The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology

Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.rnUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. rnDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.rn

The oxygen sensors FNR from Escherichia coli and NreABC from Staphylococcus carnosus

Im Laufe der Evolution entwickelte sich eine Reihe von Sauerstoff-Sensorsystemen in Bakterien, um die Genexpression der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Der Sauerstoffsensor FNR aus Escherichia coli bindet unter anaeroben Bedingungen ein [4Fe4S]2+ Zentrum. Unter Sauerstoffeinfluß zerfällt aktives [4Fe4S]2+FNR zu inaktivem [2Fe2S]2+FNR und weiter zu ebenfalls inaktivem apoFNR. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zustand von FNR in vivo in aeroben und anaeroben Zellen von Escherichia coli aufgeklärt. Durch Alkylierung der Cysteine in FNR und anschließender Analyse im Massenspektrometer konnte gezeigt werden, das FNR in aeroben Zellen hauptsächlich in der apo-Form vorliegt. Nach ca. 6 Minuten war in lebenden E. coli Zellen die Umwandlung von [4Fe4S]2+ FNR zu apoFNR abgeschlossen.rnrnIn dem gram positiven Bakterium Staphylococcus carnosus aktiviert das NreBC System unter anaeroben Wachstumsbedingungen die Gene der Nitratatmung. NreB ist eine cytoplasmatische Sensorhistidinkinase, die ein sauerstofflabiles [4Fe4S]2+ Zentrum über eine PAS-Domäne bindet. Das [4Fe4S]2+ Zentrum wird von vier Cysteinen gebunden. Der Responsregulator NreC steuert nach Aktivierung durch NreB die Transkription der Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurde NreB mit Hilfe von Cysteinmarkierungen in vivo charakterisiert. Durch die Änderung der Cystein-Zugänglichkeit für Thiolreagenzien nach Sauerstoffzugabe konnte eine Halbwertszeit von ca. 3 Minuten für das [4Fe4S]2+ Zentrum in vivo bestimmt werden. In anaeroben Bakterien stellt [4Fe4S]2+NreB die Hauptform von NreB dar, während in aeroben Bakterien hauptsächlich apoNreB vorkommt. Dieses Ergebnis konnte durch Massenspektroskopie bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden das NreA mit NreB und NreC wechselwirkt und Bestandteil des NreABC Drei-Komponentensystems ist. rn

Analisi della resa di purificazione di componenti della dna polimerasi III di escherichia coli

Nella seguente tesi sono stati affrontati differenti protocolli di purificazione di componenti della DNA polimerasi III di Escherichia coli, previamente sovraespressi nel microrganismo. A distanza di oltre 20 anni dall’identificazione della DNA polimerasi III quale enzima responsabile della replicazione del genoma di E. coli, sono stati fatti progressi riguardo la sua conoscenza. Tuttavia molti sono gli aspetti rimasti incogniti riguardo al meccanismo d’azione dell’enzima, così come il ruolo svolto dalle sue subunità e parte della loro struttura. Al fine di migliorare la comprensione di questo enzima, è necessario insistere sulla diffrattometria di raggi X, per la quale è indispensabile l’isolamento di cristalli delle proteine. Si intuisce la necessità di sviluppare metodi appropriati che consentano di ottenere una resa il più possibile elevata dei suoi componenti. Una metodica generale per la sovraespressione del core catalitico e della singola subunità α, deputata all’attività polimerasica a carico di entrambi i filamenti di DNA, era già stata perfezionata presso il laboratorio ospitante. Con il presente lavoro sono stati sperimentati alcuni procedimenti, volti ad aumentare la resa di purificazione, adottando differenti soluzioni. In primo luogo, si è cercato di recuperare le proteine contenute nel flow through eluito da una colonna cromatografica Q-Sepharose, alla quale non erano riuscite a legarsi durante il primo stadio di purificazione. Inoltre, sono stati sperimentati metodi alternativi di lisi cellulare di estrazione delle proteine. In sintesi, il contenuto della tesi potrebbe agevolare la valutazione di diverse strategie per incrementare la resa di purificazione della subunità α e del core polimerasico della DNA Polimerasi III di E. coli.

PAS c als signaltransduzierende Domäne des Sensorproteins DcuS von Escherichia coli

Bakterien besitzen membranintegrierte Sensoren für die Reaktion auf verändernde Umweltbedingungen.rnViele der Sensoren sind Zweikomponenten-Systeme bestehend aus einer Sensorhistidinkinase und einem Responseregulator der die zellulare Antwort auslöst. DcuS, der C4-Dicarboxylat-Sensor von DcuS ist eine membranintegrierte Histidin-Kinase. DcuS ist ein Multidomänen-Protein mit einer sensorischen periplasmatischen PASP (Per-Arnt-Sim) Domäne, zwei Transmembranhelices, eine cytoplasmatische PASC-Domäne und eine C-terminale Kinase-Domäne. PAS-Domänen sind ubiquitäre Signalmodule die in allen Reichen des Lebens zu finden sind. PAS-Domänen detektieren eine Vielfalt von Reizen wie Licht, Sauerstoff, Redoxpotential und verschiedene kleine Moleküle so wie die Modulation von Protein-Protein Interaktionen. PAS-Domänen sind strukturell homolog und besitzen eine charakteristische α/β-Faltung. Eine große Anzahl der sensorischen PAS-Domänen wurden identifiziert, aber viele der PAS-Domänen besitzen keinen apparenten Cofaktor und die Funktion ist unbekannt.rnEine Kombination aus gerichteter und ungerichteter Mutagenese, Protein-Protein-Interaktionsstudien und Festkörper-NMR (ssNMR) Experimente mit strukturellem Modelling wurde zur Untersuchung der Struktur und Funktion der cytoplasmatischen PAS-Domäne des membranintegrierten Sensors DcuS verwendet. Die Experimente zeigen, dass PASC eine wichtige Rolle in die Signaltransduktion von PASP zur C-terminalen Histidin-Kinase von DcuS spielt.rn

Caratterizzazione dell'attivita pirofosfatasica associata al dominio php della DNA Polimerasi III di Escherichia coli

Il presente lavoro si incentra sulla parziale caratterizzazione del sito attivo del dominio PHP della subunità alpha, componente fondamentale dell'Oloenzima polimerasi III di E. coli. E' stato messo in luce il coinvolgimento di questo dominio nel meccanismo di idrolisi del pirofosfato generato dalla reazione polimerasica, valutando inoltre il grado di associazione tra queste due attività.

Funktion der C 4-Dicarboxylat-Transporter DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen zur Energiekonservierung nutzen. Die Synthese der beteiligten Transporter und Enzyme wird auf der Transkriptionsebene durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. DcuS ist der Sensor für C4-Dicarboxylate. Der Antwortregulator DcuR wird von DcuS aktiviert und induziert die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA unter aeroben Verhältnissen. Anaerob verstärkt DcuSR die Expression des Fumarat/Succinat-Antiporters DcuB, der Fumarase B und der Fumaratreduktase FrdABCD. DctA und DcuB agieren als Co-Sensoren von DcuS und üben einen negativen Effekt auf die Genexpression von dctA bzw. dcuB aus.rnIn dieser Arbeit wurde die Funktion von DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS untersucht. Sowohl für DcuB als auch für DctA wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DcuS über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. DcuS bildete ein Transporter-Sensor-Cluster mit DctA und DcuB. C-terminale Verkürzung und die Mutagenese einzelner Aminosäuren der C-terminalen Helix 8b von DctA führten zu einem Verlust der Interaktion mit DcuS. Mit dieser Interaktion gingen sowohl die regulatorische Funktion als auch die Transportfunktion der Punktmutante DctA-L414A verloren. Ein Verlust der Interaktion wurde ebenfalls zwischen einer konstitutiv aktiven DcuS-Mutante und wildtypischem DctA beobachtet. Ebenso zeigte sich eine partielle Reduktion der Interaktion von DcuS mit DctA, wenn DcuS nach der zweiten Transmembranhelix verkürzt wurde. Die Interaktion zwischen DcuS und DctA wurde durch den Effektor Fumarat modifiziert, ging aber nicht komplett verloren.rnDctA konnte in verschiedenen Plasmidsystemen überproduziert werden und bildete Homotrimere. Die Topologie von DctA wurde mit experimentellen und in silico Methoden aufgeklärt. DctA ähnelt der Struktur und Topologie des Aminosäuretransporters Glt aus Pyrococcus horikoshii. DctA besitzt acht Transmembranhelices mit einem cytosolischen N- und C-Terminus sowie zwei Haarnadelschleifen. Die Substratbindung findet höchstwahrscheinlich in den Haarnadelschleifen statt und der Transport erfolgt nach dem „alternating access“ Modell.rnAußerdem wurde die Funktion des Transporters YfcC untersucht. Das Gen yfcC wurde mit Schlüsselgenen des Acetatstoffwechsels co-transkribiert. In yfcC-Deletionsstämmen zeigte sich ein stammspezifischer Defekt bei Wachstum mit Acetat und Transport von Acetat.

Structural and kinetic characterization of DNA polymerases I and III from Escherichia coli

DNA elongation is performed by Pol III α subunit in E. coli, stimulated by the association with ε and θ subunits. These three subunits define the DNA Pol III catalytic core. There is controversy about the DNA Pol III assembly for the simultaneous control of lagging and leading strands replication, since some Authors propose a dimeric model with two cores, whereas others have assembled in vitro a trimeric DNA Pol III with a third catalytic core, which increases the efficiency of DNA replication. Moreover, the function of the PHP domain, located at the N-terminus of α subunit, is still unknown. Previous studies hypothesized a possible pyrophosphatase activity, not confirmed yet. The present Thesis highlights by the first time the production in vivo of a trimeric E. coli DNA Pol III by co-expressing α, τ, ε and θ subunits. This trimeric complex has been enzymatically characterized and a molecular model has been proposed, with 2 α subunits sustaining the lagging-strand replication whereas the third core replicates the leading strand. In addition, the pyrophosphatase activity of the PHP domain has been confirmed. This activity involves, at least, the H12 and the D19 residues, whereas the D201 regulates phosphate release. On the other hand, an artificial polymerase (HoLaMa), designed by deleting the exonuclease domain of Klenow Fragment, has been expressed, purified and characterized for a better understanding of bacterial polymerases mechanism. The absence of exonuclease domain impaired enzyme processivity, since this domain is involved in DNA binding. Finally, Klenow enzyme, HoLaMa, α subunit and DNA Pol III αεθ have been characterized at the single-molecule level by FRET analysis, combining ALEX and TIRF microscopy. Fluorescently-labeled DNA molecules were immobilized, and changes in FRET efficiency enabled us to study polymerase binding and DNA polymerization.

Bioverkapselung lebender Bakterien (Escherichia coli) mit Poly-(Silicat) nach Transformation mit dem Silicatein-alpha-Gen

Die Bioverkapselung ist eine faszinierende Methode, um biologische Materialien einschließlich Zellen in Siliziumdioxid, Metalloxiden oder hybriden Sol-Gel-Polymeren zu immobilisieren. Bisher wurde nur die Sol-Gel-Vorläufertechnologie genutzt, um Bakterien- oder Hefezellen in Siliziumdioxid zu immobilisieren. Hierfür wurden verschiedene Reagenzien als wässrige Vorläufer getestet, um poly(Silicate) auf Biomolekülen (Bhatia et al., 2000) oder Zellen (Liu und Chen 1999; Coradin und Livage, 2007) zu bilden. Einer der erfolgreichsten bisherigen Methoden verwendet eine Mischung aus Silicaten und kolloidalem Silica. Diese initialen Vorläufer werden durch die Zugabe von Salzsäure neutralisiert, was die Gelbildung fortschreiten lässt und die Verkapselung von Bakterien in einem Silica-Netzwerk zur Folge hat (Nassif et al., 2003). Mit der Entdeckung von Silicatein, einem Enzym, das aus Demospongien isoliert wurde und die Bildung von poly(Silicat) katalysiert, wurde es möglich, poly(Silicat) unter physiologischen Bedingungen zu synthetisieren. Silicatein wurde rekombinant in E. coli hergestellt und ist in der Lage, bei Raumtemperatur, neutralem pH-Wert und in wässrigen Puffersystemen aus Siliziumalkoxiden poly(Silicat) zu bilden (Krasko et al., 2000; Müller et al., 2007b; Zhou et al., 1999). In vivo katalysiert Silicatein die Synthese der Silicathülle der Schwamm-Spiculae (Skelettelemente; Müller et al., 2005b; Müller et al., 2007a; Müller et al., 2007b; Schröder et al., 2007a). Dieses Biosilica wurde in Form von Silica-Nanospheren mit Durchmessern zwischen 100 nm und 250 nm organisiert vorgefunden (Pisera 2003; Tahir et al., 2005). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Escherichia coli erfolgreich mit dem Silicatein-Gen transformiert werden kann. Das Level der Proteinexpression kann in Anwesenheit von Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) effizient erhöht werden, indem man die Bakterienzellen gleichzeitig mit Kieselsäure inkubiert. Dieser Effekt konnte sowohl auf Ebene der Synthese des rekombinanten Proteins durch Western Blot als auch durch Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Das heterolog produzierte Silicatein besitzt enzymatische Aktivität und kann die Polymerisation von Kieselsäure katalysieren. Dies konnte sowohl durch Färbung mit Rhodamin123, als auch durch Reaktion der nicht polymerisierten, freien Kieselsäure mit dem ß-Silicomolybdato-Farbsystem (Silicomolybdänblau) nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass nur die silicateinexprimierenden Bakterien während des Wachstums in Anwesenheit von Kieselsäure eine viskose Hülle um Zelle herum bilden. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass Silicatein-α aus Suberites domuncula nach Transformation in E. coli an die Zelloberfläche dieser Zellen transportiert wurde und dort seine enzymatische Funktion beibehielt. Die Silicathülle wurde mittels Raster-Elektronenmikroskopie (REM) analysiert. Die Bakterien, die Silicatein exprimierten und poly(Silicat) an ihrer Oberfläche synthetisierten, zeigten die gleichen Wachstumsraten wie die Bakterien, die das Gen nicht enthielten. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die silicateinvermittelte Verkapselung von Bakterien mit poly(Silicat) die Bandbreite der Anwendung von Bakterien für die Produktion von rekombinanten Proteinen verbessern, erweitern und optimieren könnte.

Signalerkennung und Signaltransduktion im DctA,DcuS-Sensor-Regulatorkomplex von Escherichia coli.

E. coli ist in der Lage unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen C4-Dicarbonsäuren zur Energiekonservierung zu nutzen. Das DcuS/DcuR-Zweikomponentensystem detektiert diese und reguliert die Gene für den C4-Dicarboxylat-Transport und Metabolismus. Dabei hängt die Sensitivität der Sensorkinase DcuS für C4-Dicarbonsäuren von der Anwesenheit des aeroben Symporters DctA oder des anaeroben Antiporters DcuB ab. Diese bifunktionalen Transporter bilden mit DcuS über direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen Sensoreinheiten. In dieser Arbeit wurden die Funktionen von DctA und DcuS im DctA/DcuS-Sensorkomplex analysiert. Mit DctA(S380D) wurde eine Variante des Transporters identifiziert, in der die regulatorische Eigenschaft von der katalytischen Funktion entkoppelt ist. Stämme von E. coli, die den DctA(S380D)/DcuS-Sensorkomplex enthielten, waren in der Lage C4-Dicarbonsäuren wahrzunehmen, obwohl die Transportfunktion von DctA inaktiviert war. Zudem wurden Unterschiede in den Substratspektren von DctA und DcuS festgestellt. Citrat, ein guter Effektor des DctA/DcuS-Sensorkomplexes, wurde durch DctA nicht gebunden oder transportiert. Anhand von Titrationsexperimenten mit variierenden DctA-Mengen wurde außerdem nachgewiesen, dass die Sensitivität von DcuS für seine Effektoren von der DctA-Konzentration abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass DctA im DctA/DcuS-Sensorkomplex nicht an der Erkennung von C4-Dicarbonsäuren beteiligt ist. DcuS stellt die Signaleingangsstelle des Komplexes dar, während DctA durch seine Anwesenheit die Sensorkinase in eine funktionsbereite oder sensitive Form überführt, die auf Effektoren reagieren kann. Darüber hinaus wurde die Rolle der Transmembranhelices TM1 und TM2 von DcuS für die Funktion und Dimerisierung der Sensorkinase untersucht. Durch Sequenzanalysen wurden „SmallxxxSmall“-Motive, deren Relevanz als Dimerisierungsschnittstellen bereits in Transmembranhelices anderer Proteine nachgewiesen wurde, in TM1 sowie TM2 identifiziert. Die Homodimerisierung beider Transmembrandomänen wurde im GALLEX Two-Hybrid System nachgewiesen, wobei die TM2-TM2-Interaktion stärker war. Die Substitution G190A/G194A im SxxxGxxxG-Tandemmotiv von TM2 rief zudem einen deutlichen Funktionsverlust der Sensorkinase hervor. Dieser Aktivitätsverlust korrelierte mit Störungen der Homodimerisierung von TM2(G190A/G194A) sowie DcuS(G190A/G194A) bei bakteriellen Two-Hybrid Messungen im GALLEX- bzw. BACTH-System. Demzufolge agiert Transmembranhelix 2 mit seinem SxxxGxxxG-Sequenzmotiv als wesentliche Homodimerisierungsstelle in DcuS. Die Dimerisierung von DcuS ist essentiell für die Funktion der Histidinkinase. Zusätzlich wurde bei fluoreszenzmikroskopischen Studien durch Koexpression von DcuS bzw. DctA die zelluläre Kolokalisierung von DctA und DcuR mit DcuS sowie DauA mit DctA nachgewiesen. Die DctA/DcuS-Sensoreinheit kann demnach zum DauA/DctA/DcuS/DcuR-Komplex erweitert werden.

Signaltransduktion in der membranständigen Sensor-Histidinkinase DcuS von Escherichia coli

Escherichia coli kann unter aeroben und anaeroben Bedingungen mit C4-Dicarboxylaten wachsen, die Regulation des Stoffwechsels erfolgt durch das Zwei-Komponenten-System DcuSR. Die C4-Dicarboxylattransporter DctA (aerob) bzw. DcuB (anaerob) agieren als Co-Regulatoren und bilden gemeinsam mit der Sensor-Histidinkinase DcuS einen Sensorkomplex, in dem DcuS den Sensor darstellt und DctA bzw. DcuB diesen in seine rezeptive Form überführen. DcuS ist membranständig und verknüpft die Bindung von C4-Dicarboxylaten im Periplasma mit der Autophosphorylierung seiner Kinasedomäne im Cytoplasma. Dies stellt den Beginn einer Signalkaskade vom extrazellulären Reiz zum cytoplasmatischen Responseregulator DcuR dar.rnIn dieser Arbeit wurde die intramolekulare Signaltransduktion in DcuS und über die Membran untersucht. Der Fokus lag auf der Funktion der beiden Transmembranhelices TM1 und TM2 und der cytoplasmatischen PAS-Domäne, die die sensorische PASp- mit der effektorischen Kinasedomäne verbinden. Konformationsänderungen dieser Signalweiterleitung wurden durch Cysteinzugänglichkeitsstudien, oxidatives Cystein-Crosslinking und Mutageneseexperimente analysiert. rnTM2 wurde als der Überträger eines transmembranen Signals identifiziert, während TM1 als Membrananker fungiert. Der aktive Signalzustand von TM2 wird unabhängig von der Art der DcuS-Aktivierung (Effektorbindung, Deletion des Co-Regulators DctA oder PASc-ON-Mutationen) eingenommen. Der Signaltransduktion liegt eine Verschiebung von TM2 entlang ihrer Längsachse (Kolbenhub) in Richtung Periplasma zu Grunde. Cystein-Crosslinking offenbarte eine durchgehende Helix aus PASp-α6 und TM2, die im Dimer parallel mit ihrem Pendant verschoben wird. Die Amplitude des Kolbenhubs wurde anhand von Zugänglichkeitsveränderungen, der Lage verankernder Tryptophanreste, Strukturvergleichen und energetischen Berechnungen auf max. 4 - 6 Å festgelegt. Sie ist von der Effektorstärke abhängig und koppelt so die metabolische Bevorzugung einzelner Substrate an das Ausmaß des Kolbenhubs und der Genexpression. Für die cytoplasmatische PAS-Domäne wurde ein Zusammenhang zwischen lokaler Dimerisierung und Kontrolle der Sensorfunktion nachgewiesen. Schwächung der Dimerisierung führt zu einer Aktivierung der Sensorkinase. Es wurde eine hydrophobe Region identifiziert, deren strukturelle Integrität für diese Dimerisierung essentiell ist. Mit N248 wurde ein funktionell bedeutender Rest beschrieben, der auf Grund seiner Lage und seiner Eigenschaft mehrere Sekundärstrukturelemente zu verknüpfen, als Scharnier innerhalb der Domäne an der Umsetzung des Kolbenhubs in eine veränderte Quartärstruktur von PASc beteiligt sein könnte.

Escherichia coli variants in periprosthetic joint infection: diagnostic challenges with sessile bacteria and sonication

The diagnostic yield of prosthetic joint-associated infection is hampered by the phenotypic change of bacteria into a sessile and resistant form, also called biofilm. With sonication, adherent bacteria can be dislodged from the prosthesis. Species identification may be difficult because of their variations in phenotypic appearance and biochemical reaction. We have studied the phenotypic, genotypic, and biochemical properties of Escherichia coli variants isolated from a periprosthetic joint infection. The strains were collected from synovial fluid, periprosthetic tissue, and fluid from the explanted and sonicated prosthesis. Isolates from synovial fluid revealed a normal phenotype, whereas a few variants from periprosthetic tissue and all isolates from sonication fluid showed different morphological features (including small-colony variants). All isolates from sonication fluid were beta-galactosidase negative and nonmotile; most were indole negative. Because of further variations in biochemical properties, species identification was false or not possible in 50% of the isolates included in this study. In contrast to normal phenotypes, variants were resistant to aminoglycosides. Typing of the isolates using pulsed-field gel electrophoresis yielded nonidentical banding patterns, but all strains were assigned to the same clonal origin when compared with 207 unrelated E. coli isolates. The bacteria were repeatedly passaged on culture media and reanalyzed. Thereafter, most variants reverted to normal phenotype and regained their motility and certain biochemical properties. In addition, some variants displayed aminoglycoside susceptibility after reversion. Sonication of an explanted prosthesis allows insight into the lifestyle of bacteria in biofilms. Since sonication fluid also reveals dislodged sessile forms, species identification of such variants may be misleading.

Crystallization of Escherichia coli Catabolite Gene Activator Protein with its DNA Binding Site: The use of Modular DNA

To obtain crystals of the Escherichia coli catabolite gene activator protein (CAP) complexed with its DNA-binding site, we have searched for crystallization conditions with 26 different DNA segments ≥28 base-pairs in length that explore a variety of nucleotide sequences, lengths, and extended 5′ or 3′ termini. In addition to utilizing uninterrupted asymmetric lac site sequences, we devised a novel approach of synthesizing half-sites that allowed us to efficiently generate symmetric DNA segments with a wide variety of extended termini and lengths in the large size range (≥28 bp) required by this protein. We report three crystal forms that are suitable for X-ray analysis, one of which (crystal form III) gives measurable diffraction amplitudes to 3 Å resolution. Additives such as calcium, n-octyl-β-d-glucopyranoside and spermine produce modest improvements in the quality of diffraction from crystal form III. Adequate stabilization of crystal form III is unexpectedly complex, requiring a greater than tenfold reduction in the salt concentration followed by addition of 2-methyl-2,4-pentanediol and then an increase in the concentration of polyethylene glycol.

The copper-inducible ComR (YcfQ) repressor regulates expression of ComC (YcfR), which affects copper permeability of the outer membrane of Escherichia coli

The pathway of copper entry into Escherichia coli is still unknown. In an attempt to shed light on this process, a lux-based biosensor was utilized to monitor intracellular copper levels in situ. From a transposon-mutagenized library, strains were selected in which copper entry into cells was reduced, apparent as clones with reduced luminescence when grown in the presence of copper (low-glowers). One low-glower had a transposon insertion in the comR gene, which encodes a TetR-like transcriptional regulator. The mutant strain could be complemented by the comR gene on a plasmid, restoring luminescence to wild-type levels. ComR did not regulate its own expression, but was required for copper-induction of the neighboring, divergently transcribed comC gene, as shown by real-time quantitative PCR and with a promoter-lux fusion. The purified ComR regulator bound to the promoter region of the comC gene in vitro and was released by copper. By membrane fractionation, ComC was shown to be localized in the outer membrane. When grown in the presence of copper, ∆comC cells had higher periplasmic and cytoplasmic copper levels, compared to the wild-type, as assessed by the activation of the periplasmic CusRS sensor and the cytoplasmic CueR sensor, respectively. Thus, ComC is an outer membrane protein which lowers the permeability of the outer membrane to copper. The expression of ComC is controlled by ComR, a novel, TetR-like copper-responsive repressor.

Structure and function of the glucose PTS transporter from Escherichia coli

The glucose transporter IICB of the Escherichia coli phosphotransferase system (PTS) consists of a polytopic membrane domain (IIC) responsible for substrate transport and a hydrophilic C-terminal domain (IIB) responsible for substrate phosphorylation. We have overexpressed and purified a triple mutant of IIC (mut-IIC), which had recently been shown to be suitable for crystallization purposes. Mut-IIC was homodimeric as determined by blue native-PAGE and gel-filtration, and had an eyeglasses-like structure as shown by negative-stain transmission electron microscopy (TEM) and single particle analysis. Glucose binding and transport by mut-IIC, mut-IICB and wildtype-IICB were compared with scintillation proximity and in vivo transport assays. Binding was reduced and transport was impaired by the triple mutation. The scintillation proximity assay allowed determination of substrate binding, affinity and specificity of wildtype-IICB by a direct method. 2D crystallization of mut-IIC yielded highly-ordered tubular crystals and made possible the calculation of a projection structure at 12Å resolution by negative-stain TEM. Immunogold labeling TEM revealed the sidedness of the tubular crystals, and high-resolution atomic force microscopy the surface structure of mut-IIC. This work presents the structure of a glucose PTS transporter at the highest resolution achieved so far and sets the basis for future structural studies.