Caracterização funcional das aquaporinas-3 e 7 de mamífero por expressão heteróloga em leveduras

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica Estrutural e Funcional

Characterization and regulation of a bacterial sugar phosphatase of the HAD superfamily, AraL, from Bacillus subtilis.

AraL from Bacillus subtilis is a member of the ubiquitous haloalkanoate dehalogenase, HAD, superfamily. The araL gene has been cloned, over-expressed in Escherichia coli and its product purified to homogeneity. The enzyme displays phosphatase activity, which is optimal at neutral pH (7.0) and 65 °C. Substrate screening and kinetic analysis showed AraL to have low specificity and catalytic activity towards several sugar phosphates, which are metabolic intermediates of the glycolytic and pentose phosphate pathways. Based on substrate specificity and gene context within the arabinose metabolic operon, a putative physiological role of AraL in detoxification of accidental accumulation of phosphorylated metabolites has been proposed. The ability of AraL to catabolise several related secondary metabolites requires regulation at the genetic level. Here, by site- directed mutagenesis, we show that AraL production is regulated by a structure in the translation initiation region of the mRNA, which most probably blocks access to the ribosome-binding site, preventing protein synthesis. Members of HAD subfamily IIA and IIB are characterised by a broad-range and overlapping specificity that anticipated the need for regulation at the genetic level. In this study we provide evidence for the existence of a genetic regulatory mechanism controlling AraL production.

Detection of human herpesvirus-7 by qualitative nested-PCR: comparison between healthy individuals and liver transplant recipients

Diagnosis of human herpesvirus-7 active infection in transplant patients has proved difficult, because this virus is ubiquitous and can cause persistent infections in the host. The significance of viral DNA detected in leukocytes by PCR is unclear and cross-reaction in serological tests may occur. This study aimed to evaluate nested-PCR to detect human herpesvirus-7 active infection in liver transplant recipients compared to healthy individuals. human herpesvirus-7 nested-PCR was performed on leukocytes and sera of 53 healthy volunteers and sera of 29 liver transplant recipients. In healthy volunteers, human herpesvirus-7 was detected in 28.3% of leukocytes and 0% of serum. human herpesvirus-7 was detected in sera of 48.2% of the liver transplant recipients. Nested-PCR on DNA extracted from leukocytes detected latent infection and the study suggests that nested-PCR performed on serum could be useful to detect human herpesvirus-7 active infection in liver transplant recipients.

Pesquisa de assinaturas de selecção de malária na região do gene humano TPI (triosefosfato isomerase)

A malária continua a ser a maior causa de doença e mortalidade no Mundo, sobretudo no continente Africano. Das cinco espécies do parasita causador de malária em humanos, Plasmodium falciparum é a mais letal. Em termos evolutivos a malária é um fenómeno recente com cerca de 10 000 anos, período onde tem atuado como importante pressão seletiva no genoma humano, contribuindo para a seleção de inúmeros polimorfismos que propiciam maior resistência ao protozoário parasita. Apesar da interação entre o parasita e o hospedeiro ser foco de inúmeros estudos, é bastante complexa e ainda está longe de ser totalmente compreendida, nomeadamente os fatores de suscetibilidade/resistência à infeção ou à doença. Este estudo teve como principal objetivo contribuir para o estudo dos polimorfismos eritrocitários associados à proteção contra a infeção malárica grave, centrando-se no gene TPI que codifica uma enzima glicolítica. Foi selecionada uma amostra populacional Africana (Moçambique) agrupada de acordo com a gravidade da doença (grupos clínicos). Fez-se o rastreio dos exões do gene TPI por SSCP, na busca de alterações no padrão de migração dos produtos amplificados, indiciadores de alterações na sequência nucleotídica que pudessem ser assinaturas de eventuais efeitos evolutivos exercidos pela malária; caracterizaram-se as variantes do promotor do gene TPI: -5A>G, -8G>A e -24T>G; e analisou-se o polimorfismo intrónico 2262 situado no intrão 5. Esta análise permitiu identificar o polimorfismo -8G>A como possível marcador associado à proteção contra a malária, observando-se diferenças estatisticamente significativas entre doentes com malária grave e não-grave [P = 0,032; OR = 0,230 (CI95%: 0,049-1,081)], quando associado ao haplótipo -5G/-8A/2262G. Através de um estudo de microssatélites nas regiões adjacentes ao gene TPI, estimou-se a antiguidade dos polimorfismos -5G>A e -8G>A, tendo-se obtido a idade de ~20 mil anos e ~14 mil anos, respetivamente. Ao nível bioquímico, o polimorfismo -8G>A poderá estar associado à acumulação celular de metilglioxal citotóxico, um potente inibidor da proliferação parasitária.

Aplicação de métodos moleculares ao diagnóstico de Giardia lamblia e de Entamoeba spp.

Entamoeba histolytica e Giardia lamblia são protozoários com distribuição mundial que frequentemente infectam o Homem, sendo causadores de elevada morbilidade associada com quadros de diarreia. Este estudo consistiu na utilização de métodos moleculares na detecção e identificação destes parasitas em amostras de fezes recebidas no Laboratório de Patologia Tropical do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (Lisboa, Portugal), no período decorrente entre Setembro de 2007 e Agosto de 2009. . Foi igualmente avaliada a eficácia e custo-benefício de um método alternativo de conservação para material biológico fecal – o papel de filtro, para subsequente extracção de DNA. Foram analisadas microscopicamente 80 amostras, 23,8 % (19/80) das quais positivas para Giardia e 27,5% (22/80) positivas para Entamoeba spp.. Através do método molecular da PCR, amplificou-se com sucesso DNA de Giardia para o gene ssurRNA em 94,7% (18/19) das amostras microscopicamente positivas. No que se refere às amostras positivas por exame microscópico para Entamoeba spp foi detectada E. dispar em 50,0% (11/22) das amostras após amplificação de parte do gene 16S rRNA. Adicionalmente foi também detectado DNA de E. histolytica em 20,0% (4/20) das amostras analisadas, microscopicamente negativas para Entamoeba spp.. Neste estudo realizou-se a genotipagem de G. lamblia utilizando parte dos genes bg (beta-giardina), tpi (triose-fosfato isomerase) e gdh (glutamato desidrogenase), que revelou haver 61,5% (8/13) dos isolados pertencentes ao genótipo B e 38,5% (5/13) do genótipo A. A determinação de subgenótipos através da análise de SNP’s para os 3 genes só foi possível para o gene bg do genótipo A, revelando 3 amostras correspondentes ao subgenótipo A2 e uma para o subgenótipo A3. Para os restantes genes não foi possível a determinação de subgenótipos devido à presença de polimorfismos genéticos para ambos os genótipos A e B. Realizou-se também a análise filogenética concatenada que apenas permitiu a integração de três amostras identificadas com o genótipo A no subgenótipo AII. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a microscopia associada às técnicas moleculares possibilita a diferenciação das espécies do complexo Entamoeba favorecendo o correcto diagnóstico desta patologia e consequente tratamento. Para além disso, o uso dos métodos moleculares contribuiu para o esclarecimento e compreensão dos genótipos de Giardia em humanos. Neste estudo a utilização do método de conservação, papel de filtro apresentou um menor custo e elevada eficácia em relação aos métodos normalmente utilizados, conservação a -20ºC. Sugerindo a sua utilização com sucesso em estudos epidemiológicos em especial em zonas endémicas de condições precárias.

Inhibition of SNF1-related protein kinase1 by trehalose 6-phosphate and other metabolites and the interrelation with plant gorwth

All life forms need to monitor carbon and energy availability to survive and this is especially true for plants which must integrate unavoidable environmental conditions with metabolism for cellular homeostasis maintenance. Sugars, in the heart of metabolism, are now recognized as crucial signaling molecules that translate those conditions. One such signal is trehalose 6- phosphate (T6P), a phosphorylated dimer of glucose molecules which levels correlate well with those of sucrose (Suc). Central integrators of stress and energy regulation include the conserved plant Snf1-related kinase1 (SnRK1) which respond to low cellular energy levels by up-regulating energy conserving and catabolic metabolism and down-regulating energy consuming processes. In 2009 T6P was shown to inhibit SnRK1. The in vitro inhibition of SnRK1 by T6P was confirmed in vivo through the observation that genes normally induced by SnRK1 were repressed by T6P and vice-versa, promoting growth processes. These observations provided a model for the regulation of growth by sugar.(...)

Análise dos textos escritos produzidos por alunos da 7ª classe em Angola e propostas de remediação de erros

O estudo sobre os textos escritos produzidos por alunos da 7ª classe em Angola foi estabelecido por nós com base na hipótese da existência de dificuldades de escrita. Há bastantes dúvidas entre os docentes angolanos sobre a capacidade dos alunos na elaboração de textos espontâneos. Desta forma, com o objectivo de conhecermos as capacidades de produção de textos escritos pelos alunos do ensino geral no Lubango, de elaborarmos uma tipologia de análise dos erros encontrados e de propormos estratégias de superação das dificuldades apresentadas nos textos dos alunos, fomos à Escola do I Ciclo do Ensino Secundário 27 de Março do Lubango – Huíla recolher as composições da Prova Trimestral para verificar as dificuldades de escrita apresentadas nos textos dos alunos. Partimos de 314 textos, dos quais foi extraída a amostra de 10%, correspondendo a 32 textos seleccionados através da tabela de números aleatórios. Os textos foram analisados com base na tipologia de erros de Sousa (1996). Desta forma, foram detectados erros de substituição, de omissão, de divisão/aglutinação, os quais foram muito significativos e ocorreram em 66,856% dos casos no total. Os erros de substituição maiúsculas/minúsculas, os de adição, de grafias homófonas constituem 30.856% dos casos. Confirmam-se as dificuldades apresentadas pelos alunos que devem merecer tratamento através das propostas de remediação apresentadas. As dificuldades encontradas nos textos destes alunos devem servir de base para a planificação da disciplina de Língua Portuguesa no Ensino Primário de forma a dotar o aluno de competências para a melhoria da comunicação escrita na sala de aula.

Bowel preparation for colonoscopy: comparison of mannitol and sodium phosphate. Results of a prospective randomized study

METHOD: Eighty patients were prospectively randomized for precolonoscopic cleansing either with 750 ml of 10% mannitol (Group M) or 180 ml of a sodium phosphate preparation (Group NaP). Laboratory examinations before and after preparation on all patients included hemoglobin, hematocrit, sodium, potassium, phosphorous, calcium and serum osmolarity. A questionnaire was used to assess undesirable side effects and patient tolerance to the solution. The quality of preparation was assessed by the endoscopist who was unaware of the solution employed. RESULTS: Statistically significant changes were verified in serum sodium, phosphorous, potassium and calcium between the two groups, but no clinical symptoms were observed. There were no significant differences in the frequency of side effects studied. Six of the eight patients in Group NaP who had taken mannitol for a previous colonoscopy claimed better acceptance of the sodium phosphate solution. The endoscopic-blinded trial reported excellent or good bowel preparation in 85% prepared with sodium phosphate versus 82.5% for mannitol (p=0.37). CONCLUSIONS: Quality of preparation and frequency of side effects was similar in the two solutions. The smaller volume of sodium phosphate necessary for preparation seems to be related to its favorable acceptance. Nevertheless, the retention of sodium and phosphate ions contraindicates the use of sodium phosphate in patients with renal failure, cirrhosis, ascites, and heart failure.

A documentação de arte efémera como forma de preservação: O caso de "Árvore Jogo/Lúdico em 7 Imagens Espelhadas" de Alberto Carneiro

No que diz respeito à sua preservação e apresentação grande parte da arte contemporânea exige respostas eficazes e pragmáticas do ponto de vista da museologia. Esta situação torna-se mais evidente em obras de instalação e media art, que recorrem a múltiplos objectos, mantêm uma relação com o espaço e são alvo de fenómenos de obsolescência tecnológica, reclamando assim, estratégias que passam pela produção activa de registos documentais, a fim de garantir o seu legado a gerações futuras. A partir da obra de Alberto Carneiro "Árvore jogo / lúdico em 7 imagens espelhadas", que foi pela primeira vez materializada na Galeria Quadrum, em Lisboa, em 1975, e destruída no ano seguinte pelo autor, após a Bienal de Veneza, discutimos as estratégias documentais mais adequadas. A metodologia assenta num trabalho de base antropológica, através de entrevistas com o artista, que permitam identificar todos os aspectos relacionados com o processo criativo e criar um manual de instalação, que se pretende de fácil acesso a investigadores, conservadores e até ao público em geral. Para este efeito iniciou-se um trabalho de colaboração com o Departamento de Informática da FCT-UNL com vista à construção de uma ferramenta multimédia que permita reunir num só local toda a informação relativa à obra.

Induction of experimental mammary carcinogenesis in rats with 7,12-dimethylbenz(a)anthracene

PURPOSE: To test an experimental model of chemical mammary carcinogenesis induction in rats. METHODS: Twenty young virgin Sprague-Dawley female rats, aged 47 days, received 20 mg of 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) intragastrically by gavage. Afterwards, at 8 and 13 weeks, their mammary glands were examined. At the end of the experiment, the animals were sacrificed, and the mammary tumors were measured and weighed. Tumor fragments were analyzed using light microscopy. RESULTS: Eight weeks after DMBA injection, 16 rats presented at least 1 breast tumor (80%). After 13 weeks, all of them (100%) developed breast carcinomas that were confirmed by histopathological analysis. CONCLUSION: This experimental animal model of chemical mammary induced carcinogenesis is feasible and can be used in further experiments on the role of tumorigenic biomodulator substances.

Urethral catheter removal 7 or 14 days after radical retropubic prostatectomy: clinical implications and complications in a randomized study

PURPOSE: To evaluate the hypothesis that a 7-day period of indwelling catheter after radical retropubic prostatectomy is effective and safe without the need of performing cystography. METHODS: In the period from January of 2000 to July of 2002, 73 patients underwent radical retropubic prostatectomy, and these patients were prospectively randomized in 2 groups: Group 1-37 patients who had the urethral catheter removed 7 days after the procedure, and Group 2-36 patients who had the catheter removed 14 days after the surgery. The 2 groups were similar, the surgeons and the technique were the same, and no cystography was performed to evaluate the presence of leaks. RESULTS: Two patients in Group 1 had bleeding and clot retention after having the catheter taken out in the seventh postoperative day and were managed by putting the catheter back in for 7 more days. Two patients in Group 2 developed bladder neck stricture and were treated by bladder neck incision with success. The continence rate was the same, with 2 cases of incontinence in each group. About 2 pads a day were used by the patients with incontinence. The average follow-up was 17.5 months (12-36 months). No urinary fistula, urinoma, or pelvic abscesses developed after catheter removal. Two patients were excluded from the analysis of this series: 1 died with a pulmonary embolus in the third postoperative day, and 1 developed a urinary suprapubic fistula before catheter withdrawal, which was maintained for 16 days. CONCLUSION: Withdrawal of the urethral catheter 7 days after radical retropubic prostatectomy, without performing cystography, has a low rate of short-term complications that are equivalent to withdrawal 14 days after the surgery.

Contribuição ao Estudo Anatômico do Lenho de 7 Espécies de Dimorphandra (Leguminosae - Caesalpinioideae)

Os autores apresentam neste trabalho o estudo dos caracteres anatômicos das madeiras de 7 espécies do gênero Dimorphandra(leguminosae - Caesalpinioideae) e para cada uma delas são apresentadas ainda informações sobre: a) daárvore.:descrição botânica, distribuição geográfica e nomes vulgares; b) da madeira:características gerais, descrição macro e microscópica, 7 macro e 14 microfotografias estruturais do lenho. As espécies estudadas foram: Dimon.phandAa conjugata(Splitgerber) Sandw., D.gardnerianaTut., V. giganteaDucke, D. mollísBenth., D.multifloraDucke, D. palleiAmsh. e D, unijagaTul. Um quadro sinótico com as principais características anatômicas diferenciais das, espécies é também apresentado.

Electrodialytic recovery of phosphorus and organic contaminants removal from sewage sludge

Phosphorus is a macronutrient essential to life which comes from phosphate rock, a non-renewable resource. Sewage sludge from wastewater treatment plants (WWTP) is a secondary resource rich in phosphorus that can be valorized. However, organic compounds are detected in sewage sludge, due to its non-polar and hydrophobic character, being considered an environmental risk. The present dissertation aims to study the efficiency of the electrodialytic process (ED) when applied to sewage sludge aiming phosphorus recovery and organic contaminants removal. Four organic compounds were analyzed: 17α-ethynylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), caffeine (Caf) and oxybenzone (MBPh). The experiments took place in an ED cell with two compartments and an anion exchange membrane, with the sludge in the cathode compartment. The experiments were carried out for three days with spiked sewage sludge (six assays). One control experiment was done without current, three experiments were carried out applying a constant current of 50, 75, and 100 mA and two experiments were carried out applying sequential currents: 50 mA, 75 mA and 100 mA and the opposite (100-75-50 mA). A qualitative and quantitative analysis of microorganisms existing in the samples was also done. At the end, the pH increased in the sewage sludge favoring phosphorus recovery. In terms of phosphorus, the highest recovery was achieved in the experiment run with 100 mA, where 70.3±2.0% of total phosphorus was recovered in the electrolyte. Generally, compounds degradation was favored by the current. Caf and MBPh achieved degradation percentages of 96.2±0.2% and 84.8±1.3%, respectively, in 100 mA assay. EE2 (83.1±1.7%) and BPA (91.8±4.6%) degradations were favored by 50 mA current. A total of 35 taxa from four different groups were identified, totalizing between 81,600-273,000 individuals per gram of initial sludges. After ED, microbial community population decreased between 47-98%. Arcella gibbosa represented 61% of the total observed organisms and revealed to be more tolerant to medium changes.