Nukleation pflanzlicher Mikrotubuli: Expression relevanter Gene

Die wichtigsten Bestandteile des Cytoskeletts in pflanzlichen Zellen sind die Actinfilamente und die Mikrotubuli. Die Mikrotubuli spielen in der Organisation und der Morphogenese von pflanzlichen Zellen eine wichtige Rolle. Sie sind zusammen mit den Cellulosefibrillen an der Formgebung der Pflanzenzelle beteiligt. Sie bilden das Präprophaseband, das die Zellteilungsebene bestimmt und die Mitosespindel, die für die Trennung der Chromosomen sorgt, sowie den Phragmoplasten, der die Zellwand zwischen den Tochterzellen bildet. Weiterhin geben die Mikrotubuli durch Interaktion mit den Cellulose-Synthase-Komplexen die Richtung der Zellexpansion vor (GRANGER und CYR, 2001; LLOYD und CHAN, 2002; BASKIN, 2002). Die Mikrotubuli sind auch an der Stabilisierung der Zellform und an Transportprozessen beteiligt. Als Bestandteil der Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) wurde das γ-Tubulin identifiziert, das sehr wahrscheinlich an der Nukleation der Mikrotubuli beteiligt ist, indem es die Assemblierung der αβ-Tubulindimere zu Mikrotubuli einleitet. In tierischen Zellen ist durch intensive Forschung inzwischen relativ viel über die Funktion von γ-Tubulin, vor allem im Verlauf der Zellteilung bekannt, wie z. B. die Lokalisation in Centrosomen mit ihren paarweise angeordneten Centriolen, die die MTOCs darstellen. In pflanzlichen Zellen sind bisher nur wenige Funktionen des Proteins hinreichend geklärt. Die höheren Pflanzen besitzen keine Centriolen und keine Centrosomen. Über die Zellteilung hinaus gibt es kaum Anhaltspunkte über das Vorhandensein oder eventuelle Aufgaben von γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellkulturen und Pflanzengeweben. In dieser Arbeit wurde die Expression über PCR und die Messung des Proteingehalts von cytoskelett-relevanten Proteinen in den Entwicklungsstadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und von Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) von Nicotiana tabacum gemessen. Primäres Ziel war es eine Aussage zu erhalten, in welchem Ausmaß γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellen noch exprimiert wird und ob bzw. wie eine Regulation (transkriptionell oder posttranskriptionell) des γ-Tubulins in der Pflanze stattfindet. Für den Nachweis des γ-Tubulins auf der Proteinebene wurde ein pflanzenspezifischer γ-Tubulin Antikörper zu entwickelt. Bei diesem Antikörper handelte es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch gegen eine Sequenz in pflanzlichem γ-Tubulin gerichtet ist. Dabei zeigte der in der Arbeit entwickelte Antikörper gegen die pflanzliche JOSHI-Domäne spezifische Signale. Der erfolgte Nachweis von γ-Tubulin auf der Proteinebene und der Transkripte zeigte bis in die ältesten untersuchten Stadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und in Geweben der Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) deutliche Signale für γ-Tubulin. Es war somit nicht nur in meristematisch aktiven Zellen und Geweben von Nicotiana tabacum, sondern auch in nichtmitotischen Zellen und Geweben vorhanden. Hierbei war über die Phasen der Zellteilung und der Zellformgebung hinweg auf beiden Ebenen eine parallele Entwicklung mit relativ konstanten starken Signalen zu beobachten. Nach dem Einstellen der Teilungsaktivität fiel der Gehalt an mRNA deutlich ab. Dabei nahm die Konzentration des Proteins im Vergleich zur mRNA zeitlich verzögert ab. Diese Ergebnisse bei der Zellsuspensionskultur (BY-2) und Tabakpflanze (SR1) gehen mit der möglichen Nukleationstätigkeit des Proteins konform. Es waren geringere aber doch deutlichen Signale bei Absterbenden Zellen der Zellkultur, bzw. bei expandierenden und voll expandierten und seneszenten Blättern der Tabakpflanze (SR1) nachzuweisen. Dies lässt die Folgerung zu, dass die nachgewiesene mRNA von γ-Tubulin nicht posttranskriptionell reguliert wird, sondern dass das γ-Tubulin auch eine wichtige Rolle außerhalb der Zellteilung in den postmitotischen Stadien, z. B. als organisierender Faktor bei der Umgestaltung oder Stabilisierung des Mikrotubuli-Cytoskeletts, spielt. Der γ-Tubulin-Gehalt in den Geweben der SR1-Pflanze zeigte über die Zellkultur hinaus, dass die Expression von α-Tubulin nach Einstellen der Teilungsaktivität kontinuierlich abnimmt. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass γ-Tubulin in älteren Blattgeweben zusätzliche Aufgaben übernehmen könnte, die nicht auf eine gleichzeitige Expression von α-Tubulin angewiesen sind. So kann beispielsweise eine Beteiligung von γ-Tubulin an der Stabilisierung der Mikrotubuli, und damit einhergehend eine Abnahme der dynamischen Instabilität dieser Filamente, eine denkbare Funktion des Proteins in expandierendem und voll expandiertem Gewebe sein. Die Aufgaben von γ-Tubulin in sehr altem Gewebe mit deutlichen Anzeichen der Seneszenz können allerdings nach dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig beantwortet werden und bedürfen weitergehenden Untersuchungen, da dadurch ein die Komplexität und die Dynamik des pflanzlichen Cytoskeletts geklärt werden kann.

The most important components of the cytoskeleton in plant cells are the actinfilaments and the microtubuli. The microtubuli plays an important role in the organization and the morphogenesis of plant cells. They are involved together with the cellulosefibrils in the shaping of the plant cell. They form certainly the preprophaseband, that the cell division level and the mitosespindle, which provides for the separation of the chromosomes, as well as for the asking mop loads, which forms the cell wall between the daughter cells. Further the microtubuli gives by interaction with the cellulose synthase complexes the direction to the cell expansion forwards (GRANGER and CYR, 2001; LLOYD and CHAN, 2002; BASKIN, 2002). The microtubuli is involved also in the stabilization of the cell form and in transportation processes. When a component of the Mikrotubuli organizing centers (MTOCs) became the γ-Tubulin identified, which is involved very probably to the nucleation of the microtubuli, by introducing the assembly of the αβ tubulindimeres to microtubuli. In animal cells in the meantime relatively much is well-known over the function of γ-Tubulin, particularly in the process of the cell division by intensive research, how e.g. the localization in centrosomes with its in pairs arranged centrioles, which represent the MTOCs. In plant cells so far only few functions of the protein are sufficiently clarified. The higher plants do not possess centrioles and no Centrosomen. Beyond the cell division there are hardly reference points over the presence or possible tasks of γ-Tubulin in expanding and fully expanded cell cultures and plant tissues. In this work the expression was measured over PCR and the measurement of the protein content by cytosceleton relevant proteins in the development stages of the cell suspension culture (BY-2) and by sheet stages of the tobacco plant (SR1) by Nicotiana tabacum. A primary goal was too received it a statement, in which extent γ-Tubulin in expanding and fully expanded cells is still expressed and whether and/or how a regularization (transcriptionel or posttranscriptionell) of the γ-Tubulins in the plant takes place. For the proof of the γ-Tubulins on the protein level a plant-specific γ-Tubulin antibody was too developed. With this antibody it concerned a polyclonal antibody, which is directed specifically against a sequence in vegetable γ-Tubulin. The antibody developed in the work showed specific signals against the vegetable JOSHI domain. Taken place the proof of γ-Tubulin on the protein level and the transcripts showed clear signals for γ-Tubulin into the oldest examined stages of the cell suspension culture (BY-2) and in fabrics of the sheet stages of the tobacco plant (SR1). It was present thus not only in meristematisch active cells and fabrics of Nicotiana tabacum, but also in not-mitotic cells and fabrics. Here a parallel development with relatively constant strong signals was to be observed over the phases of the cell division and the cell shaping away on both levels. After adjusting the division activity the content dropped on clearly mRNA. The concentration of the protein took temporally retarded off in the comparison to mRNA. These results with the cell suspension culture (BY-2) and tobacco plant (SR1) go with the possible nucleationfunction of the protein conformal. Were smaller however nevertheless clear signals with dying cells of the cell culture to prove and/or with expanding and fully expanded and seneszenten sheets of the tobacco plant (SR1). This permits the consequence that the proven is not posttranscriptionell adjusted mRNA by γ-Tubulin, but that the γ-Tubulin plays also an important role outside of the cell division in the post office-mitotic stages, e.g. as organizing factor with the transformation or stabilization of the microtubuli cytoskeleton. The γ-Tubulin-content in the fabrics of the SR1-Pflanze showed beyond the cell culture that the expression decreases from α-Tubulin to adjusting the division activity continuously. This result puts the assumption close that γ-Tubulin could transfer additional tasks, which are not dependent on a simultaneous Expression of α-Tubulin in older sheet fabrics. So for example a participation of γ-Tubulin in the stabilization of the microtubuli, and with it a decrease of the dynamic instability of these filaments, can be accompanying a conceivable function of the protein in expanding and fully expanded fabric. The tasks of γ-Tubulin in very old fabric with clear signs of the senescents cannot be answered and required however after the present conditions of the research clearly large investigations, since thereby the complexity and the dynamics of the vegetable cytoskeleton can be clarified.