Estudo histológico e histoquímico do aparelho excretor de Glossoscolex paulistus Michaelsen, 1926 (Oligochaeta, Glossoscolecidae)

The present study reveals that the excretory system of Glossoscolex paulistus is formed by open holonephridia (exonephridia). It is noticed that different zones are recognized in the nephridial canal, with defined histological and histochemical characteristics: 1) primary canal; 2) lobed canal; 3) first rounded segment; 4) afferent thin segment; 5) efferent thin segment; 6) second rounded segment; 7) ciliary tube; 8) clear canal; 9) pigmented canal; 10) intermediate canal; 11) bladder; 12) terminal canal; 13) nephridiopore. All these regions are intercellular and cilia are found in regions 1, 2, 3, 6, 7 and 13. The connections between afferent and efferent capillary of the vascular supply of the nephridium are made of capillary loops and dilatations which we call glomeruli in this paper. Filtering functions are suggested for the glomerulus. The response of the lobed canal and the first and second rounded segments to Gomori's reaction is strongly positive and this is found to coincide with the largest concentration of glomeruli in the main loops 1 and II, that suggests a higher filtration capacity for the canal and segments.

Morphological and Histochemical Characterization of Gill Filaments of the Brazilian Endemic Bivalve Diplodon expansus (Kuster, 1856) (Mollusca, Bivalvia, Hyriidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Scanning electron microscopy study of the choroid plexus in the monkey (Cebus apella apella)

The cells of the choroid plexus of the lateral ventricles of the monkey Cebus apella apella were examined through scanning electron microscopy at contributing to the description of such structures in primates. The animals were anesthetized previously with 3% hypnol intraperitoneally and after perfusion with 2.5% glutaraldehyde, samples of the choroid plexus were collected after exhibition of the central portion and inferior horn of the lateral ventricles. The ventricular surface of those cells presents globose form as well as fine interlaced protrusions named microvilli. Among those, it is observed the presence of some cilia. Resting on the choroid epithelial cells there is a variable number of free cells, with fine prolongations which extend from them. They are probably macrophages and have been compared to Kolmer cells or epiplexus cells, located on choroid epithelium. The choroid plexus of the encephalic lateral ventricles of the monkey Cebus apella apella at scanning electron microscopy is similar to that of other primates, as well as to that of other species of mammals mainly cats and rats, and also humans.

The ultrastructure of the guinea pig rete testis

The chambers of the rete testis (RT) of guinea pig are lined by a simple epithelium, whose cells are squamous, cubical and columnar in shape. The epithelial cells with distinct shapes were counted and the quantitative analysis of the number of these cells showed relative predominance of cubical cells. The ultrastructural observations showed predominance of membrane interdigitations among the epithelial cells. These cells present common cytoplasmic organelles. The Golgi complex polarity is typical with observation of electronlucent vesicles on the Golgi cis face closely related to rough endoplasmic reticulum (ER) lamellae, mitochondria and large number of polysomes on the Golgi trans face. These related structures present in Golgi area of RT cells suggest secretory activity which maybe occurs in the RT epithelium. Endocytotic process also occurs in the RT and this function probably concerns the uptake of substances and resorption of seminiferous fluid. Apical cilia present in RT epithelium cells are related with fluid transport and perhaps with chemoreception. Presence of spermatozoa portions enclosed into the cytoplasm of some epithelium cells has been refferred to as spermatophagy. The RT complex is mainly supported by loose connective tissue, with collagen fibres and some Leydig cells. Leydig cells are adjacent to the network channels of the septal part of the RT and apparently are able to secrete inside the RT lumen.

Ontogenia do sistema sensorial de pacu Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) (Characidae: Serrasalmidae)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Imunolocalização de hormônios em células endócrinas do esôfago, estômago e duodeno do muçuã Kinosternon scorpioides (Kinosternidae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Centriole behaviour during meiosis of male germ cells of Dermatobia hominis (Diptera:Cuterebridae)

During the meiotic division of Dermatobia hominis spermatogenesis, the centrioles duplicate only in prophase I, giving rise to short cilia which are exposed on the cellular surface. In metaphase I they are internalized and distributed to the daughter cells. Consequently, the secondary spermatocytes have two centrioles which repeat the cycle of cilia externalization followed by internalization. The spermatids receive only one centriole, which changes into a basal body and originates a flagellum. This centriole behaviour seems to be a general feature in insect male germ cell meiosis.

Burrow ventilation and associated porewater irrigation by the polychaete Marenzelleria viridis

Burrow ventilation of benthic infauna generates water currents that irrigate the interstices of the sediments surrounding the burrow walls. Such activities have associated effects on biogeochemical processes affecting ultimately important ecosystem processes. In this study, the ventilation and irrigation behavior of Marenzelleria viridis, an invasive polychaete species in Europe, was analyzed using different approaches. M. viridis showed to perform two types of ventilation: (1) muscular pumping of water out of the burrow and (2) cilia pumping of water into the burrow. Flowmeter measurements presented muscular pumping in time averaged rates of 0.15 ml min(-1). Oxygen needle electrodes positioned above the burrow openings revealed that muscular undulation of the worm body pumps anoxic water out of the burrow. On the other hand, microscope observations of the animal showed that ventilation of oxygen-rich water in the burrow occurs by ciliary action. The volume of water irrigated by M. viridis appears to vary linearly within the first 24 h incubation, with rates ranging from 0.003 to 0.01 ml min(-1). From those rates we could estimate that the time averaged rate of cilia ventilation should be about 0.16 ml min(-1). Since the cilia pumping into the burrow occurs in periods of 24 +/- 12 min and at 50-70% of the measured time, considerable amounts of water from deeper sediments may percolate upwards to the sediment surface. This water is rich in reduced compounds and nutrients and may have important associated ecological implications in the ecosystem (e.g. affecting redox conditions, organic matter degradation, benthic recruitment and primary production). (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Redescription of Licnophora chattoni Villeneuve-Brachon, 1939 (Ciliophora, Spirotrichea), associated with Zyzzyzus warreni Calder, 1988 (Cnidaria, Hydrozoa)

Licnophora chattoni, found in association with Zyzzyzus warreni, a tubulariid hydroid epizoic in sponges from Sao Sebastiao (SP, Brazil), is redescribed and illustrated using light and electron microscopy. The ciliate has a flexible, transparent body formed by an oval anterior region linked to the posterior basal disc via a flexible neck region. Numerous cortical granules are observed scattered throughout the body and densely packed along the neck. The adoral zone is formed by about 81 external and 24 infundibular paramembranelles. The paroral membrane, formed by a row of long cilia arranged in monolcinetids, extends through a groove in the body to the adhesive disc. Two dorsal kinetids are present along the right body margin and around the neck. The adhesive disc (18 mu m in diameter) lacks cilia in the area above the velum. The velum covers a row of dikinetids bearing long cilia and four dikineties, two or three of which are interrupted on the ventral surface. Nine to twelve macronuclear nodules connected by isthmuses are distributed in the cytoplasm, plus two nodules located in the adhesive disc and between those there is an ovate micronucleus. (C) 2011 Published by Elsevier GmbH.

Influence of treatment with intranasal corticosteroids on the nasal mucosa, weight, and corticosteroid concentration in rats

Background: The effect of intranasal corticosteroids on the nasal epithelium mucosa is an important parameter of treatment safety. This study was designed to examine whether treatment with topical corticosteroids in patients with allergic rhinitis causes atrophic nasal mucosal changes, when compared with systemic corticosteroids, in rats. Methods: Male Wistar rats were treated daily during 7 weeks with topical administration with 10 microliters of normal saline (control group), 10 microliters of mometasone furoate group, 10 microliters of triamcinolone acetonide (T group), and 8 mg/kg of daily subcutaneous injections of methylprednisolone sodium succinate (MP group). Body weight was evaluated weekly. At the end of the treatment, rats were killed by decapitation to collect blood for determination of corticosterone levels and nasal cavities were prepared for histological descriptive analyses. Results: Treatment with T and MP decreased body weight. Plasma corticosterone concentration was significantly reduced by MP treatment and presented a clear tendency to decrease after T treatment. Histological changes observed in group T included ripples, cell vacuolization, increase in the number of nuclei, and decrease in the number of cilia in the epithelial cells. Conclusion: Growth and corticosterone concentration were impaired by T and MP at the same proportion, suggesting a role of this hormone in body gain. With the exception of T, intranasal or systemic treatment with the corticosteroids evaluated in this study did not affect nasal mucosa. (Am J Rhinol Allergy 26, e46-e49, 2012; doi: 10.2500/ajra.2012.26.3702)

Molekulare Charakterisierung der Centrin-Isoformen in der Retina von Säugetieren

Centrine sind Mitglieder einer hoch konservierten Überfamilie von Ca2+-bindenden Proteinen mit EF-Hand Motiven. Bislang sind vier Centrin-Isoformen bei Säugern beschrieben worden, die in diversen Zellen in der Regel mit Centriolen von Centrosomen oder Centrosomen-verwandten Strukturen assoziiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die vier Centrin-Isoformen bezüglich der Expression in verschiedenen Geweben untersucht. Dabei lag der Hauptfokus auf Untersuchungen der Centrine in den Photorezeptorzellen der Retina. Analysen auf subzellulärer Ebene brachten Klarheit über die differenzielle Lokalisation der verschiedenen Isoformen in der Retina. Mit Hilfe von verschiedenen Methoden konnten Wechselwirkungspartner in der Retina identifiziert werden, die eine Rolle in der visuellen Signaltransduktionskaskade spielen. Dabei könnten Centrine einem Regelmechanismus angehören, der wichtige Translokationsprozesse dieser Proteine regelt. In den Photorezeptorzellen der Säugetierretina werden die vier Isoformen exprimiert, die in den Strukturen des Cilienapparates differenziell lokalisiert sind. Dabei beschränkt sich ihre Lokalisation entweder auf den Basalkörper (Centrin 4), auf das Verbindungscilium (Centrin 1) oder sie sind in beiden Strukturen zu finden (Centrin 2 und 3). In den nicht- Photorezeptorzellen der Retina sind die Isoformen Centrin 2 und 3 zudem an den Centriolen der Centrosomen lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass alle Centrin-Isoformen in ein und derselben Zelle, der Photorezeptorzelle, koexprimiert werden und dabei subzellulär kolokalisiert sind. Im Weiteren konnte die ubiquitäre Expression von Centrin 2 und 3 in allen untersuchten Geweben an Centrosomen bestätigt werden. Centrin 1 und 4 hingegen werden nur in Geweben mit Cilien-tragenden Zellen exprimiert. Die Funktion der Centrine wird nicht nur durch Bindung von Ca2+, sondern auch durch Phosphorylierungen reguliert. Alle Sequenzen der Centrine weisen diverse mögliche Phosphorylierungsstellen für unterschiedliche Proteinkinasen auf. Die Ergebnisse aller durchgeführten in vitro und ex vivo Phosphorylierungs „Assays“ zeigen eine licht-abhängige Phosphorylierung der Centrin-Isoformen in der Retina. Dabei war in der dunkel-adaptierten Retina die Phosphorylierung vor allem von Centrin 1 und 2 erhöht. Weiterführende Experimente mit Kinase-Inhibitoren wiesen darauf hin, dass vor allem die Proteinkinase CKII eine bedeutende Rolle bei der Centrin-Phosphorylierung in der Retina einnimmt. Centrine sind die ersten Cytoskelettkomponenten, deren Phosphorylierungsgrad lichtabhängig moduliert wird. Diese Ergebnisse weisen auf einen Signalweg, der zwischen der visuellen Signaltransduktionskaskade und der Regulation der Centrin-Aktivität vermittelt, hin. Bei der Suche nach Centrin-Bindungspartnern gelang mit Hilfe von Centrin 1 Blot „Overlay Assays“ der Durchbruch. Der neuartige Ansatz zeigte, dass ausschließlich Ca2+-aktiviertes Centrin 1 mit Proteinen aus der Retina interagierte. Nach der Identifikation eines 37 kDa-Proteins als die β-Untereinheit des visuellen G-Proteins Transducin wurden die Untersuchungen auf diesen Interaktionspartner fokussiert. Die Ergebnisse der hier durchgeführten biochemischen und biophysikalischen Protein-Protein Interaktionsexperimente zeigen insgesamt folgendes: ⇒ Alle vier Centrine interagieren mit Transducin, wobei Centrin 3 die geringste Affinität zu Transducin hat. ⇒ Die Assemblierung der Centrin•G-Protein-Komplexe ist strikt Ca2+-abhängig. ⇒ Die Centrine binden sowohl an das isolierte Gtβγ-Heterodimer als auch an den heterotrimeren Gt-holo-Proteinkomplex, nicht aber an Gtα. Die quantitativen immunoelektronenmikroskopischen Analysen zeigen im Weiteren, dass sich die Komplexe aus Transducin und Centrin 1 bis 3 wahrscheinlich in einer Subdomäne des Verbindungsciliums der Photorezeptorzellen ausbilden. Dabei dürfte die Ausbildung der Komplexe an der Regulation der lichtinduzierten Translokation von Transducin zwischen Innen- und Außensegment der Photorezeptorzellen beteiligt sein. Dieser Translokationsmechanismus wird als ein wichtiger Bestandteil der Langzeitadaption der Signaltransduktionskaskade der Säugerretina diskutiert. Der neuartige Regelmechanismus der molekularen Translokationen, in dem Centrine involviert sind, ist außergewöhnlich und dürfte über die speziellen Photorezeptorzellen hinaus von weit reichender Bedeutung sein.

Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn

Intraflagellar transport in the developing and mature vertebrate retina

Intraflagellar transport (IFT) is required for the assembly and maintenance of cilia. In this study we analyzed the subcellular localization of IFT proteins in retinal cells by correlative high-resolution immunofluorescence and immunoelectron microscopy. The rod photoreceptor cell was used as a model system to analyze protein distribution in cilia. To date the expression of IFT proteins has been described in the ciliary region without deciphering the precise spatial and temporal subcellular localization of IFT proteins, which was the focus of my work. rnThe establishment of the pre-embedding immunoelectron method was an important first step for the present doctoral thesis. Results of this work reveal the differential localization of IFT20, IFT52, IFT57, IFT88, IFT140 in sub-ciliary compartments and also their presence in non-ciliary compartments of retinal photoreceptor cells. Furthermore, the localization of IFT20, IFT52 and IFT57 in dendritic processes of non-ciliated neurons indicates that IFT protein complexes also operate in non-ciliated cells and may participate in intracellular vesicle trafficking in eukaryotic cells in general.rnIn addition, we have investigated the involvement of IFT proteins in the ciliogenesis of vertebrate photoreceptor cilia. Electron microscopy analyses revealed six morphologically distinct stages. The first stages are characterized by electron dense centriolar satellites and a ciliary vesicle, while the formation of a ciliary shaft and of the light sensitive outer segment disks are features of the later stages. IFT proteins were expressed during all stages of photoreceptor cell development and found to be associated with the ciliary apparatus. In addition to the centriole and basal body IFT proteins are present in the photoreceptor cytoplasm, associated with centriolar satellites, post-Golgi vesicles and with the ciliary vesicle. Therewith the data provide an evidence for the involvement of IFT proteins during ciliogenesis, including the formation of the ciliary vesicle and the elongation of the primary cilium of photoreceptor cells. Moreover, the cytoplasmic localization of IFT proteins in the absence of a ciliary shaft in early stages of ciliogenesis indicates roles of IFT proteins beyond their well-established function for IFT in mature cilia and flagella. rn

VHL-gene deletion in single renal tubular epithelial cells and renal tubular cysts: further evidence for a cyst-dependent progression pathway of clear cell renal carcinoma in von Hippel-Lindau disease

Inheritance of a mutant allele of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene predisposes affected individuals to develop renal cysts and clear cell renal cell carcinoma. Von Hippel-Lindau gene inactivation in single renal tubular cells has indirectly been showed by immunohistochemical staining for the hypoxia-inducible factor alpha target gene product carbonic anhydrase IX. In this study we were able to show von Hippel-Lindau gene deletion in carbonic anhydrase IX positive nonneoplastic renal tubular cells, in epithelial cells lining renal cysts and in a clear cell renal cell carcinoma of a von Hippel-Lindau patient. This was carried out by means of laser confocal microscopy and immunohistochemistry in combination with fluorescence in situ hybridization. Carbonic anhydrase IX negative normal renal tubular cells carried no von Hippel-Lindau gene deletion. Furthermore, recent studies have indicated that the von Hippel-Lindau gene product is necessary for the maintenance of primary cilia stability in renal epithelial cells and that disruption of the cilia structure by von Hippel-Lindau gene inactivation induces renal cyst formation. In our study, we show a significant shortening of primary cilia in epithelial cells lining renal cysts, whereas, single tubular cells with a von Hippel-Lindau gene deletion display to a far lesser extent signs of cilia shortening. Our in vivo results support a model in which renal cysts represent precursor lesions for clear cell renal cell carcinoma and arise from single renal tubular epithelial cells owing to von Hippel-Lindau gene deletion.