Anforderungsgerechte Datenermittlung für Fertigungssysteme

Die in den Betrieben häufig mit hohem gerätetechnischen und organisatorischem Aufwand installierten EDV-gestützten Informationssysteme zur Planung und Steuerung des Fertigungsprozesses genügen im allgemeinen nicht den an sie gestellten Anforderungen. Die Gründe dafür liegen in der Hauptsache in einem falschen Modellansatz und der mangelnden Datenqualität der eingesetzten Daten, verbunden mit einer unzureichenden Rückkopplung zwischen Vorgabe und Rückmeldung. Hinzu kommen das Fehlen geeigneter Aussagen (Kenngrößen) zur gezielten Beeinflussung des Prozesses und Akzeptanzprobleme der Mitarbeiter beim Umgang mit der EDV. Die genannten Schwachstellen geben die Richtung der Zielsetzung dieser Arbeit vor. Dieses Ziel bestand zunächst darin, eine Methode zu entwickeln, mit der die Anforderungen an die in einem Industriebetrieb zur Planung, Steuerung und Überwachung verwendeten Daten zu formulieren sind, um dann eine anforderungsgerechte Abstimmung dieser Daten im betrieblichen Datenfluß im Sinne eines kybernetischen Regelkreises vorzunehmen und Aussagen über die betrieblichen Zielgrößen zu erhalten. Aus der Vielzahl betrieblicher Vorgänge und Funktionsbereiche wurde der Fertigungsprozeß bei der Werkstättenfertigung im Produktionsbetrieb deshalb ausgewählt, weil hier in der Praxis wegen der Komplexität der Abläufe die höchsten Anforderungen an die Daten gestellt werden und deshalb auch die meisten Probleme bei der Erfüllung dieser Anforderungen auftreten. Außerdem ist die Fertigung nach dem Werkstättenprinzip am häufigsten in der Praxis anzutreffen. Als erstes war es nötig, die zeitlichen, quantitativen und qualitativen Anforderungen an die Daten aus einer Vielzahl durchgeführter Schwachstellenanalysen herauszuarbeiten und zu definieren. Die nächste Aufgabe bestand darin, die Einflußgrößen auf die Datenanforderungen, hier unterteilt in innere (datumsbezogene) und äußere (prozeßbezogene) zu bestimmen und in ihren Auswirkungen zu untersuchen. Die Betrachtung der Einflußgrößen ergab, daß die Aufgabe und die Verwendung des Datums im Prozeß für die Ermittlung der Anforderungen exakt bestimmt werden müssen. Aus diesem Grund war der Prozeß primär- und sekundärseitig in Abhängigkeit der Aufgabenstellung ausführlich zu beschreiben. Die Einflüsse der Aufbauorganisation waren ebenso wie die der Ablauforganisation zu berücksichtigen, darunter fielen auch die Auswirkungen der Automatisierungsansätze, z.B. durch den Einsatz flexibler Fertigungssysteme im Primärprozeß. Der Ansatz, von dem hier ausgegangen wurde, baut sich deshalb im ersten Schritt der vorgeschlagenen Vorgehensweise auf dem Modell eines Produktionssystems auf, das aus den Erkenntnissen von in mehreren Firmen durchgeführten Prozeßanalysen entwickelt wurde. In diesem Modell ist der Datenfluß und organisatorische Ablauf im Fertigungsprozeß in Matrixform festgehalten. Für jedes einzelne Prozeßdatum sind in der Matrix, bezogen auf die Aufgabenstellung, detailliert die Verwendungs- und Verflechtungsbeziehungen aufgezeichnet. Im zweiten Schritt erfolgt auf der Grundlage dieses Modells eine bedarfsgerechte Prozeßdatenauswahl. Die zeitliche Struktur des Datenflusses im Prozeß wird in Schritt drei mit Hilfe eines Ereignis-Zeitgraphens dargestellt. Die eigentliche zeitliche, quantitative und qualitative Anforderungsermittlung findet im vierten und gleichzeitig letzten Schritt anhand einer dafür entworfenen Datenanforderungsliste statt. Die Ergebnisse dieser anforderungsgerechten Datenanalyse nach der hier entwikkelten Systematik können in vielerlei Hinsicht Verwendung finden. Im Hinblick auf die eingangs genannten Problemstellungen sind beispielsweise folgende Einsatzmöglichkeiten denkbar und an Beispielen im einzelnen erläutert. - Verbesserung der Datenqualität - Rückkopplung im Sinne des kybernetischen Regelkreismodells - Bilden von Prozeßkenngrößen - Transparenz der EDV-Prozeßabläufe

Gemeinkostenerfassung im BDE-System : ein Konzept zur verursachungsgerechten Erfassung der Gemeinkosten im Produktionsprozeß

Eine schnelle Erfassung aller Wartezeiten und Störungen im Produktionsablauf und ihre richtige kostenmäßige Bewertung zu einer wirksamen Kontrolle der Gemeinkosten in der Produktion ist schon seit langem eine betriebliche Forderung. Ihre Erfüllung scheiterte bisher häufig an fehlenden organisatorischen Voraussetzungen und den nicht für diese Zwecke geeigneten EDV-Sachmitteln. Mit Hilfe von online konzipierten, im Dialog arbeitenden BDE-Systemen können diese Mängel jetzt behoben werden. Schwachstellen im Prozess lassen sich aktuell lokalisieren und damit auch rasch beseitigen. Das im folgenden hier vorgestellte Programm zur Erfassung der benötigten Daten ist gleichzeitig die Kernzelle eines zur Planung und Steuerung des Auftragsbearbeitungsprozesses eingesetzten Logistiksystems, mit dem noch eine große Anzahl weiterer organisatorischer Aufgaben gelöst werden kann. Betrachtungsschwerpunkt in diesem Beitrag ist die verursachungsgerechte Erfassung von Gemeinkosten im Prozess.

Verbesserung der Lieferfähigkeit

Die Schaffung eines marktorientierten Lieferspektrums für eine optimale Marktversorgung stellt erhöhte Anforderungen an die Planung und Steuerung des Auftragsabwicklungsprozesses. Über ein betriebsspezifisch entwickeltes Logistikkonzept mit einer anforderungsgerechten CIM-Werkzeuganwahl lassen sich die vorhandenen Probleme, ein volles Fertigwarenlager mit nicht nachgefragten Fertigartikeln, lösen.

Smart electricity networks based on large integration of renewable sources and distributed generation

Das Grünbuch 2006 der Europäischen Kommission "Eine Europäische Strategie für nachhaltige, wettbewerbsfähige und sichere Energie" unterstreicht, dass Europa in ein neues Energie-Zeitalter eingetreten ist. Die vorrangigen Ziele europäischer Energiepolitik müssen Nachhaltigkeit, Wettbewerbsfähigkeit und Versorgungssicherheit sein, wobei sie eine zusammenhängende und logische Menge von Taktiken und Maßnahmen benötigt, um diese Ziele zu erreichen. Die Strommärkte und Verbundnetze Europas bilden das Kernstück unseres Energiesystems und müssen sich weiterentwickeln, um den neuen Anforderungen zu entsprechen. Die europäischen Stromnetze haben die lebenswichtigen Verbindungen zwischen Stromproduzenten und Verbrauchern mit großem Erfolg seit vielen Jahrzehnten gesichert. Die grundlegende Struktur dieser Netze ist entwickelt worden, um die Bedürfnisse großer, überwiegend auf Kohle aufgebauten Herstellungstechnologien zu befriedigen, die sich entfernt von den Verbraucherzentren befinden. Die Energieprobleme, denen Europa jetzt gegenübersteht, ändern die Stromerzeugungslandschaft in zwei Gesichtspunkten: die Notwendigkeit für saubere Kraftwerkstechnologien verbunden mit erheblich verbesserten Wirkungsgraden auf der Verbraucherseite wird es Kunden ermöglichen, mit den Netzen viel interaktiver zu arbeiten; andererseits müssen die zukünftigen europaweiten Stromnetze allen Verbrauchern eine höchst zuverlässige, preiswerte Energiezufuhr bereitstellen, wobei sowohl die Nutzung von großen zentralisierten Kraftwerken als auch kleineren lokalen Energiequellen überall in Europa ausgeschöpft werden müssen. In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, dass die Informationen, die in dieser Arbeit dargestellt werden, auf aktuellen Fragen mit großem Einfluss auf die gegenwärtigen technischen und wirtschaftspolitischen Diskussionen basieren. Der Autor hat während der letzten Jahre viele der hier vorgestellten Schlussfolgerungen und Empfehlungen mit Vertretern der Kraftwerksindustrie, Betreibern von Stromnetzen und Versorgungsbetrieben, Forschungsgremien und den Regulierungsstellen diskutiert. Die folgenden Absätze fassen die Hauptergebnisse zusammen: Diese Arbeit definiert das neue Konzept, das auf mehr verbraucherorientierten Netzen basiert, und untersucht die Notwendigkeiten sowie die Vorteile und die Hindernisse für den Übergang auf ein mögliches neues Modell für Europa: die intelligenten Stromnetze basierend auf starker Integration erneuerbarer Quellen und lokalen Kleinkraftwerken. Das neue Modell wird als eine grundlegende Änderung dargestellt, die sich deutlich auf Netzentwurf und -steuerung auswirken wird. Sie fordert ein europäisches Stromnetz mit den folgenden Merkmalen: – Flexibel: es erfüllt die Bedürfnisse der Kunden, indem es auf Änderungen und neue Forderungen eingehen kann – Zugänglich: es gestattet den Verbindungszugang aller Netzbenutzer besonders für erneuerbare Energiequellen und lokale Stromerzeugung mit hohem Wirkungsgrad sowie ohne oder mit niedrigen Kohlendioxidemissionen – Zuverlässig: es verbessert und garantiert die Sicherheit und Qualität der Versorgung mit den Forderungen des digitalen Zeitalters mit Reaktionsmöglichkeiten gegen Gefahren und Unsicherheiten – Wirtschaftlich: es garantiert höchste Wirtschaftlichkeit durch Innovation, effizientes Energiemanagement und liefert „gleiche Ausgangsbedingungen“ für Wettbewerb und Regulierung. Es beinhaltet die neuesten Technologien, um Erfolg zu gewährleisten, während es die Flexibilität behält, sich an weitere Entwicklungen anzupassen und fordert daher ein zuversichtliches Programm für Forschung, Entwicklung und Demonstration, das einen Kurs im Hinblick auf ein Stromversorgungsnetz entwirft, welches die Bedürfnisse der Zukunft Europas befriedigt: – Netztechnologien, die die Stromübertragung verbessern und Energieverluste verringern, werden die Effizienz der Versorgung erhöhen, während neue Leistungselektronik die Versorgungsqualität verbessern wird. Es wird ein Werkzeugkasten erprobter technischer Lösungen geschaffen werden, der schnell und wirtschaftlich eingesetzt werden kann, so dass bestehende Netze Stromeinleitungen von allen Energieressourcen aufnehmen können. – Fortschritte bei Simulationsprogrammen wird die Einführung innovativer Technologien in die praktische Anwendung zum Vorteil sowohl der Kunden als auch der Versorger stark unterstützen. Sie werden das erfolgreiche Anpassen neuer und alter Ausführungen der Netzkomponenten gewährleisten, um die Funktion von Automatisierungs- und Regelungsanordnungen zu garantieren. – Harmonisierung der ordnungspolitischen und kommerziellen Rahmen in Europa, um grenzüberschreitenden Handel von sowohl Energie als auch Netzdienstleistungen zu erleichtern; damit muss eine Vielzahl von Einsatzsituationen gewährleistet werden. Gemeinsame technische Normen und Protokolle müssen eingeführt werden, um offenen Zugang zu gewährleisten und den Einsatz der Ausrüstung eines jeden Herstellers zu ermöglichen. – Entwicklungen in Nachrichtentechnik, Mess- und Handelssystemen werden auf allen Ebenen neue Möglichkeiten eröffnen, auf Grund von Signalen des Marktes frühzeitig technische und kommerzielle Wirkungsgrade zu verbessern. Es wird Unternehmen ermöglichen, innovative Dienstvereinbarungen zu benutzen, um ihre Effizienz zu verbessern und ihre Angebote an Kunden zu vergrößern. Schließlich muss betont werden, dass für einen erfolgreichen Übergang zu einem zukünftigen nachhaltigen Energiesystem alle relevanten Beteiligten involviert werden müssen.

Merkmale "guter Supervision"

Als Merkmale "guter Supervision" wurden in einer empirischen Studie vor allem die strikte Aufgabenorientierung der Supervisoren, die umfassende sozialwissenschaftliche Fundierung ihrer Interventionen, ihre Triangulierungskompetenz und die Ressourcenorientierung herausgearbeitet. Den Supervisionsexperten gelingt es, die Abstinenz in der Supervision und die Handhabung von Übertragung und Widerstand feldspezifisch und gegenstandsangemessen zu variieren. Erfolgreiche Supervisoren, so ließ sich zeigen, vereinen Fähigkeiten als Team- und Personalentwickler, Organisationsberater, Lehrer und Forscher und verfügen über gut entwickelte Fall- und Teamsupervisionskompetenz. Der vorliegende Aufsatz stellt eine konzeptionelle Reflexion zu den Ergebnissen des Forschungsprojekts dar.

Supervision: Kunst oder Wissenschaft?

In der Betrachtung der Supervision begegnen sich zwei unterschiedliche Perspektiven. Einerseits wird Supervision als schlichte Anwendung wissenschaftlich gewonnener Erkenntnisse gewertet. Andererseits läßt sie sich jedoch auch als eine »Kunst« begreifen. Die Autoren gehen davon aus, daß sich professionelles supervisorisches Handeln nicht hierarchisch einem wissenschaftlichen Regelwerk unterstellen läßt, sondern daß beide Bereiche gleichberechtigt ihren je eigenen Diskurs- und Handlungsformen folgen. Sinnvoll scheint es, das supervisorische Tun als einen heuristischen Suchprozeß zu beschreiben und ihn mit Hilfe der Erkenntnisse der Kreativitätsforschung besser zu verstehen. Die Autoren plädieren weiterhin dafür, daß eine psychoanalytisch orientierte Supervision nur als ein dialogisch-intersubjektives Geschehen begriffen werden kann, in dem die biographische "Wahrheit" oder das institutionelle bzw. organisatorische Unbewußte in einem gleichsam poetisch-schöpferischen Akt zwischen Supervisor und Supervisand(en) gemeinsam erfunden und erzeugt wird.

Möglichkeiten zur Verwaltungsentwicklung auf der Basis einer Prozessgestaltung im IT-Labor, untersucht am Beispiel der Implementierung von E-Government bei der hessischen Landeshauptstadt Wiesbaden

In der vorliegenden Arbeit wird nach Wegen zur Steigerung der Effektivität von Implementationsprozessen umfassender IT-Anwendungen in großen Kommunalverwaltungen gesucht, da nach vorliegenden Schätzungen allenfalls 10 % der großen IT-Projekte der öffentlichen Verwaltungen zielkonform und erfolgreich umgesetzt werden. Analysen zeigen, dass die in solchen Prozessen auftretenden Interdependenzen von Technologie, Organisation und Mensch oft nicht angemessen berücksichtigt wurden. Die zentrale Fragestellung der vorliegenden Untersuchung lautet daher, ob ein IT-Labor mit einer vorgelagerten ablauforganisatorischen Prozessoptimierung im Sinne eines funktionalen Wirksamkeitstests mit einer ganzheitlichen Betrachtung von technologischen, organisatorischen und sozial-humanen Wirkungsfaktoren bei intensiver Einbeziehung von eigenem Personal der Anwendungsorganisation den Implementierungserfolg größerer IT-Vorhaben erhöhen kann. Als methodischer Ansatz wurde eine Fallstudie gewählt (Implementierung von eAkten und SOA). Der Implementierungsverlauf ist methodisch in eine vorgelagerte ablauforganisatorische Prozessoptimierung und in eine nachgelagerte informationstechnologische Umsetzungsphase (sog. IT-Labor) gegliedert. Die Fallstudie legt den Schluss nahe, dass ein IT-Labor mit einer vorgelagerten ablauforganisatorischen Prozessanalyse zum Erfolg der Implementation wesentlich beitragen kann. Zudem zeigte sich, dass eine serviceorientierte Architektur zur prozessorientierten ganzheitlichen technologischen Systemgestaltung die Integration vorhandener IT-Anwendungen fördern kann. Die beschriebene IT-Laborstrategie kann im Ergebnis als ein erprobter Weg zur erfolgreichen Implementierung komplexer IT-Vorhaben empfohlen werden. Aufgrund der Analyse können einige kritische Erfolgsfaktoren für einen späteren Produktivbetrieb identifiziert werden: - Eigene Personalressourcen mit den zugehörigen Lernprozessen sind unverzichtbar, - In diesem Kontext sind auch die zugehörigen organisatorischen und technologischen Voraussetzungen zu schaffen, - Eventuell auftretende Qualifikationsdefizite der Anwender können in Zusammenarbeit mit externen Unternehmen und IT-Dienstleistern im Verbund mit den eigenen Projektmitgliedern zeitnah kompensiert werden. Die angewandte Implementierungs-Methodik ist auf solche Fälle übertragbar, in denen eine Gebietskörperschaft ab der Aufgabenstruktur einer großen kreisfreien Stadt mit heterogenen und dezentralen IT- und Organisationsstrukturen unterschiedliche Fachverfahren in einem komplexen Verwaltungssystem ganzheitlich und prozessorientiert zusammenführen möchte. Grenzen können sich somit aus der Größe einer Gebietskörperschaft, dem konkreten Aufgabenprofil sowie der finanziellen Leistungsfähigkeit ergeben. Eine Transferfähigkeit unter sozialen Gesichtspunkten setzt voraus, dass neben externem Personal qualifiziertes internes Personal mit Fachwissen und Querschnitts-Know-How bereitgestellt wird. Räumlich und zeitlich setzt die Verallgemeinerungsfähigkeit eine analoge politische und administrative Struktur mit einem entsprechenden Entwicklungsstand voraus. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung können Behördenleiter, IT-Verantwortliche und Beratungsunternehmen künftig in vergleichbaren Fällen eine effektivere Implementierungsmethode wählen. In der weiteren verwaltungswissenschaftlichen Forschung auf diesem Gebiet können auf der Basis der vorgenommenen Untersuchung konkrete Erfahrungen zur IT-Implementierung erhoben und bewertet werden, um weitere Effektivitätsreserven zu identifizieren.

De la désorganisation à l’organisation apprenante en milieu rural

ZUSAMMENFASSUNG Von der „Chaosgruppe“ zur lernenden Organisation. Fallstudien zur Induzierung und Verbreitung von Innovation in ländlichen Kleinorganisationen im Buruli (Zentral-Uganda). Die oft fehlende Nachhaltigkeit landwirtschaftlicher Projekte in Afrika allgemein und in Buruli (Zentral-Uganda) insbesondere gab den Anstoß zu der Forschung, die der vorliegenden Dissertation zugrunde liegt. Ein häufiger Grund für das Scheitern von Projekten ist, dass die lokale Bevölkerung die landwirtschaftliche Innovation als Risiko für die Ernährungssicherheit der Familie betrachtet. Die vorliegende Arbeit ist daher ein Beitrag zur Suche nach einem Weg zur Nachhaltigkeit, der dieser Tatsache Rechnung trägt. Als Forschungsmethode wurden die Gruppendiskussion und die Beobachtung mit den beiden Varianten „teilnehmender Beobachter“ und „beobachtender Teilnehmer“ gemäß Lamnek(1995b) angewendet. Es stellte sich heraus, dass die ablehnende Haltung der Zielbevölkerung landwirtschaftlicher Innovation gegenüber durch finanzielle Anreize, Seminare oder die Überzeugungskunst von Mitarbeitern der Entwicklungsorganisationen kaum behoben werden kann, sondern nur durch den Einbezug der Menschen in einen von ihnen selbst gesteuerten Risikomanagementprozess. Die Prozessberatung von Schein (2000) und die nichtdirektive Beratung von Rogers (2010) haben sich im Rahmen unserer Untersuchung für die Motivierung der Bevölkerung für eine risikobewusste Entwicklungsinitiative von großem Nutzen erwiesen ebenso wie für die Beschreibung dieses Prozesses in der vorliegenden Studie. Die untersuchten Gruppen wurden durch diesen innovativen Ansatz der Entwicklungsberatung in die Lage versetzt, das Risiko von Innovation zu analysieren, zu bewerten und zu minimieren, ihre Zukunft selbst in die Hand zu nehmen und in einem sozialen, ökonomischen und physischen Umfeld zu gestalten sowie auf Veränderungen im Laufe der Umsetzung angemessen zu reagieren. Der Erwerb dieser Fähigkeit setzte eine Umwandlung einfacher Bauerngruppen ohne erkennbare Strukturen in strukturierte und organisierte Gruppen voraus, die einer lernenden Organisation im ländlichen Raum entsprechen. Diese Transformation bedarf als erstes eines Zugangs zur Information und einer zielorientierten Kommunikation. Die Umwandlung der Arbeitsgruppe zu einer lernenden Bauernorganisation förderte die Nachhaltigkeit des Gemüseanbauprojekts und das Risikomanagement und wurde so zu einem konkreten, von der Umwelt wahrgenommenen Beispiel für die Zweckmäßigkeit des oben beschriebenen Forschungsansatzes. Die Herausbildung einer lernenden Organisation ist dabei nicht Mittel zum Zweck, sondern ist selbst das zu erreichende Ziel. Die Beobachtung, Begleitung und Analyse dieses Umwandlungsprozesses erfordert einen multidisziplinären Ansatz. In diesem Fall flossen agrarwissenschaftliche, soziologische, linguistische und anthropologische Perspektiven in die partnerschaftlich ausgerichtete Forschung ein. Von der Entwicklungspolitik erfordert dieser Ansatz einen neuen Weg, der auf der Partnerschaft mit den Betroffenen und auf einer Entemotionalisierung des Entwicklungsvorhabens basiert und eine gegenseitige Wertschätzung zwischen den Akteuren voraussetzt. In diesem Prozess entwickelt sich im Laufe der Zeit die „lernende“ Bauernorganisation auch zu einer „lehrenden“ Organisation und wird dadurch eine Quelle der Inspiration für die Gesamtgesellschaft. Die Nachhaltigkeit von ländlichen Entwicklungsprojekten wird damit maßgeblich verbessert.

Virus-Wirt-Interaktionen bei Hepatitis-B-Virus-Infektionen: Die Rolle von Gamma2-Adaptin

Mit etwa 350 Millionen chronisch-infizierten Menschen gehört die Hepatitis-B neben der Tuberkulose und AIDS zu den häufigsten Infektionskrankheiten der Welt. Der einzig sichere Schutz vor dem bis zur Leberzirrhose persistierenden Virus bietet eine vorbeugende Impfung. Eine angemessene Therapie chronisch-erkrankter Patienten ist durch die Unkenntnis über viele Bereiche des HBV-Lebenszyklus nur eingeschränkt möglich. Gegenstand dieser Arbeit war vor allem etwas Licht in das Wechselspiel zwischen HBV und der Wirtszelle zu bringen und zelluläre Komponenten und Mechanismen zu identifizieren, die am Sortierungs- und Transportmechanismus viraler Substrukturen zur sogenannten Assembly-Plattform beteiligt sind, um dort die Freisetzung des Virus zu initiieren. Mit der vorliegenden Arbeit habe ich Methoden der Zellbiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und Virologie vereint, um neue Einblicke in den HBV-Lebenszyklus zu gewinnen. Für die Ausschleusung von HBV wird seither der konstitutive Weg der Sekretion angenommen. In Anlehnung an den Mechanismus umhüllter RNA-Viren kann die Hypothese aufgestellt werden, dass das MVB (Multivesicular Body) im Prozess der HBV-Freisetzung beteiligt sein könnte. Die Freisetzung des Hepatitis-B-Virus aus einer infizierten Zelle ist ein streng organisierter Prozess, der sowohl das HBV-Coreprotein als auch die HBV-Hüllproteine zu benötigen scheint. (max. 5.000 Zeichen)Inhaltszusammenfassung in einer weiteren Sprache deutschenglischfranzösischrussischmehrsprachigsonst.Ausgangspunkt der Arbeit war eine spezifische Interaktion des großen HBV-Hüllproteins (L) mit einem neuen Mitglied der Adaptor-Protein-Komplex-Familie (AP-Komplex), dem g2?Adaptin (Hartmann-Stühler und Prange, 2001), das mutmaßlich an endosomalen Sortierungs- und Transportprozessen beteiligt ist. In Analogie zur Funktionsweise von Adaptin-Molekülen wurde vom g2-Adaptin eine Rolle in der Initiation und Steuerung der Sprossung und Freisetzung von HBV vermutet. Die im Rahmen dieser Arbeit erweiterte Charakterisierung der g2/L-Interaktion zeigte zum einen, dass die Ohrdomäne des Adaptins für die Interaktion essentiell ist und zum anderen, dass die Rekrutierung des Adaptins durch das L-Protein zu cis-Golgi-Strukturen innerhalb kleiner Transportvesikel entlang des Nukleus (perinukleär) erfolgt. Erste Ergebnisse dieser Arbeit deuteten bereits an, dass das virale Coreprotein mit demselben Adaptorprotein zu interagieren vermag. Für die g2/Core-Interaktion erwies sich in Folgearbeiten die Kopfregion des g2-Adaptins als die entscheidende Bindungsdomäne (Rost et al., 2006). Sowohl eine funktionelle Inaktivierung des g2-Adaptins durch RNA-Interferenz als auch eine g2-Adaptin- Überexpression störten die Virusmontage in späten Phasen der Morphogenese. Während ein g2-Adaptin-Überschuss die HBV-Produktion indirekt durch die Induktion dysfunktioneller endosomaler Kompartimente blockierte, verhinderte der siRNA-induzierte g2-Adaptin-Verlust die späte Ausschleusung des Virus aus der Zelle. Das Silencing von g2-Adaptin zeigte dabei weder einen Einfluss auf endosomale Strukturen noch auf die Freisetzung subviraler Partikel (Viren ohne Genom). Demzufolge scheinen sich die Mechanismen der Produktion von subviralen und viralen HBV-Partikeln bezüglich ihrer Anforderungen an Zellfunktionen und Transportwegen deutlich voneinander zu unterscheiden. Es konnten erste Hinweise darauf gefunden werden, dass die Virusmontage an endosomalen Kompartimenten (zum Beispiel dem MVB) erfolgen könnte, was durch bereits weitergeführte Untersuchungen bestätigt werden konnte (Lambert et al., J Virol, epub ahead of print). Darüber hinaus ist inzwischen bekannt, dass das Hepatitis-B-Virus für den Zusammenbau und die Freisetzung nicht nur das Adaptor-verwandte g2-Adaptin, sondern auch die endosomale Ubiquitin Ligase Nedd4, wahrscheinlich in Zusammenhang mit Ubiquitin selbst (Rost et al., 2006), benötigt. Eine Untersuchung dieser weiterführenden Aspekte war jedoch nicht mehr Inhalt dieser Arbeit. Insgesamt weisen die Daten darauf hin, dass die Sortierung und der Transport der Substrukturen des Hepatitis-B-Virus durch den MVB-Komplex zu erfolgen scheint. Dabei könnte das g2-Adaptin mit Hilfe einer Reihe von Kofaktoren (wie zum Beispiel Nedd4, Ubiquitin, etc.) eine entscheidende Rolle an der Sortierung und Anbindung des viralen L- und Coreproteins an die Assembly-Plattform spielen. Doch der genaue Mechanismus, welcher große Ähnlichkeit mit dem umhüllter RNA-Viren (wie zum Beispiel HIV-1) aufweist, bleibt noch ungeklärt. Ob weitere zelluläre Kofaktoren an der HBV-Sprossung und Freisetzung beteiligt sind, bleibt ebenfalls unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Nukleation pflanzlicher Mikrotubuli: Expression relevanter Gene

Die wichtigsten Bestandteile des Cytoskeletts in pflanzlichen Zellen sind die Actinfilamente und die Mikrotubuli. Die Mikrotubuli spielen in der Organisation und der Morphogenese von pflanzlichen Zellen eine wichtige Rolle. Sie sind zusammen mit den Cellulosefibrillen an der Formgebung der Pflanzenzelle beteiligt. Sie bilden das Präprophaseband, das die Zellteilungsebene bestimmt und die Mitosespindel, die für die Trennung der Chromosomen sorgt, sowie den Phragmoplasten, der die Zellwand zwischen den Tochterzellen bildet. Weiterhin geben die Mikrotubuli durch Interaktion mit den Cellulose-Synthase-Komplexen die Richtung der Zellexpansion vor (GRANGER und CYR, 2001; LLOYD und CHAN, 2002; BASKIN, 2002). Die Mikrotubuli sind auch an der Stabilisierung der Zellform und an Transportprozessen beteiligt. Als Bestandteil der Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) wurde das γ-Tubulin identifiziert, das sehr wahrscheinlich an der Nukleation der Mikrotubuli beteiligt ist, indem es die Assemblierung der αβ-Tubulindimere zu Mikrotubuli einleitet. In tierischen Zellen ist durch intensive Forschung inzwischen relativ viel über die Funktion von γ-Tubulin, vor allem im Verlauf der Zellteilung bekannt, wie z. B. die Lokalisation in Centrosomen mit ihren paarweise angeordneten Centriolen, die die MTOCs darstellen. In pflanzlichen Zellen sind bisher nur wenige Funktionen des Proteins hinreichend geklärt. Die höheren Pflanzen besitzen keine Centriolen und keine Centrosomen. Über die Zellteilung hinaus gibt es kaum Anhaltspunkte über das Vorhandensein oder eventuelle Aufgaben von γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellkulturen und Pflanzengeweben. In dieser Arbeit wurde die Expression über PCR und die Messung des Proteingehalts von cytoskelett-relevanten Proteinen in den Entwicklungsstadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und von Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) von Nicotiana tabacum gemessen. Primäres Ziel war es eine Aussage zu erhalten, in welchem Ausmaß γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellen noch exprimiert wird und ob bzw. wie eine Regulation (transkriptionell oder posttranskriptionell) des γ-Tubulins in der Pflanze stattfindet. Für den Nachweis des γ-Tubulins auf der Proteinebene wurde ein pflanzenspezifischer γ-Tubulin Antikörper zu entwickelt. Bei diesem Antikörper handelte es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch gegen eine Sequenz in pflanzlichem γ-Tubulin gerichtet ist. Dabei zeigte der in der Arbeit entwickelte Antikörper gegen die pflanzliche JOSHI-Domäne spezifische Signale. Der erfolgte Nachweis von γ-Tubulin auf der Proteinebene und der Transkripte zeigte bis in die ältesten untersuchten Stadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und in Geweben der Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) deutliche Signale für γ-Tubulin. Es war somit nicht nur in meristematisch aktiven Zellen und Geweben von Nicotiana tabacum, sondern auch in nichtmitotischen Zellen und Geweben vorhanden. Hierbei war über die Phasen der Zellteilung und der Zellformgebung hinweg auf beiden Ebenen eine parallele Entwicklung mit relativ konstanten starken Signalen zu beobachten. Nach dem Einstellen der Teilungsaktivität fiel der Gehalt an mRNA deutlich ab. Dabei nahm die Konzentration des Proteins im Vergleich zur mRNA zeitlich verzögert ab. Diese Ergebnisse bei der Zellsuspensionskultur (BY-2) und Tabakpflanze (SR1) gehen mit der möglichen Nukleationstätigkeit des Proteins konform. Es waren geringere aber doch deutlichen Signale bei Absterbenden Zellen der Zellkultur, bzw. bei expandierenden und voll expandierten und seneszenten Blättern der Tabakpflanze (SR1) nachzuweisen. Dies lässt die Folgerung zu, dass die nachgewiesene mRNA von γ-Tubulin nicht posttranskriptionell reguliert wird, sondern dass das γ-Tubulin auch eine wichtige Rolle außerhalb der Zellteilung in den postmitotischen Stadien, z. B. als organisierender Faktor bei der Umgestaltung oder Stabilisierung des Mikrotubuli-Cytoskeletts, spielt. Der γ-Tubulin-Gehalt in den Geweben der SR1-Pflanze zeigte über die Zellkultur hinaus, dass die Expression von α-Tubulin nach Einstellen der Teilungsaktivität kontinuierlich abnimmt. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass γ-Tubulin in älteren Blattgeweben zusätzliche Aufgaben übernehmen könnte, die nicht auf eine gleichzeitige Expression von α-Tubulin angewiesen sind. So kann beispielsweise eine Beteiligung von γ-Tubulin an der Stabilisierung der Mikrotubuli, und damit einhergehend eine Abnahme der dynamischen Instabilität dieser Filamente, eine denkbare Funktion des Proteins in expandierendem und voll expandiertem Gewebe sein. Die Aufgaben von γ-Tubulin in sehr altem Gewebe mit deutlichen Anzeichen der Seneszenz können allerdings nach dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig beantwortet werden und bedürfen weitergehenden Untersuchungen, da dadurch ein die Komplexität und die Dynamik des pflanzlichen Cytoskeletts geklärt werden kann.

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.