拟南芥中表达。有趣的是，AsPCS1在拟南芥中存在两个转录本，且二者均具有完整的ORF，其推测的氨基酸序列相差38个氨基酸。说明部分AsPCS1在拟南芥中经过了精确的剪切和拼接过程，但其机制尚不清楚。 5．在Cd 胁迫下，AsPCS1的超表达拟南芥的生长好于野生型植株，主要表现在转基因拟南芥的根较长，根数目较多;但在As胁迫下AsPCS1转基因植株与野生型植株没有明显的差别。与此不同的是将AsMT2a转入拟南芥后，转基因植株的As抗性明显增强，同样表现在根长度和根数目上。进一步将AsPCS1和AsMT2a同时转入拟南芥进行超表达，在Cd胁迫下，转基因植株的生长好于野生型植株，且种子萌发率也较高。 6．Cd和As胁迫下，AsPCS1过表达植株的PCs含量增加，同时Cd和As的积累量也明显增加，其中Cd胁迫下Cd含量增加最多，平均比野生型对照增加4倍;而As胁迫下As含量比野生型对照增加1.2倍。在Cd和As胁迫下，AsMT2a过表达植株的Cd和As积累量与野生型相比分别增加1.4倍和0.8 倍。双价基因AsMT2a +AsPCS1过表达植株的 Cd 积累量是野生型的5.8倍，是AsMT2a过表达植株的2.4 倍，是AsPCS1过表达植株的1.2倍。 在克隆AsMT2a的同时，我们还从大蒜中克隆到了一个金属硫蛋白基因家族的新成员，命名为AsMT2b，并对其功能进行了初步探讨。主要结果如下： 1．AsMT2b 全长520 bp，其开读框架为243 bp，编码80个氨基酸，其中含有15个Cys 残基。对推测的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain内，Cys的数目和排列方式与其它type 2 MT蛋白明显不同。 其N 端domain内的结构为CXXC——CXC——CXC——CXCC，C端domain 内的结构为CXXC——CXC——CXC。暗示AsMT2b 可能具有与其它MT不同的生物学功能。 2．在较低浓度Cd（200 µM）胁迫下，AsMT2b的表达量随着处理时间（24 hr内）的延长而降低，但随着处理浓度的升高（500 µM）和处理时间延长（48 hr），其表达量又逐步增强，说明AsMT2b可能在胁迫强度增大到一定值时方起作用。 3． 将AsMT2b转入对Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，发现AsMT2b对酵母As抗性的提高贡献不大，但可明显提高酵母对Cd的抗性。 4．对AsMT2b的超表达拟南芥的重金属抗性分析表明，与野生型植株比较，转基因植株具有较强的Cd抗性，表现在Cd胁迫下，种子的萌发率较高，根较长，侧根数较多。但在As胁迫下，转基因植株的生长和野生型没有明显差异。可以看出，转AsMT2b的拟南芥对重金属的抗性不同于转AsMT2a的植株，前者的抗Cd性较强，而后者的抗As性较强。 5． Cd胁迫下，AsMT2b过表达拟南芥的Cd含量明显增加，平均比野生型对照植株增加70％，但各个株系的增加幅度不一致。 另外，我们还对CdCl2胁迫下，大蒜幼苗中镉的积累及氧化胁迫和抗氧化能力的变化进行了研究。结果表明在CdCl2 胁迫下，大多数Cd在根部积累，而只有少量的Cd积累于叶片中。5 mM 和10 mM CdCl2 抑制SOD和CAT的活性，但随着处理时间的延长，二者的活性回复到对照水平或高于对照。在CdCl2胁迫下，POD的活性明显增强，同时脂质过氧化产物积累。这些结果说明镉胁迫下，植物细胞中氧化胁迫加剧，而抗氧化酶活性的增强是植物对次生氧化胁迫的一种适应策略。 综上所述，在重金属胁迫下， AsPCS1和AsMT2a之间及AsMT2a和AsMT2b之间均表现出明显的协调反应。这种协调反应可能是植物维持细胞内离子稳态的机制之一。而重金属胁迫下，过表达AsPCS1，AsMT2a或AsPCS1+AsMT2a的拟南芥体内的重金属含量明显增加，表明这些基因可望用于重金属污染土壤的植物修复中。

反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响

青蒿素是从中药青蒿中提取的新型抗疟药物，然而，青蒿素在青蒿中的含量非常低。近年来，随着青蒿素生物合成途径相关酶基因的克隆，基因工程成为提高青蒿素含量的有效途径之一。在对青蒿进行遗传转化过程中，高效稳定的丛生芽诱导体系是青蒿转化成功的关键。然而，随着继代次数的增多，青蒿丛生芽诱导能力存在退化现象。本文首先研究了滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响和在遗传转化中的应用，进而研究了反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响。主要结果如下： 研究了在丛生芽诱导培养基上加铺滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响，结果发现，加铺滤纸后青蒿丛生芽诱导率显著提高，丛生芽诱导率能够达到97%左右。在此高效丛生芽诱导体系的基础上，我们进一步探讨了滤纸在青蒿遗传转化中的应用。结果表明，在筛选培养基上加铺一层滤纸，青蒿的抗性丛生芽诱导率能够达到59.7%，其中在12.5%的抗性丛生芽中能够得到抗性生根植株，生根植株PCR检测均为阳性，在部分PCR检测阳性的植株中检测到了GUS的稳定表达。 利用上述改进的青蒿遗传转化体系，我们得到了反义鲨烯合酶基因的青蒿转化植株。PCR检测和Southern杂交检测结果证明了反义鲨烯合酶基因已经整合到青蒿基因组中。RT-PCR检测发现，在转基因株系ASQ3和ASQ5中鲨烯合酶基因在mRNA水平上得到部分抑制，鲨烯含量比对照降低了20%左右;青蒿素的含量分别提高了23.2%和21.5%，结果表明抑制鲨烯合酶表达能够有效促进青蒿中青蒿素的生物合成。

诱导子对水母雪莲次生代谢的影响及雪莲查耳酮合成酶基因克隆

水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)为菊科凤毛菊属植物,是名贵中药材。为解决雪莲资源匮乏，我们实验室通过植物组织培养技术，成功的建立起水母雪莲细胞和毛状根体系。通过对它的药理实验及化学成分分析，主要成分为黄酮类物质和紫丁香甙单体。为了进一步提高这些物质在水母雪莲培养物中的含量，本文开展通过添加外源诱导子手段来调控水母雪莲次生代谢合成途径。 利用水杨酸（SA）和酵母提取物（YE）作为外源诱导子，添加到水母雪莲细胞系和毛状根系培养基中，研究诱导子不同添加浓度和不同添加时间对水母莲细胞系和毛状根系的生长及次生物质合成的诱导效应。实验结果发现：对于细胞系来说，SA比YE的诱导效果要好，低浓度SA处理时，不仅能促进细胞的生长，还能提高水母雪莲细胞中黄酮化合物和紫丁香甙的含量。其中，在细胞生长周期的第6天添加终浓度为20 μM的SA，诱导效果表现最佳。在此条件下，细胞内总黄酮产量达到532 mg/l，紫丁香甙为630 mg/l，分别比对照提高了130%，和150%。对于毛状根体系来说，SA和YE生长早期添加会抑制毛状根生长。总体上，YE的诱导效果比SA明显。在第10天添加终浓度为40 μg/ml的YE，总黄酮达到741 mg/l，紫丁香甙达到303 mg/l，分别是对照的2.8和2.5倍。 同时研究了20 μM和100 μM SA诱导下，黄酮合成途径中相关酶的变化。发现，低浓度的SA能在短时间内诱导CHS和CHI表达，24h后PAL酶活性升高到对照的7.5倍，而48 h总黄酮的含量检测到最高值。因此可以初步断定，SA诱导苯基苯丙烷类物质的积累与CHS和CHI表达，PAL酶活性提高有关。 另外，从水母雪莲cDNA中克隆到雪莲黄酮合成途径的第一个关键酶—查耳酮合成酶基因（SmCHS）全长cDNA。此cDNA序列全长为1313bp，其编码的蛋白为389个氨基酸，推测的氨基酸序列与许多物种都高度同源，同源性高达88%。生物信息学分析，SmCHS具有CHS－like保守结构域，其二级结构与苜蓿的CHS十分相似，且苜蓿中的CHS酶活性中心的关键氨基酸位点在SmCHS也一致对应相同，没有突变。因此可以初步推测这个SmCHS应该具有查耳酮合成酶功能。并进一步构建SmCHS植物表达载体，转化拟南芥chs突变体，通过功能互补分析研究此基因的功能。由于时间关系这部分研究尚在进行中。