Estratégias de Produção in vitro de Bioinseticida Viral: influências do Isolado, da Cinética e do Modo de operação

Societal concerns about environmental sustainability has lead to the development of ecologically-friendly alternatives to chemical insecticides for crop protection. One such alternative is biological pest control. In particular, baculoviruses are well suited as insect biopesticides due to their narrow host specificity and relative ease of propagation. In Brazil, the baculovirus Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is the main biological control agent employed for the soybean pest, Anticarsia gemmatalis. This baculovirus biopesticide is currently produced using caterpillars, but increasing market demand for the product has encouraged the development of an in vitro manufacturing process, which can be scaled up to much higher virus productivities. In this study, three wild-type AgMNPV isolates (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 and AgMNPV-MP5) and a recombinant form (vAgEGT-LacZ) were characterised in terms of occlusion body (OB) production and infection kinetics, to enable future optimisation of the in vitro production process. These viruses were propagated using a Spodoptera frugiperda (IPLB-SF21) insect cell line grown in shaker-flask batch cultures. Among the virus isolates tested, AgMNPV-MP5 was found to be the best producer, yielding (5.3±0.85)x108 OB/mL after 8 days post infection. The characterisation of vAgEGT-LacZ propagation in suspension cell cultures has not been previously reported in the literature; hence it became the main focus for this thesis. In particular, it was carried out a study on the effect of the multiplicity of infection (MOI) on OB production. Five successive batches were performed getting a final production (8.9±1.42)x1014 occlusion bodies, considering that production is related for a bioreactor with final volume of 10m3. A low MOI associated with a fed-batch process for vAgEGT-LacZ production was found to support a 3-fold higher OB yield when compared to the default batch process (1.8x107 and 5.3x107 OB/mL, respectively). This yield is competitive with regards to the production process.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A preocupação da sociedade com o meio ambiente tem levado a buscar alternativas de substituição dos inseticidas químicos por outros produtos menos agressivos ao homem e ao ambiente. Assim, a utilização de controle biológico contra pragas é altamente desejável, pois reduz os riscos ambientais e públicos da utilização de produtos químicos convencionais. Em particular, os vírus do tipo baculovírus são uma grande alternativa devido à especificidade oferecida aos seus hospedeiros e a sua forma de propagação. No Brasil, o baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é o principal agente de controle biológico da praga da soja Anticarsia gemmatalis. A crescente demanda deste bioinseticida tem estimulado o interesse no desenvolvimento de processos com base na produção in vitro de baculovírus. Deste modo, poderá aumentar a oferta de vírus, suprindo a necessidade do mercado deste bioinseticida para o controle de A. gemmatalis. Neste trabalho, estratégias de produção in vitro do baculovírus selvagem AgMNPV e do seu recombinante vAgEGTΔ-LacZ, como influência do isolado, da cinética e do modo de operação, foram analisadas como alternativa para futura ampliação de escala na produção deste bioinseticida viral. A produção em batelada de três isolados selvagens do baculovírus AgMNPV (AgMNPV-2D, AgMNPV-MP2 e AgMNPV-MP5) utilizando o cultivo em shaker, foi realizada com a finalidade de selecionar o melhor produtor de corpos de oclusão a partir das infecções em células de inseto Spodoptera frugiperda, linhagem IPLB-SF21 para avaliação comparativa com recombinante vAgEGTΔ-LacZ. A seleção identificou o isolado AgMNPVMP5 como melhor produtor de corpos de oclusão de (5,30±0,85) x108 OB/mL em 8 dias de infecção. A produção in vitro do vAgEGTΔ-LacZ foi foco principal deste trabalho, pois não há, na literatura, a produção deste recombinante em sistemas de cultivo em suspensão. Foi realizado estudo da multiplicidade de infecção para identificar a quantidade de inóculo viral para o cultivo. A partir daí, foram realizadas cinco bateladas sucessivas obtendo-se (8,9±1,42)x1014 corpos de oclusão para um volume final de 10m³ de suspensão de células infectadas. O aumento da produção de corpos de oclusão obtidos a partir do vAgEGTΔ-LacZ foi analisado utilizando a estratégia de cultivo em batelada alimentada utilizando baixa multiplicidade de infecção. Esta estratégia permitiu aumento de três vezes na produção de corpos de oclusão quando comparada à produção em cultivos em batelada (5,3x107 e 1,8x107 OB/mL, respectivamente). E ainda, o baculovírus recombinante vAgEGTΔ-LacZ mostrou-se competitivo em relação ao baculovírus selvagem AgMNPV-MP5