Plant rhizosphere specificity and variability in the insect and plant adhesins, Madl and Mad2, within the genus Metarhizium suggest plant adaptation as an evolutionary force

Metarhizium is a soil-inhabiting fungus currently used as a biological control agent against various insect species, and research efforts are typically focused on its ability to kill insects. In section 1, we tested the hypothesis that species of Metarhizium are not randomly distributed in soils but show plant rhizosphere-specific associations. Results indicated an association of three Metarhizium species (Metarhizium robertsii, M. brunneum and M. guizhouense) with the rhizosphere of certain types of plant species. M. robertsii was the only species that was found associated with grass roots, suggesting a possible exclusion of M. brunneum and M. guizhouense, which was supported by in vitro experiments with grass root exudate. M. guizhouense and M. brunneum only associated with wildflower rhizosphere when co-occurring with M. robertsii. With the exception of these co-occurrences, M. guizhouense was found to associate exclusively with the rhizosphere of tree species, while M. brunneum was found to associate exclusively with the rhizosphere of shrubs and trees. These associations demonstrate that different species of Metarhizium associate with specific plant types. In section 2, we explored the variation in the insect adhesin, Madl, and the plant adhesin, Mad2, in fourteen isolates of Metarhizium representing seven different species. Analysis of the transcriptional elements within the Mad2 promoter region revealed variable STRE, PDS, degenerative TATA box, and TATA box-like regions. Phylogenetic analysis of 5' EF-Ia, which is used for species identification, as well as Madl and Mad2 sequences demonstrated that the Mad2 phylogeny is more congruent with 5' EF-1a than Madl. This suggests Mad2 has diverged among Metarhizium lineages, contributing to clade- and species-specific variation. While other abiotic and biotic factors cannot be excluded in contributing to divergence, it appears that plant associations have been the driving factor causing divergence among Metarhizium species.

Pyocyanin (5-methyl-1-hydroxyphenazine) produced by Pseudomonas aeruginosa as antagonist to vibrios in aquaculture: overexpression, downstream process and toxicity

Pyocyanin is a versatile and multifunctional phenazine, widely used as a bio-control agent. Besides its toxicity in higher concentration, it has been applied as bio-control agents against many pathogens including the Vibrio spp. in aquaculture systems. The exact mechanism of the production of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa is well known, but the genetic modification of pyocyanin biosynthetic pathways in P. aeruginosa is not yet experimented to improve the yield of pyocyanin production. In this context, one of the aims of this work was to improve the yield of pyocyanin production in P. aeruginosa by way of increasing the copy number of pyocyanin pathway genes and their over expression. The specific aims of this work encompasses firstly, the identification of probiotic effect of P. aeruginosa isolated from various ecological niches, the overexpression of pyocyanin biosynthetic genes, development of an appropriate downstream process for large scale production of pyocyanin and its application in aquaculture industries. In addition, this work intends to examine the toxicity of pyocyanin on various developmental stages of tiger shrimp (Penaeus monodon), Artemia nauplii, microbial consortia of nitrifying bioreactors (Packed Bed Bioreactor, PBBR and Stringed Bed Suspended Bioreactor, SBSBR) and in vitro cell culture systems from invertebrates and vertebrates. The present study was undertaken with a vision to manage the pathogenic vibrios in aquaculture through eco-friendly and sustainable management strategies with the following objectives: Identification of Pseudomonas isolated from various ecological niches and its antagonism to pathogenic vibrios in aquaculture.,Saline dependent production of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa originated from different ecological niches and their selective application in aquaculture,Cloning and overexpression of Phz genes encoding phenazine biosynthetic pathway for the enhanced production of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa MCCB117,Development of an appropriate downstream process for large scale production of pyocyanin from PA-pUCP-Phz++; Structural elucidation and functional analysis of the purified compoundToxicity of pyocyanin on various biological systems.

The potential of combining Pasteuria penetrans and neem (Azadirachta indica) formulations as a management system for root-knot nematodes on tomato

Initial applications of 10(4) spores g(-1) of Pasteuria penetrans, and dried neem cake and leaves at 3 and 2% w:w, respectively, were applied to soil in pots. Juveniles of Meloidogyne javanica were added immediately to the pots (500, 5,000 or 10,000) before planting 6-week-old tomato seedlings. The tomatoes were sampled after 64 days; subsequently a second crop was grown for 59 days and a third crop for 67 days without further applications of P. penetrans and neem. There was significantly less root-galling in the P. penetrans combined with neem cake treatment at the end of the third crop and this treatment also had the greatest effect on the growth of the tomato plants. At the end of the third crop, 30% of the females were infected with P. penetrans in those treatments where spores had been applied at the start of the experiment. The effects of neem leaves and neem cake on the nematode population did not persist through the crop sequences but the potential for combining the amendments with a biological control agent such as P. penetrans is worthy of further evaluation.

Genotype and temperature influence pea aphid resistance to a fungal entomopathogen

The influence of temperature on life history traits of four Acyrthosiphon pisum clones was investigated, together with their resistance to one genotype of the fungal entomopathogen Erynia neoaphidis . There was no difference among aphid clones in development rate, but they did differ in fecundity. Both development rate and fecundity were influenced by temperature, but all clones showed similar responses to the changes in temperature (i.e. the interaction term was nonsignificant). However, there were significant differences among clones in susceptibility to the pathogen, and this was influenced by temperature. Furthermore, the clones differed in how temperature influenced susceptibility, with susceptibility rankings changing with temperature. Two clones showed changes in susceptibility which mirrored changes in the in vitro vegetative growth rate of E. neoaphidis at different temperatures, whereas two other clones differed considerably from this expected response. Such interactions between genotype and temperature may help maintain heritable variation in aphid susceptibility to fungal pathogen attack and have implications for our understanding of disease dynamics in natural populations. This study also highlights the difficulties of drawing conclusions about the efficacy of a biological control agent when only a restricted range of pest genotypes or environmental conditions are considered.

Caracterização de novos isolados de Bacillus thuringiensis para o controle de importantes insetos-praga da agricultura

A bactéria Bacillus thuringiensis Berliner produz um corpo de inclusão paraesporal (cristal) de natureza proteica, formado durante a esporulação, que atua de forma eficiente no controle de insetos-praga de culturas economicamente importantes. Esse cristal é constituído de proteínas Cry, que são codificadas pelos genes cry; um isolado pode ser caracterizado pelo conteúdo de genes cry que apresenta. Visando caracterizar novos isolados no combate de insetos-praga pertencentes às ordens Lepidoptera e Coleoptera, 76 isolados bacterianos foram analisados molecularmente e tiveram seu potencial de controle avaliado por meio de bioensaios com larvas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), Sphenophorus levis Vaurie e Tenebrio molitor Linnaeus. As análises moleculares indicaram 11 isolados (14,5% da coleção), contendo genes lepidóptero-específicos e 17 (22,37%) com genes coleóptero-específicos. As análises de patogenicidade revelaram dois isolados com alto potencial de controle para lagartas de S. frugiperda, um para larvas de S. levis e seis prejudiciais ao desenvolvimento das larvas de T. molitor. Esses isolados de B. thuringiensis podem ser promissores no controle biológico das referidas pragas.

Characterization and selection of Bacillus thuringiensis isolates effective against Sitophilus oryzae

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Resíduos e subprodutos agroindustriais e grãos como substratos para produção do fungo entomapatogênico Lecanicillium lecanii

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Aspectos biológicos de Cycloneda sanguínea (Coleóptera: Coccinellidae) alimentadas con pulgones criados en algodón transgénico Bollgard I

Cycloneda sanguinea is an important biological control agent of aphid cotton. The objective of this study was to evaluate the biological aspects of C. sanguinea fed with nymphs and adults of Aphis gossypii reared in DeltaOPAL and NuOPAL cultivars (Bollgard I). The experiment was conducted in the laboratory under controlled temperature (25 +/- 1 degrees C), humidity (70 +/- 10%) and photophase (12 hours). The experimental design was completely randomized, and treatments aphids fed on the two cultivars, and replicates 40 individuals. Each larva was individually until adult emergence of the predator in Petri dishes of 9 cm in diameter with moistened filter paper. For evaluation of individual adults were five couples newly emerged in plastic pots 12 cm in diameter and 9 cm tall, with filter paper for oviposition. The parameters evaluated were: duration and viability of the larval stage, pupal stage duration and survival, adult longevity, reproductive period, post-reproductive and total number of eggs per female. The duration of the larval stage of C. sanguinea was lower when fed aphids reared on the cultivar NuOPAL, while adult longevity and the reproductive period were higher. The female fertility and egg viability were also lower.

Integração da resistência de plantas e predação por Chrysoperla externa (Hagen) (Neuroptera: Chrysopidae) para o manejo de Schizaphis graminum (Rondani) (Hemiptera: Aphididae) em sorgo

A integração entre plantas resistentes e agentes de controle biológico pode ser uma alternativa viável para o manejo do pulgão-verde, Schizaphis graminum (Rondani), na cultura do sorgo. Experimentos foram conduzidos com a finalidade de avaliar o efeito de quatro genótipos de sorgo: GR 11111 e TX 430 x GR 111 (resistentes), GB 3B (moderadamente resistente), e BR 007B (suscetível), sobre o controle biológico do pulgão S. graminum realizado pelo predador Chrysoperla externa (Hagen). Para isso, avaliaram-se diferentes níveis de infestação de S. graminum, na presença e ausência do predador, em casa-de-vegetação e a viabilidade de controle de S. graminum no campo. O efeito do predador foi notado 25 dias após a infestação, proporcionando maior crescimento das plantas e menores danos. Os danos também foram menores nos genótipos resistentes e aumentaram com a elevação dos níveis de infestação, sendo menores na presença do predador C. externa. em condições de campo, a integração dos dois métodos de controle proporcionou 83% de redução de danos, quando se utilizou o genótipo resistente TX 430 x GR 111, que foi considerado o mais promissor dentre os estudados.

Estudo in vitro da habilidade predatória de monacrosporium robustum sobre heterodera glycines

O fungo nematófago Monacrosporium robustum foi detectado, isolado e identificado pela primeira vez de solos do Brasil, em maio de 1999, no Laboratório de Nematologia do Departamento de Fitossanidade da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Jaboticabal, São Paulo, tendo sido o potencial como agente de biocontrole do nematóide de cisto da soja, Heterodera glycines raça 3 observado ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) (Maia & Santos, 1999). Na presente pesquisa, detalhes das estruturas de captura, tamanho, forma e septação dos conídios, bem como nematóides capturados pelo fungo foram documentados. Monacrosporium robustum produz micélio hialino, e as estruturas de captura são constituídas por ramificações adesivas, na forma de protuberâncias verticais que surgem das hifas, medindo, em média, 10 µm de comprimento e 5 µm de diâmetro. Uma substância gelatinosa desprende- se dessas estruturas, ao contato com o nematóide, aprisionando-o. Os conídios do fungo são hialinos, fusóides com dois ou quatro septos, às vezes, cinco. Conídios jovens são asseptados e piriformes. Sob condições de laboratório, esse fungo predou 100% dos ovos e dos juvenis de segundo estádio de H. glycines e formas ativas de Panagrellus sp., no período de 72 h da exposição desses nematóides ao fungo.

Dinâmica populacional do psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei (Moore, 1964) (Hemiptera: Psyllidae) e de seu parasitóide Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera: Encyrtidae) em floresta de Eucalyptus camaldulensis

O psilídeo-de-concha, Glycaspis brimblecombei, é uma praga exótica específica de Eucalyptus, que causa desfolha, secamento de ponteiros e ramos, podendo levar as árvores à morte. O parasitóide Psyllaephagus bliteus é indicado como principal agente no controle biológico desta praga. Portanto, o monitoramento adequado de as ambas espécies por um método eficiente de amostragem facilitaria o manejo para uma futura tomada de decisão. Devido à falta de informações referentes ao seu comportamento em plantações extensivas de eucalipto no Brasil, este trabalho teve como objetivo estudar as populações de G. brimblecombei e de P. bliteus em florestas de Eucalyptus camaldulensis, utilizando armadilhas amarelas para determinação de sua flutuação populacional e correlacionado-as com variáveis meteorológicas (temperatura e precipitação). A determinação da flutuação populacional (53 pontos amostrais) foi realizada em talhão de 19ha com E. camaldulensis em Luíz Antônio, SP, em 10avaliações quinzenais, entre janeiro e junho de 2005. As populações de ambas as espécies apresentaram correlação inversamente proporcional em função da temperatura e não há correlação com a precipitação no período avaliado.

Caracterização da Estrutura Espacial do Psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei (Hemiptera: Psyllidae) e de seu Parasitóide Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera: Encyrtidae) em Floresta de Eucalyptus camaldulensis

Os psilídeos são um grupo de pragas amplamente distribuídas, causando perdas consideráveis em sistemas agrícolas e florestais. A recente descoberta da ocorrência do psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei Moore (Hemiptera: Psyllidae), no Brasil tornou-se um problema de grande importância, por ser específico de Eucalyptus. O parasitóide Psyllaephagus bliteus Riek (Hymenoptera: Encyrtidae) é indicado como principal agente no controle biológico desta praga. Portanto, para o monitoramento adequado de ambas espécies é necessário um método eficiente de amostragem. Devido a falta de informações referentes ao seu comportamento em plantações extensivas de eucalipto, realizou-se este trabalho, para verificar a distribuição espacial de G. brimblecombei e de seu parasitóide P. bliteus, através de armadilhas adesivas em floresta de E. camaldulensis. Para determinação da distribuição espacial foram utilizadas 53 armadilhas amarelas distribuídas uniformemente no talhão, formando uma grade amostral espaçadas de 50 x 36 m, à altura aproximada de 1,80 m do solo. Cada armadilha foi presa com auxílio de um arame plastificado em um fio estendido entre duas árvores em um talhão de 19 ha com E. camaldulensis em Luiz Antônio, SP. Foram realizadas dez avaliações, entre janeiro e junho de 2005. Após a coleta as armadilhas foram levadas ao laboratório para ser feita à triagem e contagem do número total de adultos de G. brimblecombei e de P. bliteus, nas duas faces das armadilhas. Concluiu-se que as populações de ambas espécies apresentaram distribuição espacial agregada, no período avaliado.

Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: influências do Isolado, da Cinética e do Modo de operação

Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process.

Caffeine effect on mortality and oviposition in successive generations of Aedes aegypti

OBJETIVO: Experimentos anteriores mostraram que a cafeína bloqueia o desenvolvimento de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) na fase larval, inibindo conseqüentemente a produção de adultos. O objetivo do estudo foi obter dados que pudessem sugerir desenvolvimento de resistência dos mosquitos à cafeína. MÉTODOS: Foi avaliada a produção de adultos em gerações sucessivas, a partir de ovos produzidos na geração anterior e a taxa de oviposição em cada geração, utilizando meios contendo cafeína a 200 e 500 µg/ml e água de torneira proveniente de poço artesiano como controle. Os experimentos foram conduzidos em São José do Rio Preto, entre 2002 e 2005. Nos testes estatísticos foram utilizados a análise exploratória de dados e algoritmos de alisamento. RESULTADOS: Ocorreu redução crescente da produção de adultos, nas duas concentrações, ao longo das gerações, mas apenas no experimento a 200 µg/ml os dados foram estatisticamente significantes. Quanto à oviposição, a análise dos números mostra redução crescente e acentuada na média de ovos por fêmea, no experimento tratado. CONCLUSÕES: Não houve evidência de resistência ao longo das gerações devido ao tratamento com cafeína. Os resultados encontrados podem reforçar a indicação da cafeína como uma alternativa aos principais agentes de controle do Ae. aegypti atualmente usados, contra os quais os mosquitos têm desenvolvido resistência.

Effects of a lectin-like protein isolated from Acacia farnesiana seeds on phytopathogenic bacterial strains and root-knot nematode

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)