Linfoma renale del gatto:rilievi anatomopatologici, immunofenotipizzazione delle popolazioni linfocitarie ed espressione tissutale dell'antigene virale FeLV gp70.

Riassunto Il linfoma è una delle neoplasie più diffuse nel gatto. Questa neoplasia è stata classificata in base alla localizzazione anatomica nella forma Mediastinica (che interessa il timo e/o i linfonodi mediastinici), Alimentare, Multicentrica (che interessa diversi linfonodi e/o la milza e/o il fegato, Extranodale (che coinvolge i reni, SNC o la cute). Le cellule neoplastiche sono caratterizzate da diverse sottopopolazioni, che sono definite tramite immunofenotipizzazione ottenuta mediante tecniche immunoistochimiche (IHC), così che possano essere classificate come cellule B o T o non B/non T. I gatti infetti dal virus della leucemia felina (FeLV, Gammaretrovirus) presentano elevata incidenza di linfomi rispetto ai gatti non infetti. I meccanismi proposti di sviluppo neoplastico sono mutagenesi inserzionali o stimolazione persistente delle cellule immunitarie dell’ospite da parte di antigeni virali, i quali possono promuovere la trasformazione in senso maligno dei linfociti. Lo scopo di questo lavoro è stato esaminare i rilievi patologici, l’espressione di FeLV e l’immonofenotipo (B, T, nonB/nonT) nei reni felini affetti da linfoma. Abbiamo effettuato colorazione Ematossilina- Eosina ed Immunoistochimica per FeLV gp70, CD3 e CD79. Nello studio sono stati inclusi i tessuti di 49 gatti presentati all’Unità Operativa di Anatomia Patologica e Patologia Generale del Dipartimento di Scienze Medico Veterinarie dell’Università degli studi di Parma. Il 39% dei casi (19/49) sono caratterizzati dalla presenza di lesioni linfomatose a livello renale. Questa popolazione è costituita dal 52,6% 3 (10/19) maschi e dal 47,4% (9/19) femmine. L’età è compresa tra 8 mesi e 17 anni ed in particolare 26,6% (5/19) sono giovani (0-2 anni), 47,4% (9/19) sono adulti (2-10 anni) e 26,3% (5/19) sono anziani (>10 anni). Per quanto riguarda la classificazione anatomica la forma renale appare primitiva in 5 casi (25%), in 8 casi (42%) appare secondaria a linfomi multicentrici, in 3 casi (15,7%) a linfomi mediastinici e in altri 3 casi (15,7%) a linfomi gastrici e intestinali. Per quanto riguarda l’immunofenotipizzazione sono risultati CD3 positivi il 73,7% (14/19) e CD3 negativi il 27,3% (5/19); CD79 alpha positivi il 26,3% (5/19) e CD79 alpha negativi il 73,7% (14/19); l’espressione della proteina gp70 è stata individuata nel 78,9% (15/19) delle neoplasie renali, mentre il 21,1% (4/19) non presentava espressione della proteina. Nei 4 anni presi in considerazione nello studio si evince un’elevata incidenza della localizzazione anatomica renale sul totale di linfomi osservati. Non si è notata correlazione statistica tra linfomi renali, età e sesso dei soggetti presi in esame ma vi è un’elevata percentuale di animali adulti ed anziani affetti dalla patologia. Nella valutazione fenotipica dell’infiltrato neoplastico si è osservata l’elevata espressione di CD3, caratterizzando i linfociti come appartenenti alla sottopopolazione T. Inoltre si è evidenziato come un elevato numero di cellule neoplastiche esprimano gp70; ciò permette di affermare che i linfociti neoplastici sono infettati dal virus FeLV, il quale inoltre è in attiva replicazione. I marker CD3 e gp70 sono risultati fortemente correlati statisticamente; si può affermare perciò che l’espansione clonale dei linfociti T è correlata alla presenza e replicazione del virus.

Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

A influência do cão na expressividade emocional de crianças com transtorno do espectro do autismo

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) inclui um conjunto de sintomas, tais como dificuldade para sustentar contato visual direto e comprometimento da linguagem. Apesar da Terapia Assistida Por Animais (TAA) com cães ser considerada uma modalidade terapêutica eficaz para promover o desenvolvimento de pessoas com TEA, ainda não são se sabe quais características dos cães possibilitam alcançar sucesso na terapia. Esta análise quantitativa tem como objetivo verificar o impacto de abordagens laterais e frontais de cães e humanos nas expressões emocionais de alegria e rejeição de crianças com TEA. Através da análise de vídeos de TAA, foram mensuradas duração e frequência das abordagens laterais e frontais de cães e humanos dirigidas às crianças para comparar possíveis diferenças entre ambos e também para verificar se a abordagem escolhida afetava o tipo de expressão emocional exibida pela criança. Os participantes deste projeto foram 11 crianças, 8 do sexo masculino e 3 do sexo feminino, entre 5 e 11 anos. Seis crianças foram atendidas por uma psicóloga, uma condutora e um Border Collie. O segundo grupo era composto pela mesma psicóloga, uma condutora e uma Golden Retriever. Escalas de avaliação foram aplicadas para confirmar o diagnóstico de TEA. Os cães foram previamente avaliados e treinados por uma instituição que atua na área de TAA. Cinco minutos de 8 sessões foram analisadas: um bloco de seis sessões com o cão, uma sessão anterior e uma sessão posterior a este bloco. Para verificar possíveis diferenças temperamentais entre cães, o C-barq (Canine Behavioral Assesment & Research Questionnaire) foi aplicado para analisar o temperamento de ambos. Embora esta análise tenha demonstrado diferenças em relação às categorias busca de atenção e nível de energia dos cães, não foram verificadas diferenças estatísticas entre os cães, em relação às variáveis analisadas neste estudo. Na comparação entre cães e humanos, os cães foram mais efetivos para conseguir expressões de alegria independentemente do tipo de abordagem escolhida. Comparando-se o tempo de abordagem de cães e humanos até obterem expressão emocional das crianças, observou-se uma importante diferença estatística. Os resultados sugerem que os cães exibiram menor latência que humanos para todas expressões emocionais analisadas: alegria (2= 7,312, p=0,007), de rejeição (2= 11,277, p-0,001) e neutras (2=9,097, p=0,043). Além disso, os resultados sugerem que, no contexto da TAA, não há relação entre abordagem lateral ou frontal e expressões de alegria, rejeição ou neutras de crianças com TEA. As expressões de alegria foram mais frequentes diante das abordagens laterais dos cães do que das abordagens frontais, no entanto não foi verificada significância estatística. Em relação aos humanos também não foi verificada preferência por uma abordagem especifica. Assim, os resultados sugerem que a latência para a exibição de uma expressão emocional das crianças depende mais de quem aborda do que do posicionamento lateral ou frontal quando a abordagem é realizada

Ciliary muscle in avian is derived from mesenchymal and epithelial cells

It has long been maintained that the ciliary muscle derives from mesenchymal cells. The embryonic development of the avian ciliary muscle was studied in chick embryos from stage 25 HH to the time of hatching. Serial sections of the eye were stained routinely or immunocytochemically using the monoclonal antibody 13F4, which recognizes a cytoplasmic antigen specific for all types of muscle cells. We found that the mesenchymal immunoreactive cells, at stage 37 HH, are arranged in two distinct orientations forming the anterior and posterior portions of the ciliary muscle. At stages 38 and 39 HH the pigmented epithelium contained 13F4 positive cells, which detach from the epithelium and apparently migrate into stroma. These epithelial cells may differentiate into muscle cells. Within this same time period a progressive accumulation of myoblasts was detected between the pigmented epithelium and the ciliary muscle. Some myoblasts containing melanin were also observed. At stage 40 HH the internal portion of the ciliary muscle was visible. These findings indicate that the immunopositive epithelial cells participate in the formation of the internal portion of the muscle. We conclude that the ciliary muscle derives not only from the mesenchymal cells but also from the pigmented epithelium.

The white gene and locomotor recovery from anoxia in Drosophila melanogaster

Locomotor recovery from anoxia is complicated and little is known about the molecular and cellular mechanisms regulating anoxic recovery in Drosophila. For this thesis I established a protocol for large-scale analysis of locomotor activity in adult flies with exposure to a transient anoxia. Using this protocol I observed that wild-type Canton-S flies recovered faster and more consistently from anoxia than the white-eyed mutant w1118, which carries a null allele of w1118 in an isogenic genetic background. Both Canton-S and w1118 are commonly used controls in the Drosophila community. Genetic analysis including serial backcrossing, RNAi knockdown, w+ duplication to Y chromosome as well as gene mutation revealed a strong association between the white gene and the timing of locomotor recovery. I also found that the locomotor recovery phenotype is independent of white-associated eye pigmentation, that heterozygous w+ allele was haplo-insufficient to induce fast and consistent locomotor recovery from anoxia in female flies, and that mini-white is insufficient to promote fast and consistent locomotor recovery. Moreover, locomotor recovery was delayed in flies with RNAi knockdown of white in subsets of serotonin neurons in the central nervous system. I further demonstrated that mutations of phosphodiesterase genes (PDE) displayed wild-type-like fast and consistent locomotor recovery, and that locomotor recovery was light-sensitive in the night in w1118. The delayed locomotor recovery and the light sensitivity were eliminated in PDE mutants that were dual-specific or cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-specific. Up-regulation of cGMP using multiple approaches including PDE mutation, sildenafil feeding or specific expression of an atypical soluble guanylyl cyclase (Gyc88E) was sufficient to suppress w-RNAi induced delay of locomotor recovery. Taken together, these data strongly support the hypothesis that White transports cGMP and promotes fast and consistent locomotor recovery from anoxia.

Light sheet fluorescence microscopy for in situ cell interaction analysis in mouse lymph nodes.

Reactive lymph nodes (LNs) are sites where pMHC-loaded dendritic cells (DCs) interact with rare cognate T cells, leading to their clonal expansion. While DC interactions with T cell subsets critically shape the ensuing immune response, surprisingly little is known on their spatial orchestration at physiologically T cell low precursor frequencies. Light sheet fluorescence microscopy and one of its implementations, selective plane illumination microscopy (SPIM), is a powerful method to obtain precise spatial information of entire organs of 0.5-10mm diameter, the size range of murine LNs. Yet, its usefulness for immunological research has thus far not been comprehensively explored. Here, we have tested and defined protocols that preserve fluorescent protein function during lymphoid tissue clearing required for SPIM. Reconstructions of SPIM-generated 3D data sets revealed that calibrated numbers of adoptively transferred T cells and DCs are successfully detected at a single cell level within optically cleared murine LNs. Finally, we define parameters to quantify specific interactions between antigen-specific T cells and pMHC-bearing DCs in murine LNs. In sum, our studies describe the successful application of light sheet fluorescence microscopy to immunologically relevant tissues.

Understanding human genome regulation through entropic graph-based regularization and submodular optimization

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-06

Endothelial cell serine proteases expressed during vascular morphogenesis and angiogenesis

Many serine proteases play important regulatory roles in complex biological systems, but only a few have been linked directly with capillary morphogenesis and angiogenesis. Here we provide evidence that serine protease activities, independent of the plasminogen activation cascade, are required for microvascular endothelial cell reorganization and capillary morphogenesis in vitro. A homology cloning approach targeting conserved motifs present in all serine proteases, was used to identify candidate serine proteases involved in these processes, and revealed 5 genes (acrosin, testisin, neurosin, PSP and neurotrypsin), none of which had been associated previously with expression in endothelial cells. A subsequent gene-specific RT-PCR screen for 22 serine proteases confirmed expression of these 5 genes and identified 7 additional serine protease genes expressed by human endothelial cells, urokinase-type plasminogen activator, protein C,TMPRSS2, hepsin, matriptase/ MT-SPI, dipepticlylpepticlase IV, and seprase. Differences in serine protease gene expression between microvascular and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were identified and several serine protease genes were found to be regulated by the nature of the substratum, ie. artificial basement membrane or fibrillar type I collagen. mRNA transcripts of several serine protease genes were associated with blood vessels in vivo by in situ hybridization of human tissue specimens. These data suggest a potential role for serine proteases, not previously associated with endothelium, in vascular function and angiogenesis.

The mouse sulfate anion transporter gene Sat1 (Slc26a1): Cloning, tissue distribution, gene structure, functional characterization, and transcriptional regulation by thyroid hormone

Sulfate (SO42-) is required for bone/cartilage formation and cellular metabolism. sat-1 is a SO42- anion transporter expressed on basolateral membranes of renal proximal tubules, and is suggested to play an important role in maintaining SO42- homeostasis. As a first step towards studying its tissue-specific expression, hormonal regulation, and in preparation for the generation of knockout mice, we have cloned and characterized the mouse sat-1 cDNA (msat-1), gene (sat1; Slc26a1) and promoter region. msat-1 encodes a 704 amino acid protein (75.4 kDa) with 12 putative transmembrane domains that induce SO42- (also oxalate and chloride) transport in Xenopus oocytes. msat-1 mRNA was expressed in kidney, liver, cecum, calvaria, brain, heart, and skeletal muscle. Two distinct transcripts were expressed in kidney and liver due to alternative utilization of the first intron, corresponding to an internal portion of the 5'-untranslated region. The Sa1 gene (similar to6 kb) consists of 4 exons. Its promoter is similar to52% G+C rich and contains a number of well-characterized cis-acting elements, including sequences resembling hormone responsive elements T3REs and VDREs. We demonstrate that Sat1 promoter driven basal transcription in OK cells was stimulated by tri-iodothyronine. Site-directed mutagenesis identified an imperfect T3RE at -454-bp in the Sat1 promoter to be responsible for this activity. This study represents the first characterization of the structure and regulation of the Sat1 gene encoding a SO42-/chloride/oxalate anion transporter.

Development of lipid-core-peptide (LCP) based vaccines for the prevention of the group A streptococcal (GAS) infection

Traditional vaccines consisting of whole attenuated micro-organisms. or microbial components administered with adjuvant, have been demonstrated as one of the most cost-effective and successful public health interventions. Their use in large scale immunisation programs has lead to the eradication of smallpox, reduced morbidity and mortality from many once common diseases, and reduced strain on health services. However, problems associated with these vaccines including risk of infection. adverse effects, and the requirement for refrigerated transport and storage have led to the investigation of alternative vaccine technologies. Peptide vaccines, consisting of either whole proteins or individual peptide epitopes, have attracted much interest, as they may be synthesised to high purity and induce highly specific immune responses. However, problems including difficulties stimulating long lasting immunity. and population MHC diversity necessitating multiepitopic vaccines and/or HLA tissue typing of patients complicate their development. Furthermore, toxic adjuvants are necessary to render them immunogenic. and as such non-toxic human-compatible adjuvants need to be developed. Lipidation has been demonstrated as a human compatible adjuvant for peptide vaccines. The lipid-core-peptide (LCP) system. incorporating lipid adjuvant, carrier, and peptide epitopes, exhibits promise as a lipid-based peptide vaccine adjuvant. The studies reviewed herein investigate the use of the LCP system for developing vaccines to protect against group A streptococcal (GAS) infection. The studies demonstrate that LCP-based GAS vaccines are capable of inducing high-titres of antigen specific IgG antibodies. Furthermore. mice immunised with an LCP-based GAS vaccine were protected against challenge with 8830 strain GAS.

Prevention of Cervical Cancer Through Papillomavirus Vaccination

A subset of human papillomaviruses (HPVs) promote anogenital malignancy, including cervical cancer, and prevention and treatment strategies that reflect the causal role of HPV are being developed. Vaccines based on HPV virus-like particles induce genotype-specific virus-neutralizing antibody and prevent infection with HPV1. Persistent papillomavirus infection is required for the development of papillomavirus-associated cancer and, therefore, therapeutic vaccines are being developed to eliminate established papillomavirus infection. Such vaccines test principles for the growing field of tumour-antigen-specific immunotherapy. This article reviews progress in the field and draws conclusions for the development of future prophylactic and therapeutic viral vaccines.

Functional memory CD8+ T cells can be generated in vivo without evident T help

Synthetic cytotoxic T cell (CTL) epitope peptides provide an effective and safe means of vaccination against cancers and viruses, as these peptides can induce specific CD8+ effector T cells in vivo. However, the effector CD8+ T cells induced by the minimal CTL epitope peptides do not last past about 3 weeks after the induction and no functional memory CD8+ T cells are generated. It is held that simultaneous induction of CD4+ T cells by incorporating peptides containing T-helper epitopes in the vaccine at the time of primary vaccination are necessary for the induction of long-lived functional memory CD8+ T cells. We now report that, surprisingly, incorporation of medium length (>20 AA) peptides devoid of detectable T-helper epitopes in a minimal CTL epitope-based vaccine can also induce long-lasting! functional rumour antigen specific memory CD8+ T cells that are capable of promoting protection against tumour challenge. This observation may have implications for the formulation of therapeutic anti-cancer and anti-virus peptide vaccines where a strong induction of CD4 T help would be undesirable. (C) 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Changes to peptide structure, not concentration, contribute to expansion of the lowest avidity cytotoxic T lymphocytes

The efficient in vitro expansion of antigen-specific CD8(+) cytotoxic T lymphocytes (CTL) for use in adoptive immunotherapy represents an important clinical goal. Furthermore, the avidity of expanded CTL populations often correlates closely with clinical outcome. In our study, high-avidity CTL lines could be expanded ex vivo from an antigen-primed animal using low peptide concentration, and intermediate peptide concentrations favored the generation of lower avidity CTL. Further increases in peptide concentration during culture inhibited the expansion of all peptide-specific CD8(+) cells. In contrast, a single amino acid variant peptide efficiently generated functional CTL populations at high or low peptide concentration, which responded to wild-type epitope with the lowest average avidity seen in this study. We propose that for some peptides, the efficient generation of low-avidity CTL responses will be favored by stimulation with altered peptide rather than high concentrations of wild-type epitope. In addition, some variant peptides designed to have improved binding to major histocompatibility complex class I may reduce rather than enhance the functional avidity for the wild-type peptide of ex vivo-expanded CTL. These observations are relevant to in vitro expansion of CTL for immunotherapy and strategies to elicit regulatory or therapeutic immunity to neo-self-antigen when central tolerance has eliminated high-avidity, cognate T cells.

Use of multiple biomarkers for a molecular diagnosis of prostate cancer

The identification of biomarkers capable of providing a reliable molecular diagnostic test for prostate cancer (PCa) is highly desirabie clinically. We describe here 4 biomarkers, UDP-N-Acetyl-alpha-D-galactosamine transferase (GalNAc-T3; not previously associated with PCa), PSMA, Hepsin and DD3/PCA3, which, in combination, distinguish prostate cancer from benign prostate hyperplasia (BPH). GalNAc-T3 was identified as overexpressed in PCa tissues by microarray analysis, confirmed by quantitative real-time PCR and shown immunohistochemically to be localised to prostate epithelial cells with higher expression in malignant cells. Real-time quantitative PCR analysis across 21 PCa and 34 BPH tissues showed 4.6-fold overexpression of GalNAc-T3 (p = 0.005). The noncoding mRNA (DD3/PCA3) was overexpressed 140-fold (p = 0.007) in the cancer samples compared to BPH tissues. Hepsin was overexpressed 21-fold (p = 0.049, whereas the overexpression for PSMA was 66-fold (p = 0.047). When the gene expression data for these 4 biomarkers was combined in a logistic regression model, a predictive index was obtained that distinguished 100% of the PCa samples from all of the BPH samples. Therefore, combining these genes in a real-time PCR assay represents a powerful new approach to diagnosing PCa by molecular profiling. (c) 2005 Wiley-Liss, Inc.

C/EBP delta and C/EBP gamma bind the CCAAT-box in the human beta-globin promoter and modulate the activity of the CACC-box binding protein, EKLF

Developmental- and tissue-specific expression of globin genes is mediated by a few key elements within the proximal promoter of each gene. DNA-binding assays previously identified NF-Y, GATA-1, C/EBP beta and C/EBP gamma as candidate regulators of beta-globin transcription via the CCAAT-box, a promoter element situated between CACC- and TATA-boxes. We have identified C/EBP delta as an additional beta-globin CCAAT-box binding protein. In reporter assays, we show that C/EBP delta can co-operate with EKLF, a CACC-box binding protein, to activate the beta-globin promoter, whereas C/EBP gamma inhibits the transcriptional activity of EKLF in this assay. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.