Finte pelli in PVC: utilizzo e proprietà in mescola di plastificanti e ritardanti di fiamma ecosostenibili e non tossici

Il presente lavoro di tesi sperimentale prende in considerazione diverse possibili alternative ai plastificanti (in particolare alla famiglia degli ftalati) e ritardanti di fiamma (triossido di antimonio) ampiamente utilizzati al giorno d’oggi nella produzione di finte pelli in PVC, anticipando in questo modo possibili restrizioni future imposte dalla normativa REACH: quattro ftalati a basso peso molecolare (Benzil-ButilFtalato, Di-ButilFtalato, Di-Iso-ButilFtalato, e Di-2-Etil-EsilFtalato) sono già stati proibiti ed il triossido di antimonio è inserito nella lista delle sostanze candidate a possibili restrizioni. Le limitazioni all’uso di queste sostanze è dovuta agli effetti negativi sulla salute e sull’ambiente causati da queste sostanze: gli ftalati a basso peso molecolare possono interferire nei cicli ormonali; il triossido di antimonio è un sospetto cancerogeno, è pericoloso per inalazione ed è considerato causa di pneumoconiosi e irregolarità cardiache dei lavoratori a contatto con esso. Inoltre, l’antimonio è un inquinante persistente, bioaccumulabile e tossico (PBT). Sono stati presi in esame 21 plastificanti appartenenti a varie categorie (sebacati, adipati, trimellitati, fosfati, benzoati, …), coi quali sono state prodotte foglie di PVC plastificato. Le foglie sono state sottoposte a caratterizzazione tramite spettroscopia FT-IR ed a test sia di natura meccanica (durezza, resistenza meccanica, etc.) che focalizzati a determinare proprietà legate al loro uso finale (migrazione del plastificante, resistenza alla fiamma, stabilità termica, etc.). Tra i migliori plastificanti individuati vi sono i trimellitati ed alcuni plastificanti da fonti rinnovabili (azelati, tetravalerati). Sono state investigate singolarmente le proprietà di 5 tipologie di ritardanti di fiamma in sostituzione del triossido di antimonio (a varie percentuali di additivazione nel materiale) e di 3 miscele di ritardanti allo scopo di valutare eventuali effetti sinergici. Le foglie additivate con questi ritardanti di fiamma sono state caratterizzate tramite analisi termiche specifiche: analisi al cono calorimetro e analisi TGA accoppiata ad FT-IR, utili per la comprensione dei meccanismi di azione dei ritardanti di fiamma e della loro influenza sulla degradazione termica del PVC plastificato. Infine, le foglie sono state sottoposte ai classici test di resistenza meccanica, resistenza alla fiamma, stabilità termica, ecc. I migliori ritardanti di fiamma individuati sono: ipofosfito di calcio, sali carbossilati ed allumina triidrata, da soli o miscelati con zinco idrossistannato.

Censimento, raccolta e analisi delle serie di altezze di precipitazione mensili nelle stazioni storiche del territorio romagnolo

Estrapolazione dati riguardanti le altezze di precipitazione dagli Annali Idrografici, relativi a 34 stazioni pluviometriche della Romagna. Elaborazione ed analisi di istogrammi che rappresentano le altezze di precipitazione annuale delle stazioni, dal 1924 al 2014, con l’aggiunta di grafici inerenti il totale delle precipitazioni mensili, con relativa linea di media. Utilizzo del test di Mann-kendall attraverso il quale si è tracciata la linea di tendenza, per ogni singola stazione, con calcolo successivo della pendenza di Sen e del p-value. Valutazione stazioni con p-value molto piccoli (Brisighella, Predappio, Strada San Zeno, San Benedetto in Alpe), attraverso i totali stagionali, e successivo istogramma, utile per verificare l'effettiva coerenza tra il trend annuale e quello stagionale. Considerazioni finali sui trend significativi.

Impiego di ingredienti funzionali nel rallentamento del raffermamento in prodotti da forno

ALMA MASTER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA CAMPUS DI CESENA SCUOLA DI AGRARIA E MEDICINA VETERINARIA CORSO DI LAUREA IN SCIENZE E TECNOLOGIE ALIMENTARI Impiego di ingredienti funzionali nel rallentamento del raffermamento in prodotti da forno Relazione finale in Tecnologia dei Cereali e Derivati Relatore Dr. Giangaetano Pinnavaia Correlatrice Dr.ssa Federica Balestra Presentato da Caterina Azzarone Sessione II° Anno Accademico 2014/2015 Introduzione La focaccia è un prodotto lievitato da forno molto diffuso e consumato in tutta Italia. Essendo un prodotto fresco è soggetta al raffermamento. Lo scopo della sperimentazione è stato quello di valutare l’influenza di un amido waxy e di un enzima sulle caratteristiche chimico-fisiche e sensoriali di un prodotto da forno tipo focaccia durante lo stoccaggio. Materiali e metodi Le focacce sono state realizzate addizionando alla formulazione degli ingredienti in grado di contrastare il fenomeno del raffermamento: il Panenzyme AM 100 allo 0,005% (E5)e 0,01%(E10); e il Novation TM 2700 (amido di mais waxy) al 2.5%(N2.5) e 5%(N5). I campioni sono stati posti a confronto con un campione di controllo (C) I campioni sono stati stoccati in cella termostatata a 5C° e 50% UR. Le analisi sono state effettuate rispettivamente dopo 1,2,3,7 e 10 giorni dalla preparazione. Sull’impasto è stato valutato lo sviluppo in volume ogni 30 minuti durante la lievitazione (2h) a 36C° e 86% UR. Sulle focacce sono state effettuate le seguenti determinazioni analitiche: • Analisi dei gas nello spazio di testa delle confezioni. • La determinazione dell’umidità • Texture Profile Analysis (TPA) test • Test di rilassamento (Hold until Time test) • L’analisi sensoriale effettuata sia dopo 1 giorno (T1) sia dopo 10 giorni di conservazione (T10). Conclusioni In particolare, il campione addizionato con enzima in percentuale dello 0,005% (E5) mostra le caratteristiche chimico-fisiche migliori al termine del periodo di conservazione, presentando il valore più elevato di umidità, il valore inferiore di durezza e maggiore di elasticità valutati strumentalmente. Anche a livello sensoriale il campione E5 presenta punteggi molto elevati. Sono state trovate, inoltre, interessanti correlazioni tra i dati dell’analisi sensoriale e quelli ottenuti dai test strumentali. Il campione realizzato con il 2.5% di amido di mais waxy (N2.5) nonostante abbia presentato a fine conservazione valori di umidità e di elasticità inferiori e risultasse più duro rispetto al campione di controllo (C), ha ottenuto i punteggi più elevati nel test sensoriale, mentre nei confronti del campione con una percentuale maggiore di amido di mais waxy (N5) è risultato migliore per tutti i parametri valutati. Si deduce che l’utilizzo di NOVATION 2007 al 2.5% e PANEENZYME AM100 allo 0,005% sono stati in grado di migliorare le caratteristiche strutturali e sensoriali del prodotto durante la conservazione, risultando il secondo il migliore in assoluto

Beam Halo Monitor: il nuovo rivelatore di alone del fascio per l'esperimento CMS a LHC

In questa tesi sono le descritte le fasi progettuali e costruttive del Beam Halo Monitor (BHM), un rivelatore installato sull'esperimento CMS, durante il primo lungo periodo di shutdown di LHC, che ha avuto luogo tra il 2013 ed il 2015. BHM è un rivelatore ad emissione di luce Cherenkov ed ha lo scopo di monitorare le particelle di alone prodotte dai fasci di LHC, che arrivano fino alla caverna sperimentale di CMS, ad ogni bunch crossing (25 ns). E' composto da 40 moduli, installati alle due estremità di CMS, attorno alla linea di fascio, ad una distanza di 1.8 m da questa. Ciascun modulo è costituito da un cristallo di quarzo, utilizzato come radiatore ed un fotomoltiplicatore. Sono descritte in maniera particolare le prove eseguite sui moduli che lo compongono: la caratterizzazione dei fotomoltiplicatori ed i test di direzionalità della risposta. Queste costituiscono la parte di lavoro che ho svolto personalmente. Inoltre sono descritte le fasi di installazione del rivelatore nella caverna sperimentale, a cui ho preso parte ed alcuni test preliminari per la verifica del funzionamento.

Effetto di differenti condizioni di formulazione, conservazione e somministrazione sulle caratteristiche reologiche di creme alimentari

Le proprietà reologiche degli alimenti cremosi a fini medici speciali, come quelli per l’alimentazione dei pazienti disfagici, sono influenzate dalla formulazione e dalle tecnologie di produzione. Gli obiettivi di questa tesi, sono stati i seguenti: - individuazione di metodi e parametri reologici empirico-imitativi per la caratterizzazione di campioni di creme alimentari; - studio dell’effetto di differenti quantità di addensante sulle caratteristiche reologiche di creme alimentari; - studio dell’effetto della conservazione in regime di refrigerazione (4° C) o surgelazione (-18°C) sulle caratteristiche reologiche di differenti creme alimentari. Questo al fine di approfondire la conoscenza di tali aspetti per ottimizzare le modalità di produzione e conservazione di differenti creme alimentari destinate all’alimentazione di pazienti disfagici. Dai risultati ottenuti è emerso come tra i metodi ed i parametri empirico-imitativi considerati, quello che sembra essere risultato più idoneo per la determinazione rapida delle caratteristiche di viscosità dei campioni di creme alimentari analizzati è risultato il parametro coesività valutato con test di back extrusion. Per la natura pseudo-plastica dei campioni analizzati, contrariamente a quanto indicato dal produttore, l’utilizzo del viscosimetro vibrazionale non è risultato essere ottimale, per l’instabilità della misura legata alla modifica più o meno importante della viscosità dei sistemi analizzati causata dall’azione delle onde sonore generate dal probe. La caratterizzazione reologica delle creme con differenti contenuti di addensante ha permesso di creare delle cinetiche legate alla modifica delle caratteristiche reologiche empirico-imitative dei sistemi in funzione della quantità di addensate aggiunto. Correlando tali informazioni con il livello di accettazione dei prodotti da parte del paziente disfagico sarà possibile creare degli standard produttivi reologici per la preparazione di prodotti idonei alla sua alimentazione. Le differenti temperature di conservazione dei prodotti, in regime di refrigerazione o congelamento, sembrano non aver influenzato le caratteristiche reologiche delle creme analizzate.

Sviluppo di un sistema per l'effettuazione di cicli di guida per motoveicoli sul banco a rulli

Il lavoro svolto in questa tesi fa parte di un progetto volto alla realizzazione di un sistema per svolgere test di guida di motoveicoli al banco a rulli, gestendo l’intera prova in remoto, ossia dall’esterno della cella. Tale sistema, denominato RideIT, è stato progettato da Alma Automotive per conto della nota casa motociclistica MV Augusta. Tramite il sistema RideIT, è possibile automatizzare la guida di motoveicoli sul banco a rulli, riproducendo via software, tramite un modello che governa degli attuatori, il comportamento del pilota per quel che riguarda gli azionamenti di acceleratore, frizione, cambio e freno durante un test. I vantaggi di questa soluzione riguardano soprattutto la sicurezza degli addetti, che possono effettuare tutte le prove del caso rimanendo al di fuori della sala prove, oltre alla possibilità di incrementare la ripetibilità e la riproducibilità dei risultati dei test, grazie all’eliminazione del fattore di soggettività legato al guidatore. Il sistema nasce con la specifica di poter eseguire test di omologazione al banco a rulli anche se, grazie alla flessibilità che è in grado di garantire, può essere perfettamente riconfigurato, anche in vista di futuri sviluppi del progetto.

Un middleware multi-interfaccia per l'offloading di video dinamici auto-adattanti

Panoramica di MPEG-DASH e TVWS, descrizione dell'implementazione di un middleware multi-interfaccia per lo streaming video adattivo e test di valutazione del lavoro svolto

Vincoli cosmologici dalle distorsioni geometriche della funzione di correlazione

L'accurata determinazione dei parametri che costituiscono un modello cosmologico è fondamentale per caratterizzare correttamente l'evoluzione globale dell'universo e per spiegare le sue caratteristiche locali. Per quanto riguarda questo lavoro di Tesi abbiamo studiato l'efficienza di un particolare metodo per la stima del parametro di densità della materia detto test di Alcock-Paczynski. Con tale metodo si studiando le distorsioni geometriche che un’errata assunzione dei parametri cosmologici introduce nella funzione di correlazione a due punti bidimensionale. Abbiamo applicato il test a diversi cataloghi prodotti dalla simulazione Magneticum. In particolare abbiamo studiato come l'efficienza del metodo nel riconoscere il corretto valore del parametro di densità dipenda dal tipo di tracciante considerato, dal redshift d'osservazione e dai metodi di modelizzazione delle distorsioni dovute alla dinamica degli oggetti osservati. Si è potuto osservare come l’efficienza del metodo dipenda dalla densità d’oggetti contenuti nel catalogo (rendendo le galassie il tracciante migliore su cui applicare il test) e dall’ampiezza dell’effetto di distorsione geometrica, massimo per redshift vicini a 1. Abbiamo verificato che considerare come indipendenti le misure effettuate sui cataloghi a diversi redshift migliora l’identificazione del corretto valore del parametro di densità. Nella combinazione delle diverse misure, inoltre, si nota che i contributi meno significativi vengono dai redshift estremi dell’intervallo considerato, ma i singoli risultati, per quanto incerti, non intaccano il risultato finale. Infine si è osservato come ridurre il numero di parametri liberi attraverso i quali si introducono nei modelli le distorsioni dinamiche, in particolar modo gli effetti di distorsione a piccole scale, migliora sensibilmente l’efficacia del metodo.

Stima della fecondità del lotto in una specie ittica a deposizione parziale (Engraulis encrasicolus): due aree a confronto, il Mar Tirreno e lo Stretto di Sicilia.

L'importanza dell'acciuga europea (Engraulis encrasicolus) come risorsa ittica, sia a livello economico che ecologico, nel Mar Mediterraneo, ha portato alla necessità di monitorare la biomassa deponente di questa specie per cercare di dare un limite al suo sovrasfruttamento (rappresentando il 22% delle catture nazionali). Lo studio effettuato riguarda le stime di fecondità dell'acciuga europea tramite l'applicazione di un metodo di analisi d'immagine, Whole Mount, su campioni di gonadi di adulti maturi e pronti alla deposizione. Il campionamento degli esemplari è avvenuto durante due campagne oceanografiche, organizzate dall'U.O.S di Capo Granitola dell'Istituto per l'Ambiente Marino Costiero del CNR, che hanno coperto l'area dello Stretto di Sicilia e del Mar Tirreno, durante i mesi estivi che rappresentano il picco di deposizione della specie. Nel presente lavoro sono stati analizzati in totale 76 ovari di acciuga, provenienti da entrambe le aree di campionamento e che presentassero ovociti maturi e risultassero, quindi, in una fase di deposizione nota come "deposizione imminente". Per entrambe le aree di studio è stata stimata una relazione lunghezza-peso con andamento esponenziale. I test statistici non parametrici di Kolmogorov-Smirnov e di Mann-Whitney hanno permesso di stimare se vi fossero differenze tra la fecondità, l'indice gonadosomatico (IGS) e il fattore di condizione (CF) nelle due aree, Stretto di Sicilia e piattaforma settentrionale siciliana. I valori di CF sono risultati significativamente differenti tra le due aree se valutati con il test di Kolmogorov-Smirnov, tuttavia tale differenza non è stata confermata dal test di Mann-Whitney. L'IGS e la fecondità, invece, sono risultati significativamente diversi nelle due aree per entrambi i test. Si può ipotizzare che valori di fecondità differenti nelle due aree, nonostante in entrambi i casi il campionamento sia avvenuto durante il picco di riproduzione della specie, possono essere dovuti alla variabilità dei fattori abiotici, quali temperature e nutrienti, differenti nello Stretto di Sicilia e nell'area lungo le coste settentrionali siciliane. Temperatura e nutrienti possono essere differenti, poiché vi è un diverso movimento delle masse d'acqua causato da correnti distinte nelle due aree. Conoscere la variabilità dei parametri riproduttivi di una specie di rilevanza commerciale così alta, come l'acciuga, rappresenta uno strumento fondamentale per scegliere le misure di gestione sostenibile degli stock più appropriate per aree differenti.

Analisi del cammino di pazienti post-cardiochirurgici durante la riabilitazione domiciliare tramite l'utilizzo di una mobile app

Con il presente studio si analizza il Six Minute Walking Test di pazienti post-cardiochirurgici durante la riabilitazione domiciliare attraverso l’utilizzo di una mobile app e sensori indossabili. Inoltre sono state intraprese alcune attività preliminari per integrare l’app per la valutazione motoria all'interno di un progetto sanitario di Telemedicina.

Valutazione dell'effetto dell'invecchiamento termico sulle proprietà meccaniche di materiali compositi

L’obiettivo della presente tesi è analizzare, attraverso una campagna sperimentale, gli effetti dell’invecchiamento termico su materiali compositi avanzati. Due serie di provini, ottenuti da pannelli di fibra di carbonio/resina epossidica realizzati rispettivamente con le tecniche di produzione tramite laminazione manuale e RTM (Resin Transfer Molding), sono stati condizionati in forno o in congelatore per un determinato tempo e successivamente sottoposti a test di caratterizzazione meccanica. In questo modo sono state confrontate le prestazioni delle due tecnologie al fine di verificare l’applicabilità del processo RTM a prodotti di alta qualità. I campioni, impiegati nel presente studio, sono stati realizzati scegliendo una configurazione cross-ply, che ben si adatta alle successive fasi della campagna. Sui provini ottenuti sono stati eseguiti dei test di resistenza alla delaminazione tramite una pressa con supporti adattati appositamente allo scopo. Questa campagna sperimentale è stata svolta presso i laboratori hangar della Scuola di Ingegneria e Architettura dell’Università di Bologna, sede di Forlì. La caratterizzazione del materiale è avvenuta mediante prove a flessione D2344.

Studio sperimentale del comportamento a fatica di calcestruzzi rinforzati con fibre sintetiche

La presente tesi di Laurea Magistrale ha lo scopo di studiare sperimentalmente il comportamento a fatica dei calcestruzzi rinforzati con fibre macro-sintetiche (Macro Synthetic Fiber Reinforced Concrete, MSFRC). Sono condotte prove cicliche di flessione su tre punti al fine di caratterizzare il comportamento dei calcestruzzi fibrorinforzati in regime fessurato nel caso di fatica ad alto numero di cicli (High Cycle Fatigue, HCF). Oltre a prove di fatica sono condotte anche prove monotone a flessione al fine di ottenere la caratterizzazione meccanica del materiale determinandone i principali parametri di frattura; i risultati di tali prove sono utili anche a definire la procedura di prova definitiva da adottare durante i test di fatica. Le testimonianze presenti in letteratura sul comportamento a fatica degli FRC rinforzati con fibre sintetiche sono molto limitate, specialmente nel caso di fatica ad alto numero di cicli; inoltre le prove cicliche, a differenza delle prove monotone, non sono prove standardizzate e quindi definite dalla normativa. Nel corso della presente campagna sperimentale si cercherà quindi di definire una procedura per poter eseguire in maniera stabile le prove di flessione, monotone e di fatica, su campioni prismatici di calcestruzzo fibrorinforzato. L’idea alla base della campagna sperimentale oggetto di questa tesi è quella di riprodurre, mediante prove di fatica, le usuali condizioni di esercizio a cui sono sottoposte, durante la loro vita utile, strutture come pavimentazioni stradali o industriali; infatti il traffico stradale o il transito di macchinari possono indurre su strutture del genere dei carichi ripetuti nel tempo tali da provocarne il collasso per fatica. La presente tesi è articolata in otto capitoli nei quali verranno evidenziate le principali proprietà, sia meccaniche che fisiche, del materiale composito oggetto dello studio, saranno definite le procedure dei test eseguiti e verranno discussi i risultati derivanti da essi.

Caratterizzazioni fisiche-meccaniche di piastrelle ceramiche di grande formato

Negli ultimi anni la produzione di materiale ceramico si è spostata su formati di grandi dimensioni. Questo processo è stato possibile grazie allo sviluppo di nuove tecnologie adeguate alla produzione di lastre in grès porcellanato con spessore sempre più ridotto e in formati sempre più grandi. Molte aziende si sono quindi orientate alla produzione delle grandi lastre servendosi di queste nuove tecnologie innovative, proprio perché questi prodotti sono risultati essere particolarmente versatili. Come le piastrelle di formato tradizionale, anche questi grandi formati devono essere certificati con il marchio CE, quindi devono essere eseguite delle prove di caratterizzazione delle loro caratteristiche fisiche-meccaniche. Tuttavia, cambiando notevolmente le dimensioni, per queste grandi lastre si possono introdurre anche nuovi test di prova per determinare nuove caratteristiche, come ad esempio la possibilità di flettersi per adattarsi alla forma della superficie dove vengono collocate (facciate di edifici, rivestimenti di gallerie autostradali, etc.). Di conseguenza nasce l’esigenza di valutare questi nuovi parametri, tra cui il raggio di curvatura è particolarmente rilevante per valutare appunto la flessibilità della lastra. Nel presente lavoro di tesi sono state svolte prove di caratterizzazione delle proprietà fisiche-meccaniche di piastrelle ceramiche di grande formato. I campioni sono stati sottoposti a prove per la determinazione della freccia e del raggio di curvatura sotto il peso proprio e a rottura nelle configurazioni fronte e retro. Dall’analisi dei dati sperimentali sono state dedotte conclusioni in merito alla possibile dipendenza della freccia e del raggio di curvatura dalle caratteristiche dei campioni. Oltre alle prove di determinazione della freccia e conseguente raggio di curvatura, a completamento del lavoro sperimentale svolto sono state eseguite anche prove di assorbimento di acqua e di analisi d’immagine per determinare la porosità totale.

Le conseguenze del pensionamento sulle competenze plurilingui di immigrati italiani in Svizzera

La nostra proposta presenta alcuni aspetti e risultati di un progetto dell'Università di Berna che si occupa delle conseguenze del pensionamento sulle competenze plurilingui di immigrati italiani nella Svizzera tedesca. Rifacendoci a De Bot (2007), che ha definito come “language related major life events” i momenti nella vita rilevanti per mutamenti delle competenze linguistiche, ipotizziamo che il pensionamento possa costituire un punto di svolta nella biografia linguistica di migranti (ma non solo) anche se finora mancano gli studi sull’argomento. Nel caso delle persone prese in considerazione il pensionamento rappresenta un momento fondamentale, quasi paragonabile, per le conseguenze che implica, al momento della migrazione. Se quest'ultima è stata, nella maggior parte dei casi, caratterizzata dalla ricerca di lavoro, la nuova fase della vita dopo il pensionamento comporta mutamenti nelle reti sociali e ha conseguenze anche per l'uso delle lingue. Un punto centrale della ricerca è la domanda di come i migranti affrontino questo momento all’interno della situazione diglossica della Svizzera tedesca, in cui lo svizzero tedesco è stato imparato attraverso il contatto strumentale e accanto ad esso si è mantenuta la lingua d'origine (cfr.Berruto 1991). La metodologia applicata consiste in due fasi: nella prima si utilizzano questionari per ottenere informazioni generali sui dati demografici e sulla situazione sociale, e per elicitare autovalutazioni delle competenze linguistiche. Nella seconda si effettuano interviste semiguidate per ottenere informazioni più approfondite sulla vita e sulle biografie linguistiche. Per ottenere dati relativi alle competenze linguistiche, viene inoltre utilizzato un test di competenza dello svizzero tedesco, sviluppato all’interno del progetto sulla base del SOPI (cfr.Kenyon 2000).

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.