Kernspektroskopische Untersuchungen in der 132 Sn-Region

In der vorliegenden Arbeit werden die r-Prozesskerne rund um den N=82-Schalenabschluß untersucht. Dabei gelang es die bisher unbekannten Halbwertszeiten und Pn-Werte der Antimonisotope 137-139-Sb und von 139-Te zu messen. Des Weiteren wurden die Ergebnisse von Shergur et. al. zu extrem neutronenreichen Zinnisotopen (137,138-Sn) mit neuen Messungen untermauert und verbessert. Alle erhaltenen Ergebnisse werden mit entsprechenden Modellrechnungen verglichen und ihr Einfluss auf moderne Netzwerkrechnungen zum r-Prozess diskutiert. Des Weiteren gelang erstmalig die Aufnahmen von gamma-spektroskopischen Daten für das r-Prozessnuklid 136-Sn in Singlespektren. Aufgrund der hinlänglich bekannten Probleme mit Isobarenkontaminationen für Ionenstrahlen von sehr exotischen Molekülen an ISOL-Einrichtungen werden unterschiedliche technische Entwicklungen zur Verbesserung der Strahlqualität aufgezeigt. Ein besonderer Schwerpunkt liegt hier auf der neu eingeführten Technik der molekularen Seitenbänder an Massenseparatoren. Hier gelang es durch gezielte Zugabe von Schwefel in das Target ein starke SnS(+)-Seitenband zu etablieren und so bei guter Strahlintensität eine deutliche Reduktion des Isobarenuntergrunds zu erreichen. Ebenso werden die Möglichkeiten einer temperaturkontrollierten Quarztransferline zwischen Target und Ionenquelle zur Minimierung von Kontaminationen bespro-chen. Zur Verbesserung der Selektivität von Experimenten an sehr neutronenreichen Elementen wurde ein Detektorsystem zur n,gamma-Koinzidenzmessung entwickelt. Im Gegensatz zu früheren Versuchen dieser Art, gelang es durch eine entsprechende neue Elektronik striktere Koinzidenzbedingungen zu realisieren und so das Koinzidenzfenster deutlich zu verkleinern.

Muster und Prozesse in einer Microcebus-Hybridzone in Südostmadagaskar

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in zwei Schwerpunktanalysen mit eine Teil- und Gesamtdatensatz die Untersuchung der Hybridisierung zwischen den beiden Microcebus-Arten M. murinus und M. griseorufus im Ökoton Südostmadagaskars umfangreich und vertieft untersucht. Für die genetischen Analysen wurden die maternal vererbte mitochondriale Hypervariable Region I (HVR 1) und neun nukleäre biparental vererbte Mikrosatellitenmarker eingesetzt. Als weiterer Datensatz wurden morphometrische Daten verwendet. Für die erste Schwerpunktanalyse wurde ein bereits vorhandener Teildatensatz (Hapke 2005 & Gligor 2006) mit Daten von insgesamt 162 Individuen aus neun Populationen der Dornbuschzone, der Übergangswaldzone und des Küstenwaldgebietes eingesetzt. In der zweiten Schwerpunktanalyse wurde eine umfangreiche Untersuchung der Microcebus griseoruus-M. murinus- Hybridzone vorgenommen. Für diese detaillierte Charakterisierung der Hybridzone wurde eine ausgedehnte und fein auflösende Probennahme in einem als Kernzone definierten Bereich, der die gesamte Übergangswaldzone und die dazu benachbarten Dornbuschgebiete umfasste, durchgeführt. Die morphometrischen und genetischen Daten der neu beprobten Individuen dieser Kernzone wurden mit den Daten des Teildatensatzes und weiteren Daten aus Küstenwaldpopulationen (Hapke 2005) zu einem Gesamtdatensatz zusammengefasst. Die Integration des Teildatensatzes in den Gesamtdatensatz erforderte umfassende und zeitintensive Labor- und Analysearbeiten, die im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführt wurden. Der Gesamtdatensatz umfasste insgesamt 569 Individuen der Gattung Microcebus aus 29 Untersuchungsstandorten. Die mit beiden Datensätzen durchgeführte Analyse morphometrischer Daten zeigte deutlich, dass die Mehrzahl der Individuen aus der Übergangswaldzone einen intermediären Morphotyp aufweist. Durch die mit den Daten des Teildatensatzes durchgeführten Bayes’schen Clusteranalysen und Assignment-Tests, das vornehmlich in den Populationen der Übergangszone beobachtete signifikante Kopplungsungleichgewicht und Heterozygotendefizit, die festgestellte Verteilung der mitochondrialen Haplotypen und das kontrastierende Muster zwischen nukleären Mikrosatellitengenotypen und mitochondrialen Haplotypen in den Übergangswaldpopulationen konnte erstmals das Vorkommen einer Hybridzone zwischen Microcebus-Arten wissenschaftlich fundiert festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Schwerpunktanalyse wurden in der Fachzeitschrift Molecular Ecology publiziert (Gligor et al. 2009). Die in der ersten Schwerpunktanalyse festgestellte Hybridzone konnte durch die zweite Schwerpunktanalyse mit den genetischen und morphometrischen Daten des Gesamtdatensatzes nicht nur bestätigt werden, sondern auch auf die gesamte Übergangswaldzone erweitert werden. Ferner wurden starke Hinweise auf eine Hybridisierung beider Microcebus-Arten an einigen Dornbuschstandorten der Kernzone gefunden. Durch die große Datenmenge des Gesamtdatensatzes, vor allem aus der Kernzone des Untersuchungsgebietes, war es möglich eine fundierte Charakterisierung der Microcebus griseoruus-M. murinus- Hybridzone durchzuführen. Die Übereinstimmung der Hybridzone mit dem beobachteten Vegetationsmosaik zusammen mit den Ergebnissen der PCA, der PCoA und der Bayes’schen Clusteranalyse sprechen für das Modell der „Mosaik Hybridzone“, während die Einzelbetrachtung der mosaikartig verteilten intermediären Übergangswälder eine hohe Abundanz der Hybride aufzeigte und somit eher das „Bounded Hybrid Superiority model“ unterstützt. Der gewählte geographische Beprobungsmaßstab könnte somit einen Einfluss auf die beobachtete Struktur einer Hybridzone haben. Eines der markantesten Muster in der Hybridzone ist das stark kontrastierende cyto-nukleäre Muster. Der seit ca. 3000 Jahren fortschreitende Klimawandel in Südmadagaskar und die damit verbundene Expansion des Verbreitungsgebietes der Art Microcebus griseorufus nach Osten, das in dieser Arbeit festgestellte „male-biased dispersal“ bei M. griseorufus und der Einfluss exogener Selektion sprechen stark für eine massive asymmetrische nukleäre Genintrogression von M. griseorufus-Allelen in M. murinus-Populationen, verbunden mit einer potentiellen Verdrängung der Art M. murinus aus der Übergangswaldzone. In den jeweiligen Kerngebieten Dornbusch und Küstenwald bleibt jedoch die Diskretheit beider Arten gewahrt.

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

Quality assessment of a landslide inventory map and its application to land‐use planning. A case study in the Northern Apennines (Emilia‐Romagna region, Italy)

Landslide hazard and risk are growing as a consequence of climate change and demographic pressure. Land‐use planning represents a powerful tool to manage this socio‐economic problem and build sustainable and landslide resilient communities. Landslide inventory maps are a cornerstone of land‐use planning and, consequently, their quality assessment represents a burning issue. This work aimed to define the quality parameters of a landslide inventory and assess its spatial and temporal accuracy with regard to its possible applications to land‐use planning. In this sense, I proceeded according to a two‐steps approach. An overall assessment of the accuracy of data geographic positioning was performed on four case study sites located in the Italian Northern Apennines. The quantification of the overall spatial and temporal accuracy, instead, focused on the Dorgola Valley (Province of Reggio Emilia). The assessment of spatial accuracy involved a comparison between remotely sensed and field survey data, as well as an innovative fuzzylike analysis of a multi‐temporal landslide inventory map. Conversely, long‐ and short‐term landslide temporal persistence was appraised over a period of 60 years with the aid of 18 remotely sensed image sets. These results were eventually compared with the current Territorial Plan for Provincial Coordination (PTCP) of the Province of Reggio Emilia. The outcome of this work suggested that geomorphologically detected and mapped landslides are a significant approximation of a more complex reality. In order to convey to the end‐users this intrinsic uncertainty, a new form of cartographic representation is needed. In this sense, a fuzzy raster landslide map may be an option. With regard to land‐use planning, landslide inventory maps, if appropriately updated, confirmed to be essential decision‐support tools. This research, however, proved that their spatial and temporal uncertainty discourages any direct use as zoning maps, especially when zoning itself is associated to statutory or advisory regulations.

Temporal variation of genetic diversity and differentiation of albacore, Thunnus alalunga, in the Mediterranean Sea

This study is on albacore (Thunnus alalunga, Bonnaterre 1788), an epi- and mesopelagic oceanic tuna species cosmopolitan in the tropical and temperate waters of all oceans including the Mediterranean Sea, extending in a broad band between 40°N and 40°S. What it’s known about albacore population structure is based on different studies that used fisheries data, RFLP, mtDNA control region and nuDNA markers, blood lectins analysis, individual tags and microsatellite. At the moment, for T. alalunga six management units are recognized: the North Pacific, South Pacific, Indian, North Atlantic, South Atlantic and Mediterranean stocks. In this study I have done a temporal and spatial comparison of genetic variability between different Mediterranean populations of Thunnus alalunga matching an historical dataset ca. from 1920s composed of 43 individuals divided in 3 populations (NADR, SPAIN and CMED) with a modern dataset composed of 254 individuals and 7 populations (BAL, CYP, LIG, TYR, TUR, ADR, ALB). The investigation was possible using a panel of 94 nuclear SNPs, built specifically for the target species at the University of Basque Country UPV/EHU. First analysis done was the Hardy-Weinberg, then the number of clusters (K) was determined using STRUCTURE and to assess the genetic variability, allele frequencies, the average number of alleles per locus, expected (He) and observed (Ho) heterozygosis, and the index of polymorphism (P) was used the software Genetix. Historical and modern samples gives different results, showing a clear loss of genetic diversity over time leading to a single cluster in modern albacore instead of the two found in historical samples. What this study reveals is very important for conservation concerns, and additional research endeavours are needed.

The sensitivity of the photostationary state of NOx and its implication for the oxidation capacity in a semi-rural and boreal forest region

Für das Vermögen der Atmosphäre sich selbst zu reinigen spielen Stickstoffmonoxid (NO) und Stickstoffdioxid (NO2) eine bedeutende Rolle. Diese Spurengase bestimmen die photochemische Produktion von Ozon (O3) und beeinflussen das Vorkommen von Hydroxyl- (OH) und Nitrat-Radikalen (NO3). Wenn tagsüber ausreichend Solarstrahlung und Ozon vorherrschen, stehen NO und NO2 in einem schnellen photochemischen Gleichgewicht, dem „Photostationären Gleichgewichtszustand“ (engl.: photostationary state). Die Summe von NO und NO2 wird deshalb als NOx zusammengefasst. Vorhergehende Studien zum photostationären Gleichgewichtszustand von NOx umfassen Messungen an unterschiedlichsten Orten, angefangen bei Städten (geprägt von starken Luftverschmutzungen), bis hin zu abgeschiedenen Regionen (geprägt von geringeren Luftverschmutzungen). Während der photochemische Kreislauf von NO und NO2 unter Bedingungen erhöhter NOx-Konzentrationen grundlegend verstanden ist, gibt es in ländlicheren und entlegenen Regionen, welche geprägt sind von niedrigeren NOx-Konzetrationen, signifikante Lücken im Verständnis der zugrundeliegenden Zyklierungsprozesse. Diese Lücken könnten durch messtechnische NO2-Interferenzen bedingt sein - insbesondere bei indirekten Nachweismethoden, welche von Artefakten beeinflusst sein können. Bei sehr niedrigen NOx-Konzentrationen und wenn messtechnische NO2-Interferenzen ausgeschlossen werden können, wird häufig geschlussfolgert, dass diese Verständnislücken mit der Existenz eines „unbekannten Oxidationsmittels“ (engl.: unknown oxidant) verknüpft ist. Im Rahmen dieser Arbeit wird der photostationäre Gleichgewichtszustand von NOx analysiert, mit dem Ziel die potenzielle Existenz bislang unbekannter Prozesse zu untersuchen. Ein Gasanalysator für die direkte Messung von atmosphärischem NO¬2 mittels laserinduzierter Fluoreszenzmesstechnik (engl. LIF – laser induced fluorescence), GANDALF, wurde neu entwickelt und während der Messkampagne PARADE 2011 erstmals für Feldmessungen eingesetzt. Die Messungen im Rahmen von PARADE wurden im Sommer 2011 in einem ländlich geprägten Gebiet in Deutschland durchgeführt. Umfangreiche NO2-Messungen unter Verwendung unterschiedlicher Messtechniken (DOAS, CLD und CRD) ermöglichten einen ausführlichen und erfolgreichen Vergleich von GANDALF mit den übrigen NO2-Messtechniken. Weitere relevante Spurengase und meteorologische Parameter wurden gemessen, um den photostationären Zustand von NOx, basierend auf den NO2-Messungen mit GANDALF in dieser Umgebung zu untersuchen. Während PARADE wurden moderate NOx Mischungsverhältnisse an der Messstelle beobachtet (10^2 - 10^4 pptv). Mischungsverhältnisse biogener flüchtige Kohlenwasserstoffverbindungen (BVOC, engl.: biogenic volatile organic compounds) aus dem umgebenden Wald (hauptsächlich Nadelwald) lagen in der Größenordnung 10^2 pptv vor. Die Charakteristiken des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx bei niedrigen NOx-Mischungsverhältnissen (10 - 10^3 pptv) wurde für eine weitere Messstelle in einem borealen Waldgebiet während der Messkampagne HUMPPA-COPEC 2010 untersucht. HUMPPA–COPEC–2010 wurde im Sommer 2010 in der SMEARII-Station in Hyytiälä, Süd-Finnland, durchgeführt. Die charakteristischen Eigenschaften des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx in den beiden Waldgebieten werden in dieser Arbeit verglichen. Des Weiteren ermöglicht der umfangreiche Datensatz - dieser beinhaltet Messungen von relevanten Spurengasen für die Radikalchemie (OH, HO2), sowie der totalen OH-Reaktivität – das aktuelle Verständnis bezüglich der NOx-Photochemie unter Verwendung von einem Boxmodell, in welches die gemessenen Daten als Randbedingungen eingehen, zu überprüfen und zu verbessern. Während NOx-Konzentrationen in HUMPPA-COPEC 2010 niedriger sind, im Vergleich zu PARADE 2011 und BVOC-Konzentrationen höher, sind die Zyklierungsprozesse von NO und NO2 in beiden Fällen grundlegend verstanden. Die Analyse des photostationären Gleichgewichtszustandes von NOx für die beiden stark unterschiedlichen Messstandorte zeigt auf, dass potenziell unbekannte Prozesse in keinem der beiden Fälle vorhanden sind. Die aktuelle Darstellung der NOx-Chemie wurde für HUMPPA-COPEC 2010 unter Verwendung des chemischen Mechanismus MIM3* simuliert. Die Ergebnisse der Simulation sind konsistent mit den Berechnungen basierend auf dem photostationären Gleichgewichtszustand von NOx.

Regulation von "Silent mating type information regulation 2 homolog Type" 1 (SIRT1) durch die nach DNA-Schaden induzierte Kinase "Homeodomain-interaction kinase" (HIPK2)

"Silent mating type information regulation 2 Type" 1 (SIRT1), das humane Homolog der NAD+-abhängigen Histondeacetylase Sir2 aus Hefe, besitzt Schlüsselfunktionen in der Regulation des Metabolismus, der Zellalterung und Apoptose. Letztere wird vor allem durch die Deacetylierung von p53 an Lys382 und der dadurch verringerten Transkription proapoptotischer Zielgene vermittelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SIRT1 Regulation im Zusammenhang mit der DNA-Schadensantwort untersucht.rnIn der Apoptoseregulation übernimmt die Serin/Threonin-Kinase "Homeodomain interacting protein kinase" 2 (HIPK2) eine zentrale Rolle und daher wurde die SIRT1 Modifikation und Regulation durch HIPK2 betrachtet. Durch Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins p53 an Ser46 aktiviert HIPK2 das Zielprotein und induziert die Transkription proapoptotischer Zielgene von p53. Es wurde beschrieben, dass HIPK2 nach DNA-Schädigung über einen bisher unbekannten Mechnismus die Acetylierung von p53 potenzieren kann.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass SIRT1 von HIPK2 in vitro und in Zellen an Serin 27 und 682 phosphoryliert wird. Weiterhin ist die Interaktion von SIRT1 mit HIPK2 sowie die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 durch DNA-schädigende Adriamycinbehandlung erhöht. Es gibt Hinweise, dass HIPK2 die Expression von SIRT1 reguliert, da HIPK2 RNA-Interferenz zur Erniedrigung der SIRT1 Protein- und mRNA-Mengen führt.rnEin weiterer interessanter Aspekt liegt in der Beobachtung, dass Ko-Expression von PML-IV, welches SIRT1 sowie HIPK2 in PML-Kernkörper rekrutiert, die SIRT1 Phosphorylierung an Serin 682 verstärkt. Phosphorylierung von SIRT1 an Serin 682 interferiert wiederum mit der SUMO-1 Modifikation, welche für die Lokalisation in PML-Kernkörpen wichtig ist.rnBemerkenswerterweise reduziert die DNA-schadendsinduzierte SIRT1 Phosphorylierung die Bindung des SIRT1 Ko-Aktivators AROS, beeinflusst aber nicht diejenige des Inhibitors DBC1. Dies führt zur Reduktion der enzymatischen Aktivität von SIRT1 und der darausfolgenden weniger effizienten Deacetylierung des Zielproteins p53.rnDurch die von mir in der vorliegenden Promotionsarbeit erzielten Ergebnisse konnte ein neuer molekularer Mechanismus entschlüsselt werden, welcher die durch HIPK2 modulierte Acetylierung von p53 und die daran anschließende Induktion der Apoptose beschreibt.rnHIPK2-vermittelte SIRT1 Phosphorylierung resultiert in einer verminderten Deacetylasefunktion von SIRT1 und führt so zu einer verstärkten acetylierungsinduzierten Expression proapoptotischer p53 Zielgene.

Nuclear cysteine cathepsin variants in thyroid carcinoma cells

The cysteine peptidase cathepsin B is important in thyroid physiology by being involved in thyroid prohormone processing initiated in the follicular lumen and completed in endo-lysosomal compartments. However, cathepsin B has also been localized to the extrafollicular space and is therefore suggested to promote invasiveness and metastasis in thyroid carcinomas through, e.g., ECM degradation. In this study, immunofluorescence and biochemical data from subcellular fractionation revealed that cathepsin B, in its single- and two-chain forms, is localized to endo-lysosomes in the papillary thyroid carcinoma cell line KTC-1 and in the anaplastic thyroid carcinoma cell lines HTh7 and HTh74. This distribution is not affected by thyroid stimulating hormone (TSH) incubation of HTh74, the only cell line that expresses a functional TSH-receptor. Immunofluorescence data disclosed an additional nuclear localization of cathepsin B immunoreactivity. This was supported by biochemical data showing a proteolytically active variant slightly smaller than the cathepsin B proform in nuclear fractions. We also demonstrate that immunoreactions specific for cathepsin V, but not cathepsin L, are localized to the nucleus in HTh74 in peri-nucleolar patterns. As deduced from co-localization studies and in vitro degradation assays, we suggest that nuclear variants of cathepsins are involved in the development of thyroid malignancies through modification of DNA-associated proteins.

Crystallization of Escherichia coli Catabolite Gene Activator Protein with its DNA Binding Site: The use of Modular DNA

To obtain crystals of the Escherichia coli catabolite gene activator protein (CAP) complexed with its DNA-binding site, we have searched for crystallization conditions with 26 different DNA segments ≥28 base-pairs in length that explore a variety of nucleotide sequences, lengths, and extended 5′ or 3′ termini. In addition to utilizing uninterrupted asymmetric lac site sequences, we devised a novel approach of synthesizing half-sites that allowed us to efficiently generate symmetric DNA segments with a wide variety of extended termini and lengths in the large size range (≥28 bp) required by this protein. We report three crystal forms that are suitable for X-ray analysis, one of which (crystal form III) gives measurable diffraction amplitudes to 3 Å resolution. Additives such as calcium, n-octyl-β-d-glucopyranoside and spermine produce modest improvements in the quality of diffraction from crystal form III. Adequate stabilization of crystal form III is unexpectedly complex, requiring a greater than tenfold reduction in the salt concentration followed by addition of 2-methyl-2,4-pentanediol and then an increase in the concentration of polyethylene glycol.

Homo-DNA templated chemistry and its application to nucleic acid sensing

We have investigated the homo-DNA templated Staudinger reduction of the profluorophore rhodamine azide and have applied this reaction to the detection of natural DNA with a hybrid homo-DNA/DNA molecular beacon. In this system the sensing and the reporting unit are bioorthogonal to each other which facilitates sequence design and increases fidelity.

Two domains of the V protein of virulent canine distemper virus selectively inhibit STAT1 and STAT2 nuclear import

Canine distemper virus (CDV) causes in dogs a severe systemic infection, with a high frequency of demyelinating encephalitis. Among the six genes transcribed by CDV, the P gene encodes the polymerase cofactor protein (P) as well as two additional nonstructural proteins, C and V; of these V was shown to act as a virulence factor. We investigated the molecular mechanisms by which the P gene products of the neurovirulent CDV A75/17 strain disrupt type I interferon (IFN-alpha/beta)-induced signaling that results in the establishment of the antiviral state. Using recombinant knockout A75/17 viruses, the V protein was identified as the main antagonist of IFN-alpha/beta-mediated signaling. Importantly, immunofluorescence analysis illustrated that the inhibition of IFN-alpha/beta-mediated signaling correlated with impaired STAT1/STAT2 nuclear import, whereas the phosphorylation state of these proteins was not affected. Coimmunoprecipitation assays identified the N-terminal region of V (VNT) responsible for STAT1 targeting, which correlated with its ability to inhibit the activity of the IFN-alpha/beta-mediated antiviral state. Conversely, while the C-terminal domain of V (VCT) could not function autonomously, when fused to VNT it optimally interacted with STAT2 and subsequently efficiently suppressed the IFN-alpha/beta-mediated signaling pathway. The latter result was further supported by a single mutation at position 110 within the VNT domain of CDV V protein, resulting in a mutant that lost STAT1 binding while retaining a partial STAT2 association. Taken together, our results identified the CDV VNT and VCT as two essential modules that complement each other to interfere with the antiviral state induced by IFN-alpha/beta-mediated signaling. Hence, our experiments reveal a novel mechanism of IFN-alpha/beta evasion among the morbilliviruses.

Regulatory mechanism of the light-activable allosteric switch LOV-TAP for the control of DNA binding: a computer simulation study

The spatio-temporal control of gene expression is fundamental to elucidate cell proliferation and deregulation phenomena in living systems. Novel approaches based on light-sensitive multiprotein complexes have recently been devised, showing promising perspectives for the noninvasive and reversible modulation of the DNA-transcriptional activity in vivo. This has lately been demonstrated in a striking way through the generation of the artificial protein construct light-oxygen-voltage (LOV)-tryptophan-activated protein (TAP), in which the LOV-2-Jα photoswitch of phototropin1 from Avena sativa (AsLOV2-Jα) has been ligated to the tryptophan-repressor (TrpR) protein from Escherichia coli. Although tremendous progress has been achieved on the generation of such protein constructs, a detailed understanding of their functioning as opto-genetical tools is still in its infancy. Here, we elucidate the early stages of the light-induced regulatory mechanism of LOV-TAP at the molecular level, using the noninvasive molecular dynamics simulation technique. More specifically, we find that Cys450-FMN-adduct formation in the AsLOV2-Jα-binding pocket after photoexcitation induces the cleavage of the peripheral Jα-helix from the LOV core, causing a change of its polarity and electrostatic attraction of the photoswitch onto the DNA surface. This goes along with the flexibilization through unfolding of a hairpin-like helix-loop-helix region interlinking the AsLOV2-Jα- and TrpR-domains, ultimately enabling the condensation of LOV-TAP onto the DNA surface. By contrast, in the dark state the AsLOV2-Jα photoswitch remains inactive and exerts a repulsive electrostatic force on the DNA surface. This leads to a distortion of the hairpin region, which finally relieves its tension by causing the disruption of LOV-TAP from the DNA.

Improved water vapour spectroscopy in the 4174-4300 cm-1 region and its impact on SCIAMACHY HDO/H2O measurements

The relative abundance of the heavy water isotopologue HDO provides a deeper insight into the atmospheric hydrological cycle. The SCanning Imaging Absorption spectroMeter for Atmospheric CartograpHY (SCIAMACHY) allows for global retrievals of the ratio HDO/H2O in the 2.3 micron wavelength range. However, the spectroscopy of water lines in this region remains a large source of uncertainty for these retrievals. We therefore evaluate and improve the water spectroscopy in the range 4174–4300 cm−1 and test if this reduces systematic uncertainties in the SCIAMACHY retrievals of HDO/H2O. We use a laboratory spectrum of water vapour to fit line intensity, air broadening and wavelength shift parameters. The improved spectroscopy is tested on a series of ground-based high resolution FTS spectra as well as on SCIAMACHY retrievals of H2O and the ratio HDO/H2O. We find that the improved spectroscopy leads to lower residuals in the FTS spectra compared to HITRAN 2008 and Jenouvrier et al. (2007) spectroscopy, and the retrievals become more robust against changes in the retrieval window. For both the FTS and SCIAMACHY measurements, the retrieved total H2O columns decrease by 2–4% and we find a negative shift of the HDO/H2O ratio, which for SCIAMACHY is partly compensated by changes in the retrieval setup and calibration software. The updated SCIAMACHY HDO/H2O product shows somewhat steeper latitudinal and temporal gradients and a steeper Rayleigh distillation curve, strengthening previous conclusions that current isotope-enabled general circulation models underestimate the variability in the near-surface HDO/H2O ratio.

Functional relevance of DNA polymorphisms within the promoter region of the prion protein gene and their association to BSE infection

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are a group of neurodegenerative diseases that can occur spontaneously or can be caused by infection or mutations within the prion protein gene PRNP. Nonsynonymous DNA polymorphisms within the PRNP gene have been shown to influence susceptibility/resistance to infection in sheep and humans. Analysis of DNA polymorphisms within the core promoter region of the PRNP gene in four major German bovine breeds resulted in the identification of both SNPs and insertion/deletion (indel) polymorphisms. Comparative genotyping of both controls and animals that tested positive for bovine spongiform encephalopathy (BSE) revealed a significantly different distribution of two indel polymorphisms and two SNPs within Braunvieh animals, suggesting an association of these polymorphisms with BSE susceptibility. The functional relevance of these polymorphisms was analyzed using reporter gene constructs in neuronal cells. A specific haplotype near exon 1 was identified that exhibited a significantly lower expression level. Genotyping of nine polymorphisms within the promoter region and haplotype calculation revealed that the haplotype associated with the lowest expression level was underrepresented in the BSE group of all breeds compared to control animals, indicating a correlation of reduced PRNP expression and increased resistance to BSE.