Comparison of different techniques for mouse transgenesis

RESUMO: O uso de ratinhos transgénicos em neurociências aumentou consideravelmente nos últimos anos devido ao crescente interesse em compreender o cérebro e a necessidade de solucionar situações clínicas do foro neurológico e psiquiátrico. Para esse efeito, diferentes métodos de produção de animais transgénicos têm sido testados. O objectivo desta tese foi comparar métodos de integração aleatória de um transgene no genoma de ratinhos em termos de eficiência, estabilidade da integração do transgene, número de animais e de horas de trabalho necessárias para cada método. Assim, foi comparado o método mais utilizado - microinjecção pronuclear (PNMI) - com duas outras técnicas cujo desempenho foi considerado promissor – a transferência génica através dos testículos por electroporação e transfecção por lentivírus in vivo. As três técnicas foram realizadas usando um gene repórter sob o controlo de um promotor constitutivo, e depois reproduzidas usando um gene de interesse de modo a permitir obtenção de um animal capaz de ser usado em experimentação laboratorial. O transgene de interesse utilizado codifica uma proteína de fusão correspondendo a uma variante da rodopsina (channelrhodopsin) fundida à proteína enhanced yellow fluorescente protein ((EYFP) resultando num produto designado ChR2-EYFP. Este animal transgénico apresentaria expressão deste canal iónico apenas em células dopaminergicas, o que, com manipulação optogenética, tornaria possivel a activação especifica deste grupo de neurónios e, simultaneamente, a observação do impacto desta manipulação no comportamento num animal em livre movimento. Estas ferramentas são importantes na investigação básica em neurociências pois ajudam a esclarecer o papel de grupos específicos de neurónios e compreender doenças como a doença de Parkinson ou a esquizofrenia onde a função de certos tipos de neurónios de encontra alterada. Quando comparados os três métodos realizados verifica-se que usando um gene repórter PMNI resulta em 31,3% de, a de animais transgénicos obtidos, a electroporação de testículos em 0% e a injecção de lentivírus em 0%. Quando usado o gene de interesse, os resultados obtidos são, respectivamente, 18,8%, 63,9% e 0%.--------------ABSTRACT: The use of transgenic mice is increasing in all fields of research, particularly in neuroscience, due to the widespread need of animal models to solve neurological and psychiatric medical conditions. Different methodologies have been tested in the last decades in order to produce such transgenic animals. The ultimate goal of this thesis is to compare different methods of random integration of a transgene in the genome of mice in terms of efficiency, stability of the transgene integration, number of animals required and the labour intensity of each technique. We compared the most used method – pronuclear microinjection (PNMI) – with two other promising techniques – Testis Mediated Gene Transfer (TMGT) by electroporation and in vivo lentiviral transfection. The three techniques were performed using a reporter gene – green fluorescent protein (GFP), whose transcription was driven by the constitutive cytomegalovirus (CMV) promoter. These three techniques were later reproduced using the tyrosine hydroxylase promoter (TH) and the neuronal manipulator, channelrhodopsin-2 fused to the enhanced yellow fluorescent reporter protein (ChR2-EYFP). The transgenic animal we sough to produce would express the light driven channel only in dopaminergic cells, making possible to specifically activate this group of neurons, while simultaneously observe the behaviour in a freely moving animal. This is a very important tool in basic neuroscience research since it helps to clarify the role of specific groups of neurons, map circuits in the brain, and consequently understand neurological diseases such as Parkinson’s disease or schizophrenia, where the function of certain types of neurons is affected. When comparing the three methods, it was verified that using a reporter gene PNMI resulted in 31.3% of transgenic mice obtained, testis electroporation in 0% and lentiviral injection in 0%. When using the gene of interest, the results obtained were, respectively, 18.8%, 63.9% and 0%.

A entomoftorose nasal

São apresentados os dados clínico-patológicos de dois casos de entomoftorose nasal, nova doença humana causada por um ficomiceto - Entomophthora coronata. Os pacientes, uma menina e um homem, com 8 e 44 anos de idade respectivamente, apresentaram doença localizada, com nódulos no nariz e região paranasal, edema e deformação da face. O parasito foi isolado do primeiro caso, mas todas as tentativas para isolá-lo no segundo caso resultaram negativas. Histologicamente, havia reação granulomatosa, fibrose e edema, em torno de hifas não septadas, as quais exibiam envólucro eosinófilo amorfo em torno. Foram demonstrados anticorpos circulantes contra, as hifas do E. coronata no soro de um dos pacientes. O material eosinófilo em torno das hifas continha fibrina e material auto-fluorescente sob luz ultra-violeta, provavelmente lipofuscina, mas não foram demonstrados anticorpos ou antígenos nesta área. A apresentação destes casos, os primeiros a serem descritos no Brasil, é acompanhado, de uma revisão geral do assunto, pois tal poderá vir a ser de interesse para aqueles que estudam os problemas da patologia tropical em nosso meio.

Armazenamento de Medicamentos num Serviço Clínico. Normas e Sinalética de Segurança

1º Prémio no Encontro Histórias da Segurança do Doente

Freqüência das infecções oculares por clamídia nos portadores de conjuntivite, em clínica particular de Uberaba, MG

Setecentos e oitenta pacientes com recidivas clínicas de infecções conjuntivais ou queixas persistentes de prurido, ardor, dor, lacrimejamento e hiperemia, foram submetidos ao raspado conjuntival com citologia e pesquisa de inclusões. Destes 247(31,7%) apresentaram inclusões citoplasmáticas; 235 pacientes foram, também, submetidos a coloração com anticorpo monoclonal fluorescente (imunofluorescência direta - DFA) com 90 (38,3%) casos positivos. Discute-se também, a importância do quadro clinico e dos métodos laboratoriais (coloração com anticorpo monoclonal fluorescente e pesquisa de inclusões citoplasmáticas) no diagnóstico. Os pacientes fazem parte de clientela de clínica particular e tem nível sócio-econômico de médio a alto.

Nanoestruturas orgânicas anfifílicas: síntese e caraterização

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Caracterização preliminar da bioenergética do efluxo pelo sistema AcrAB-TolC EM Escherichia Coli

A resistência aos antibióticos em bactérias Gram-negativas pode ser aumentada pela extrusão de antibióticos através de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo é o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energética a força proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergética na actividade de efluxo de E. coli usando três estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um método fluorimétrico semi-automático no qual a fluorescência do fluorocromo brometo de etídeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medição em tempo real da actividade de efluxo e acumulação de fluorocromo (inibição do efluxo). A utilização de brometo de etídeo é particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescência no exterior da célula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este método é uma nova aplicação do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o cálculo da cinética de transporte reflectindo o balanço entre acumulação de substrato por difusão passiva através da membrana e a sua extrusão/efluxo, proporcionando uma detecção rápida e económica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulação e o efluxo do brometo de etídeo. De todos os inibidores de vias biossintéticas testados, o ortovanadato de sódio, foi o que demonstrou maior actividade inibitória, a qual é revertida na presença de GLU. Em conclusão, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende não só da fosforilação oxidativa por via da força proto-motriz mas também da energia proveniente da hidrólise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sódio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterização bioenergética da actividade de bombas de efluxo e permite a selecção de novos inibidores de bombas de efluxo em bactérias.

Produção de anticorpos para tratamento do cancro da mama

A terapia anti-cancro baseada em anticorpos monoclonais tem vindo a ser atractiva na medida em que os anticorpos têm a capacidade de reconhecer especificamente antigénios alvo associados a cancro e de serem reconhecidos por células do sistema imunitário. Um dos antigénios que tem vindo a ser estudado é o glicano sialil-Tn (STn), presente na maioria dos carcinomas humanos e aproximadamente em 30% dos casos de cancro da mama. O objectivo geral deste trabalho foi o desenvolvimento de novos anticorpos terapêuticos contra STn. Especificamente, foi estudada a imunogenicidade de diferentes antigénios baseados em STn na produção desses anticorpos. Através da análise dos soros, verificou-se uma resposta imune com produção de anticorpos pelos murganhos imunizados, em separado, com mucina1 decorada com STn, mucinas de origem animal STn+ e lisados celulares STn+. Contrariamente, a imunização com STn associado a treonina ou poliacrilamida não desencadeou nenhuma resposta imunológica. Assim, percebeu-se que o STn é muito pouco imunogénico, e que a imunogenicidade deste depende do seu acoplamento a proteínas (mucinas) e da densidade do glicano a decorar as mesmas. Os sobrenadantes da cultura dos hibridomas obtidos pela fusão celular foram analisados por citometria de fluxo. Embora, se esperasse obter hibridomas produtores de anticorpos anti-STn, isto não se verificou. Uma das hipóteses levantadas está relacionada com a tolerância imunológica induzida por este antigénio, tal como verificado anteriormente pelo nosso e outros grupos de investigação. Assim, novas imunizações estão a ser realizadas com alterações relevantes no protocolo. A segunda parte deste trabalho consistiu na criação (transdução lentiviral) e análise (citometria de fluxo e RT-PCR) da linha celular fluorescente MCF-7/GFP STn+, que permitirá analisar o mecanismo de acção dos anticorpos anti-STn futuramente produzidos. A realização deste trabalho permitiu optimizar diversas técnicas e passos-chave importantes para o desenvolvimento de anticorpos terapêuticos anti-STn para cancro da mama ou outros cancros que expressem STn.

Esfingídeos (Lepidoptera, Sphingidae) do município de Beruri, Amazonas, Brasil

Mariposas esfingídeas foram coletadas no Município de Beruri, região do baixo rio Purus, Estado do Amazonas, em três períodos 30/09-10/10/2002, 25-30/07/2003 e 29/11-08/12/2003. Foi utilizada uma lâmpada de luz mista de mercúrio de 250 W, sobre um lençol branco, em noites de coletas de 12 horas consecutivas. Foram coletados 295 exemplares, identificados em 46 espécies de 20 gêneros. A tribo Dilophonotini foi a mais representada (23 espécies), seguida por Sphingini (9 spp.), Macroglossini (6 spp.), Philampelini (4 spp.), Ambulycini (3 spp.) e Acherontiini (1 sp.). Todas as espécies foram registradas pela primeira vez para o Município de Beruri. São registrados os esfingídeos que são pragas e aqueles considerados pragas em potencial.

Cerambycidae (Coleoptera) coletados à luz a 45 metros de altura, no dossel da floresta amazônica, e a descrição de quatro espécies novas

É apresentada uma relação das 69 espécies de Cerambycidae coletados a 45 m numa torre metálica de 50 m que ultrapassa a maioria das copas das árvores, num platô de terra firme, na bacia do Rio Cueiras, Estação Experimental de Silvicultura Tropical, km 14 do núcleo ZF-2 em Manaus, Amazonas, Brasil. As coletas foram realizadas de janeiro a dezembro de 2004, durante três noites de transição lunar minguante/nova de cada mês, das 18 às 6 horas. Os insetos foram capturados em um lençol iluminado com lâmpada de 250 watts, luz mista de vapor de mecúrio e lâmpada de 20 watts BLB. Foram coletados Prioninae (12 espécies), Disteniinae (uma espécie), Cerambycinae (27 espécies) e Lamiinae (29 espécies). Novas espécies descritas: Physopleurus rafaeli, sp. nov. (Prioninae, Macrotomini); Oncideres tuberosa sp. nov. (Lamiinae, Onciderini), Plistonax rafaeli sp. nov. (Lamiinae, Acanthoderini) e Hemiloapis mena sp. nov. (Lamiinae, Hemilophini). São apresentadas notas em Oncideres phaetusa Dillon & Dillon, 1946, chave que modifica aquela para as espécies de Physopleurus Lacordaire, 1869 e chave para as espécies de Hemiloapis Galileo & Martins, 2004.

Registros de Mantodea (Insecta) coletados à luz no dossel da floresta, na torre do km 14 do núcleo ZF-2, Manaus, Brasil

Foram realizadas coletas mensais de insetos de janeiro a dezembro de 2004, durante três noites de transição lunar minguante/nova, das 18:00 às 06:00 horas. Os espécimes foram capturados em um lençol iluminado com lâmpada de 250 watts, luz mista de vapor de mercúrio e lâmpada de 20 watts black light (BL) e black light bulb (BLB). A armadilha foi montada a 45 metros de altura numa torre metálica de 50 metros, que ultrapassa a maioria das copas das árvores, num platô de terra firme, na bacia do rio Cuieiras, Manaus, Amazonas, Brasil. Foram coletados 23 espécies de Mantodea, sendo Chaeteessidae (1 espécie); Mantoididae (2); Mantidae (15); Thespidae (2) e Acanthopidae (3). Seis espécies são novas e serão descritas oportunamente nos seguintes gêneros: Cardioptera Burmeister, 1838, Phyllovates Kirby, 1904, Pseudovates Saussure, 1869, Stagmomantis Saussure, 1869, Stagmatoptera Burmeister, 1838 e Metilia Stal, 1877. Três espécies registradas para o Brasil sem uma região determinada estão sendo registradas para a Amazônia brasileira: Heterovates pardalina Saussure, 1872, Macromantis ovalifolia (Stoll, 1813) e Photina reticulata (Burmeister, 1838). Quatro registros são novos para o estado do Amazonas: Angela guianensis Rehn, 1906, Photina gracillis Giglio-Tos, 1915, Raptrix perspicua (Fabricius, 1787) e Vates festae Gigio-Tos, 1914. Os números de indivíduos, em cada coleta mensal, são apresentados para cada espécie.

Tabanidae (Diptera) no dossel da floresta amazônica atraídos por luz e descrição de machos de três espécies

Foram realizadas coletas de tabanídeos a 40 metros de altura, em uma torre metálica, na Estação Experimental de Silvicultura Tropical, Amazonas, Brasil. As coletas foram realizadas de janeiro a dezembro de 2004, durante três noites de transição lunar minguante/nova de cada mês, das 18 às 6 horas. As mutucas foram capturadas em um lençol iluminado com lâmpada de luz mista de vapor de mercúrio de 250 watts e lâmpada de 20 watts BLB. Foram coletados 216 espécimes, dos quais 135 machos e 81 fêmeas, alocados em 29 espécies. Três machos desconhecidos são descritos pela primeira vez: Catachlorops halteratus Kröber, 1931, Leucotabanus janinae Fairchild, 1970 e Leucotabanus pauculus Fairchild, 1951.

Fluorescence-based approaches towards the assessment of structural and functional alterations in lysosomes and vacuoles induced by lactoferrin and acetic acid

Dissertação de mestrado em Biofísica e Bionanossistemas

Development of folate-targeted liposomes for rheumatoid arthritis therapy

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (área de especialização em Biologia Celular e Saúde).

Protein-based nanodevices for therapeutic applications

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (área de especialização em Biologia Celular e Saúde).

Susceptibility of Candida biofilms to photodynamic treatment

Dissertação de mestrado em Bioengenharia