Molekularzytogenetische Untersuchungen an Nierenzelltumoren des Menschen

Nierenkarzinome (NZK) des Erwachsenenalters weisen nebenhistologisch-zytologischen Merkmalen typische genetischeCharakteristika auf, die mit dem biologischen Verhalten derTumorzellen korrelieren. Der Nachweis genomischerVeränderungen wird zur Diagnostik und Prognoseeinschätzungvon Tumoren herangezogen. Für die untersuchtenNierentumorerkrankungen wurden lediglich das vonHippel-Lindau Tumorsuppressorgen (VHL) auf Chromosom 3 oderdas MET Proto-Onkogen auf Chromosom 7 als gesichertepathogenetische Faktoren in der Entstehung von NZKidentifiziert. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitragzur molekularen Charakterisierung derNierentumor-Pathogenese. Die gewählten Ansätze umfassen: (A)Die Analyse 91 primärer Nierentumoren mit CGH (comparativegenomic hybridization), (B) die Untersuchung chromosomalerBruchpunkte eines komplex rearrangierten, familiärenNZK-Falles und (C) die Charakterisierung umschriebenerGenomveränderungen im Bereich des VHL-Lokus auf Chromosom 3p25 .(A) Chromosomen-Aberrationen wurden identifiziert undeingegrenzt. Das Auftreten spezifischer chromosomalerAberrationen konnte mit dem dokumentierten Krankheitsverlaufassoziiert werden. Die als progressionsassoziiert oderprognoserelevant identifizierten Chromosomen(bereiche)5(q22-qter), 4, 10, 14q, 17, 6, 8, 9, 12 können alsAusgangspunkte für eine Suche nach subtypspezifischen,relevanten Tumorgenen dienen. (B) Chromosomenanalysen einerFamilie mit Veranlagung für das klarzellige NZK belegteneine Translokation zwischen den Chromosomen 3 und 8 imperipheren Patientenblut. Weitere molekularzytogenetischeUntersuchungen deckten ein komplexes chromosomalesRearrangement t(3;8)(q13.1;p21.1) auf. (C) DieFeinkartierung der Region um den VHL-Genlokus istinsbesondere bei Tumoren ohne molekulargenetischnachzuweisenden VHL-Verlust erforderlich. Zur Identifikationweiterer in dieser Region kartierender, evtl. ko-deletierterTumorsuppressor-Kandidatengene, wurden genomische(PAC)-Sonden isoliert, charakterisiert und zurDeletionskartierung eingesetzt.

Mechanismen der Caveolin-Genregulation in neuralen Zellsystemen

Caveolae sind vesikuläre Invaginationen der eukaryontischen Zellmembran, die bei einer Vielzahl zellbiologischer Prozesse eine bedeutende Rolle spielen. Die strukturellen und funktionellen Hauptbestandteile der Caveolae sind die Caveolin-Proteine, welche von drei homologen Genen (Caveolin-1,-2,-3) kodiert werden. Die Caveoline stellen die Struktur-Organisatoren der Caveolae dar, und regulieren direkt die Aktivität von zahlreichen Caveolae-assoziierten Rezeptorproteinen und Signalmolekülen. Oftmals werden die pleiotropen Effekte der Caveoline über eine Veränderung der Caveolin-Genexpressionsstärke moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche biologische Steuerfaktoren identifiziert, unter deren Kontrolle die Caveolin-Genexpression in neuralen Zellsystemen steht. Bei diesen Faktoren handelt es sich um das Steroidhormon Oestrogen und seine Rezeptoren, den Wachstumsfaktor TGFa und den sekundären Botenstoff zyklisches AMP (cAMP). Oestrogen wirkt über die Aktivierung von Oestrogen-Rezeptoren (ERs) im zentralen Nervensystem in der Regel als neurotropher Faktor. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, daß in humanen Neuroblastom-Zellen (SK-N-MC) die stabile, rekombinante Expression des ERa-Subtyps zu einer drastischen Reduktion der Caveolin-1/-2-Transkription führt, und daß in der Folge die zelluläre Caveolin-Biosynthese eingestellt wird. Eine Analyse des Caveolin-1-Gens ergab, daß einhergehend mit der Inaktivierung der Caveolin-1-Transkription eine Vielzahl der im Promoter enthaltenen CpG-Dinukleotide methyliert vorliegen. Durch pharmakologische Inhibition der nukleären DNA-Methyltransferasen sowie der Histon-Deacetylasen konnte die Caveolin-1-Transkription teilweise wiederhergestellt werden. Diese Befunde lassen auf die Existenz eines DNA-Methylierungs-abhängigen Stilllegungsmechanismus der Caveolin-Genexpression durch ERa schließen. Dagegen führte die Überexpression des ERb-Subtyps in SK-N-MC-Zellen zu keiner Veränderung der Caveolin-1/-2-Expression. Interessanterweise wurde die supprimierende Wirkung des ERa durch die gleichzeitige Überexpression des ERb vollständig aufgehoben. Der mitogene Wachstumsfaktor TGFa wurde als zweites extrazelluläres Signalmolekül identifiziert, welches eine Reduktion der Caveolin-1/-2-Genexpression bewirkt. In primären kortikalen Astrozyten konnte gezeigt werden, daß TGFa seine supprimierende Wirkung auf die Caveolin-1-Expression partiell über die Aktivierung des PI3-Kinase-abhängigen Signalweges vermittelt. Zudem wurde die supprimierende Wirkung von TGFa durch einen Inhibitior der Histon-Deacetylasen relativiert. Daher scheinen sowohl für den ERa als auch für TGFa epigenetische Prozesse bei der Suppression der Caveolin-1-Genexpression eine entscheidende Rolle zu spielen. Intrazellulär wirkte neben der PI3-Kinase auch der Botenstoff cAMP in kortikalen Astrozyten als Suppressor der Caveolin-Genexpression. Es wäre denkbar, daß die Caveolin-Suppression funktioneller Bestandteil des seit langem etablierten Effekts der cAMP-induzierten Astrozyten-Differenzierung ist. Desweiteren wiesen der cAMP- und TGFa-abhängige Signalweg ein überlappendes, Gehirnregion-spezifisches Regulationsprofil der Caveolin-Expression in Astrozyten auf: während in Kortex und Striatum eine Regulation durch cAMP und TGFa erfolgte, blieb diese in Klein- und Zwischenhirn aus. Somit bewirken drei zentrale regulatorische Faktoren der Proliferation und Differenzierung neuraler Zellen eine Reduktion in der Konzentration der pleiotrop funktionellen Caveoline. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit die reduzierte Caveolin-Expression für die morphologischen und biochemischen Primärwirkungen dieser Faktoren während der Entwicklung und im Zuge der Tumorgenese mitverantwortlich ist. Außerdem könnten über die Beobachtungen der zellbiologischen Auswirkungen reduzierter Caveolin-Spiegel neue Erkenntnisse über die Funktion dieser Proteine gewonnen werden.

Depicting the role of CDKN2A/ARF alterations in adult BCR-ABL1-positive acute lymphoblastic leukemia patients: from genomic deletions to prognostic impact

This 9p21 locus, encode for important proteins involved in cell cycle regulation and apoptosis containing the p16/CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2a) tumor suppressor gene and two other related genes, p14/ARF and p15/CDKN2B. This locus, is a major target of inactivation in the pathogenesis of a number of human tumors, both solid and haematologic, and is a frequent site of loss or deletion also in acute lymphoblastic leukemia (ALL) ranging from 18% to 45% 1. In order to explore, at high resolution, the frequency and size of alterations affecting this locus in adult BCR-ABL1-positive ALL and to investigate their prognostic value, 112 patients (101 de novo and 11 relapse cases) were analyzed by genome-wide single nucleotide polymorphisms arrays and gene candidate deep exon sequencing. Paired diagnosis-relapse samples were further available and analyzed for 19 (19%) cases. CDKN2A/ARF and CDKN2B genomic alterations were identified in 29% and 25% of newly diagnosed patients, respectively. Deletions were monoallelic in 72% of cases and in 43% the minimal overlapping region of the lost area spanned only the CDKN2A/2B gene locus. The analysis at the time of relapse showed an almost significant increase in the detection rate of CDKN2A/ARF loss (47%) compared to diagnosis (p = 0.06). Point mutations within the 9p21 locus were found at very low level with only a non-synonymous substition in the exon 2 of CDKN2A. Finally, correlation with clinical outcome showed that deletions of CDKN2A/B are significantly associated with poor outcome in terms of overall survival (p = 0.0206), disease free-survival (p = 0.0010) and cumulative incidence of relapse (p = 0.0014). The inactivation of 9p21 locus by genomic deletions is a frequent event in BCR-ABL1-positive ALL. Deletions are frequently acquired at the leukemia progression and work as a poor prognostic marker.

Reverse genetic studies of Benyvirus - Polymyxa betae molecular interaction: Role of the RNA4-encoded protein in virus transmission

Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), the leading infectious agent that affects sugar beet, is included within viruses transmitted through the soil from plasmodiophorid as Polymyxa betae. BNYVV is the causal agent of Rhizomania, which induces abnormal rootlet proliferation and is widespread in the sugar beet growing areas in Europe, Asia and America; for review see (Peltier et al., 2008). In this latter continent, Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) has been identified (Lee et al., 2001) and belongs to the benyvirus genus together with BNYVV, both vectored by P. betae. BSBMV is widely distributed only in the United States and it has not been reported yet in others countries. It was first identified in Texas as a sugar beet virus morphologically similar but serologically distinct to BNYVV. Subsequent sequence analysis of BSBMV RNAs evidenced similar genomic organization to that of BNYVV but sufficient molecular differences to distinct BSBMV and BNYVV in two different species (Rush et al., 2003). Benyviruses field isolates usually consist of four RNA species but some BNYVV isolates contain a fifth RNA. RNAs -1 contains a single long ORF encoding polypeptide that shares amino acid homology with known viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) and helicases. RNAs -2 contains six ORFs: capsid protein (CP), one readthrough protein, triple gene block proteins (TGB) that are required for cell-to-cell virus movement and the sixth 14 kDa ORF is a post-translation gene silencing suppressor. RNAs -3 is involved on disease symptoms and is essential for virus systemic movement. BSBMV RNA-3 can be trans-replicated, trans-encapsidated by the BNYVV helper strain (RNA-1 and -2) (Ratti et al., 2009). BNYVV RNA-4 encoded one 31 kDa protein and is essential for vector interactions and virus transmission by P. betae (Rahim et al., 2007). BNYVV RNA-5 encoded 26 kDa protein that improve virus infections and accumulation in the hosts. We are interest on BSBMV effect on Rhizomania studies using powerful tools as full-length infectious cDNA clones. B-type full-length infectious cDNA clones are available (Quillet et al., 1989) as well as A/P-type RNA-3, -4 and -5 from BNYVV (unpublished). A-type BNYVV full-length clones are also available, but RNA-1 cDNA clone still need to be modified. During the PhD program, we start production of BSBMV full-length cDNA clones and we investigate molecular interactions between plant and Benyviruses exploiting biological, epidemiological and molecular similarities/divergences between BSBMV and BNYVV. During my PhD researchrs we obtained full length infectious cDNA clones of BSBMV RNA-1 and -2 and we demonstrate that they transcripts are replicated and packaged in planta and able to substitute BNYVV RNA-1 or RNA-2 in a chimeric viral progeny (BSBMV RNA-1 + BNYVV RNA-2 or BNYVV RNA-1 + BSBMV RNA-2). During BSBMV full-length cDNA clones production, unexpected 1,730 nts long form of BSBMV RNA-4 has been detected from sugar beet roots grown on BSBMV infected soil. Sequence analysis of the new BSBMV RNA-4 form revealed high identity (~100%) with published version of BSBMV RNA-4 sequence (NC_003508) between nucleotides 1-608 and 1,138-1,730, however the new form shows 528 additionally nucleotides between positions 608-1,138 (FJ424610). Two putative ORFs has been identified, the first one (nucleotides 383 to 1,234), encode a protein with predicted mass of 32 kDa (p32) and the second one (nucleotides 885 to 1,244) express an expected product of 13 kDa (p13). As for BSBMV RNA-3 (Ratti et al., 2009), full-length BSBMV RNA-4 cDNA clone permitted to obtain infectious transcripts that BNYVV viral machinery (Stras12) is able to replicate and to encapsidate in planta. Moreover, we demonstrated that BSBMV RNA-4 can substitute BNYVV RNA-4 for an efficient transmission through the vector P. betae in Beta vulgaris plants, demonstrating a very high correlation between BNYVV and BSBMV. At the same time, using BNYVV helper strain, we studied BSBMV RNA-4’s protein expression in planta. We associated a local necrotic lesions phenotype to the p32 protein expression onto mechanically inoculated C. quinoa. Flag or GFP-tagged sequences of p32 and p13 have been expressed in viral context, using Rep3 replicons, based on BNYVV RNA-3. Western blot analyses of local lesions contents, using FLAG-specific antibody, revealed a high molecular weight protein, which suggest either a strong interaction of BSBMV RNA4’s protein with host protein(s) or post translational modifications. GFP-fusion sequences permitted the subcellular localization of BSBMV RNA4’s proteins. Moreover we demonstrated the absence of self-activation domains on p32 by yeast two hybrid system approaches. We also confirmed that p32 protein is essential for virus transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3 and we investigated its role by the use of different deleted forms of p32 protein. Serial mechanical inoculation of wild-type BSBMV on C. quinoa plants were performed every 7 days. Deleted form of BSBMV RNA-4 (1298 bp) appeared after 14 passages and its sequence analysis shows deletion of 433 nucleotides between positions 611 and 1044 of RNA-4 new form. We demonstrated that this deleted form can’t support transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3, moreover we confirmed our hypothesis that BSBMV RNA-4 described by Lee et al. (2001) is a deleted form. Interesting after 21 passages we identifed one chimeric form of BSBMV RNA-4 and BSBMV RNA-3 (1146 bp). Two putative ORFs has been identified on its sequence, the first one (nucleotides 383 to 562), encode a protein with predicted mass of 7 kDa (p7), corresponding to the N-terminal of p32 protein encoded by BSBMV RNA-4; the second one (nucleotides 562 to 789) express an expected product of 9 kDa (p9) corresponding to the C-terminal of p29 encoded by BSBMV RNA-3. Results obtained by our research in this topic opened new research lines that our laboratories will develop in a closely future. In particular BSBMV p32 and its mutated forms will be used to identify factors, as host or vector protein(s), involved in the virus transmission through P. betae. The new results could allow selection or production of sugar beet plants able to prevent virus transmission then able to reduce viral inoculum in the soil.

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus

Ansatz zur Generierung einer konditionalen, reversiblen Wt1 k.o.-Maus Der Wilms-Tumor (WT, Nephroblastom) ist ein embryonaler Nierentumor, der durch die maligne Transformation von undifferenziertem Nierengewebe, sog. nephrogenen Resten, entsteht. WT treten mit einer Inzidenz von 1 in 10.000 Lebendgeburten auf. Das Hauptmanifestationsalter, der normalerweise einseitig und sporadisch auftretenden Tumore, liegt zwischen dem 3. und 4. Lebensjahr. Etwa 10 % der Patienten entwickeln jedoch bilaterale Tumore. In diesen Fällen ist eine Assoziation mit komplexen genetischen Krankheitsbildern (u. a. WAGR-, Denys-Drash-, Frasier- und Beckwith-Wiedemann-Syndrom) festzustellen. In 15 % der sporadischen WT sind Mutationen im WT1 (Wilms-Tumor 1)-Gen beschrieben. WT1 besteht aus zehn Exons und weist typische Merkmale von Transkriptionsfaktoren (z. B. vier Zinkfinger) auf. Zwei alternative Spleißereignisse betreffen Exon 5 (+/−Exon 5) und Exon 9 (Transkripte mit bzw. ohne die codierenden Sequenzen für die AS Lysin-Threonin-Serin; +/−KTS). Die Lage der drei alternativ vorhandenen AS zwischen den Zinkfingern 3 und 4 bestimmt die verschiedenen Funktionen der WT1-Proteine (4 Isoformen) als Transkriptionsfaktor (−KTS) bzw. als RNA-bindendes Protein (+KTS). Das zunächst im Zusammenhang mit WT als Tumorsuppressorgen identifizierte WT1 ist ein Entwicklungsgen mit einem sehr komplexen Expressionsmuster in der Embryonalentwicklung. Dabei ist v. a. die Bedeutung in der Urogenitalentwicklung entscheidend. Konstitutive, homozygote Wt1−/− k.o.-Mäuse sind embryonal (~ E12,5 dpc) letal und bilden u. a. keine Gonaden und keine Nieren. Aus diesem Grund existiert bisher kein Wilms-Tumormodell. Die Herstellung eines konditionalen murinen Tiermodells auf Basis des Tet on/off-Systems zur Untersuchung der Nierenentwicklung bzw. zur Analyse der Wilms-Tumorpathogenese war Ziel dieser Arbeit. Hierfür wurden drei Mauslinien generiert: Zwei transgene sog. Responder-Linien, die eine chimäre spleißbare Wt1-cDNA der Variante musWt1+Exon 5;+/−KTS unter der Kontrolle eines Tet-responsiven Promotors im Genom tragen. Dieses tTA/Dox-abhängig regulierbare Wt1-Transgen (tgWt1) sollte (exogen regulierbar) die Expression des endogenen Wt1-Lokus ausreichend nachahmen, um die kritischen Phasen der Embryogenese zu überwinden und lebensfähige Tiere zu erhalten. Parallel dazu wurde die Wt1-Effektor-Mauslinie (WE2) generiert. Diese trägt einen tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) zur Steuerung Tet-regulierbarer Transgene unter der Kontrolle des endogenen Wt1-Promotors. Die durch homologe Rekombination in ES-Zellen erreichte Integration des tTA direkt am Translationsstartpunkt des Wt1-Lokus hat in den Tieren einen heterozygoten Wt1 knock out/tTA knock in zur Folge. Die bisher vorgenommenen Verpaarungen doppelt transgener Wt1-tTA+/−/Resp-Mäuse ergaben keinen Rescue des letalen Wt1 k.o. und es konnten bislang keine Wilms-Tumore induziert werden. Alle im Verlauf der Arbeit generierten Mauslinien wurden umfassend charakterisiert. So konnte für die Tiere der Responder-Linien Wt1-Resp1 (mit zusätzlichen Isolator-Sequenzen zum Schutz des Transgens vor Positionseffekten) und Wt1-Resp2 (ohne Isolatoren) konnte die Tet-induzierbare Expression und die Spleißbarkeit des tgWt1 in MEF-Assays und mittels Effektor-Mäusen auf RNA-Ebene nachgewiesen werden. Die genomische Charakterisierung der WE2-Linie ergab eine ungeklärte etwa 120 kb große Inversion am Wt1-Lokus, die alle 5'-regulatorischen Sequenzen mitsamt des tTA vom Rest von Wt1 trennt. Tiere dieser Linie weisen aber dennoch einen funktionalen Wt1 k.o. auf: Unter den Nachkommen aus Intercross-Verpaarungen von Wt1-tTA+/−-Mäusen lassen sich auf Grund der Letalität keine Wt1−/−-Genotypen nachweisen. Die Charakterisierung der Effektor-Linie auf RNA-Ebene und mittels Reporter-Mäusen liefert ein Wt1-analoges tTA-Expressionsmuster: So findet man eine deutliche tTA-Expression u. a. in Niere (Glomeruli), Uterus, Ovar und Testis. Die hier vorgestellten Experimente ergeben darüber hinaus eindeutige Hinweise einer Beteiligung von Wt1 in der Entstehung der glatten Muskulatur bzw. in der Vaskulogenese.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Genetic analysis of tumour initiation and progression in a Drosophila model of epithelial cancer

Neoplastic overgrowth depends on the cooperation of several mutations ultimately leading to major rearrangements in cellular behaviour. The molecular crosstalk occurring between precancerous and normal cells strongly influences the early steps of the tumourigenic process as well as later stages of the disease. Precancerous cells are often removed by cell death from normal tissues but the mechanisms responsible for such fundamental safeguard processes remain in part elusive. To gain insight into these phenomena I took advantage of the clonal analysis methods available in Drosophila for studying the phenotypes due to loss of function of the neoplastic tumour suppressor lethal giant larvae (lgl). I found that lgl mutant cells growing in wild-type imaginal wing discs are subject to the phenomenon of cell competition and are eliminated by JNK-dependent cell death because they express very low levels of dMyc oncoprotein compared to those in the surrounding tissue. Indeed, in non-competitive backgrounds lgl mutant clones are able to overgrow and upregulate dMyc, overwhelming the neighbouring tissue and forming tumourous masses that display several cancer hallmarks. These phenotypes are completely abolished by reducing dMyc abundance within mutant cells while increasing it in lgl clones growing in a competitive context re-establishes their tumourigenic potential. Similarly, the neoplastic growth observed upon the oncogenic cooperation between lgl mutation and activated Ras/Raf/MAPK signalling was found to be characterised by and dependent on the ability of cancerous cells to upregulate dMyc with respect to the adjacent normal tissue, through both transcriptional and post-transcriptional mechanisms, thereby confirming its key role in lgl-induced tumourigenesis. These results provide first evidence that the dMyc oncoprotein is required in lgl mutant tissue to promote invasive overgrowth in developing and adult epithelial tissues and that dMyc abundance inside versus outside lgl mutant clones plays a key role in driving neoplastic overgrowth.

Humane CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen: Charakterisierung von Subpopulationen und Identifizierung eines Markers

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind essentiell an der Homöostase des Immunsystems beteiligt, indem sie eine antigenspezifische Toleranzinduktion in der Peripherie vermitteln und vor der Entstehung von Autoimmunerkrankungen schützen. Darüber hinaus sind diese Zellen wesentlich an der Kontrolle von Allergien, Infektionen und Tumoren beteiligt. Innerhalb dieser Arbeit konnten zwei bisher unbekannte Subpopulationen humaner CD4+CD25+ Tregs, isoliert aus dem peripheren Blut des Menschen, nachgewiesen werden. Diese Subpopulationen unterscheiden sich in ihrer Oberflächenexpression und exprimieren die Integrine a4b1 bzw. a4b7. Beide Treg-Subpopulationen supprimieren kokultivierte CD4+ T-Helferzellen Zellkontakt-abhängig und konvertieren gleichzeitig einen Teil dieser Zellen in sekundäre Suppressorzellen (iTregs). a4b1+ Tregs induzieren TGF-β-sezernierende iTregs, a4b7+ Tregs führen zur Bildung von IL-10-produzierenden iTregs. Differentielle Proteomanalysen humaner CD4+CD25+ Tregs, im Vergleich zu CD4+CD25- T-Helferzellen, führten zur Identifizierung von Galectin-10 als Markerprotein, das fast ausschließlich von CD4+CD25+ Tregs und nicht von CD4+ T-Helferzellen exprimiert wird. Galectin-10 ist ein intrazelluläres Protein, das essentiell für die funktionellen Eigenschaften humaner CD4+CD25+ Tregs ist. Die Blockade der Galectin-10-Bildung in den CD4+CD25+ Tregs durch RNA-Interferenz führte zu wesentlichen funktionellen Veränderungen der CD4+CD25+ Tregs. In Abwesenheit von Galectin-10 verlieren humane CD4+CD25+ Tregs ihre suppressiven Eigenschaften und ihren anergischen Phänotyp. Somit konnte mit Galectin-10 erstmals ein spezifischer Marker für humane CD4+CD25+ Tregs identifiziert werden, der wesentlich für den funktionellen Phänotyp dieser Regulatoren peripherer T-Zelltoleranz ist.

Molecular mechanisms involved in the pathogenesis of beet soil-borne viruses.

The genus Benyvirus includes the most important and widespread sugar beet viruses transmitted through the soil by the plasmodiophorid Polymyxa betae. In particular Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), the leading infectious agent that affects sugar beet, causes an abnormal rootlet proliferation known as rhizomania. Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) is widely distributed in the United States and, up to date has not been reported in others countries. My PhD project aims to investigate molecular interactions between BNYVV and BSBMV and the mechanisms involved in the pathogenesis of these viruses. BNYVV full-length infectious cDNA clones were available as well as full-length cDNA clones of BSBMV RNA-1, -2, -3 and -4. Handling of these cDNA clones in order to produce in vitro infectious transcripts need sensitive and expensive steps, so I developed agroclones of BNYVV and BSBMV RNAs, as well as viral replicons allowing the expression of different proteins. Chenopodium quinoa and Nicotiana benthamiana plants have been infected with in vitro transcripts and agroclones to investigate the interaction between BNYVV and BSBMV RNA-1 and -2 and the behavior of artificial viral chimeras. Simultaneously I characterized BSBMV p14 and demonstrated that it is a suppressor of post-transcriptional gene silencing sharing common features with BNYVV p14.

Development of new therapeutic approaches in the treatments of Inflammatory Bowel Diseases: functional food and nutraceuticals vs synthetic peptides based vaccines

Inflammatory Bowel Diseases (IBD) are intestinal chronic relapsing diseases which ethiopathogenesis remains uncertain. Several group have attempted to study the role of factors involved such as genetic susceptibility, environmental factors such as smoke, diet, sex, immunological factors as well as the microbioma. None of the treatments available satisfy several criteria at the same time such as safety, long-term remission, histopatological healing, and specificity. We used two different approaches for the development of new therapeutic treatment for Inflammatory Bowel Disease. The first is focused on the understanding of the potential role of functional food and nutraceuticals nutrients in the treatment of IBD. To do so, we investigated the role of Curcuma longa in the treatment of chemical induced colitis in mice model. Since Curcma Longa has been investigated for its antinflammatory role related to the TNFα pathway as well investigators have reported few cases of patients with ulcerative colites treated with this herbs, we harbored the hypothesis of a role of Curcuma Longa in the treatment f IBD as well as we decided to assess its role in intestinal motility. The second part is based on an immunological approach to develop new drugs to induce suppression in Crohn’s disease or to induce mucosa immunity such as in colonrectal tumor. The main idea behind this approach is that we could manipulate relevant cell-cell interactions using synthetic peptides. We demonstrated the role of the unique interaction between molecules expressed on intestinal epithelial cells such as CD1d and CEACAM5 and on CD8+ T cells. In normal condition this interaction has a role for the expansion of the suppressor CD8+ T cells. Here, we characterized this interaction, we defined which are the epitope involved in the binding and we attempted to develop synthetic peptides from the N domain of CEACAM5 in order to manipulate it.

Ribosome Biogenesis and cell cycle regulation: Effect of RNA Polymerase III inhibition

In cycling cells positive stimuli like nutrient, growth factors and mitogens increase ribosome biogenesis rate and protein synthesis to ensure both growth and proliferation. In contrast, under stress situation, proliferating cells negatively modulate ribosome production to reduce protein synthesis and block cell cycle progression. The main strategy used by cycling cell to coordinate cell proliferation and ribosome biogenesis is to share regulatory elements, which participate directly in ribosome production and in cell cycle regulation. In fact, there is evidence that stimulation or inhibition of cell proliferation exerts direct effect on activity of the RNA polymerases controlling the ribosome biogenesis, while several alterations in normal ribosome biogenesis cause changes of the expression and the activity of the tumor suppressor p53, the main effector of cell cycle progression inhibition. The available data on the cross-talk between ribosome biogenesis and cell proliferation have been until now obtained in experimental model in which changes in ribosome biogenesis were obtained either by reducing the activity of the RNA polymerase I or by down-regulating the expression of the ribosomal proteins. The molecular pathways involved in the relationship between the effect of the inhibition of RNA polymerase III (Pol III) activity and cell cycle progression have been not yet investigated. In eukaryotes, RNA Polymerase III is responsible for transcription of factors involved both in ribosome assembly (5S rRNA) and rRNA processing (RNAse P and MRP).Thus, the aim of this study is characterize the effects of the down-regulation of RNA Polymerase III activity, or the specific depletion of 5S rRNA. The results that will be obtained might lead to a deeper understanding of the molecular pathway that controls the coordination between ribosome biogenesis and cell cycle, and might give useful information about the possibility to target RNA Polymerase III for cancer treatment.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegenüber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der häufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgelöst wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdrückt werden kann. Bei der NZT führt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. Für die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob natürlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen während der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erhöhte Anzahl von nTregs während der Niedrigzonentoleranz gegenüber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anikörper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdrückt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen übertragen werden kann, während CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn

Ruolo della Interleuchina-6 nella colite ulcerosa long-standing: regolazione della p53 ed induzione delle cellule mesenchimali epiteliali

L’infiammazione cronica è un fattore di rischio di insorgenza del cancro, e la citochina infiammatoria IL-6 gioca un ruolo importante nella tumorigenesi. In questo studio abbiamo dimostrato che L’IL-6 down-regola l'espressione e l'attività di p53. In linee cellulari umane, IL-6 stimola la trascrizione dell’rRNA mediante espressione della proteina c-myc a livello post-trascrizionale in un meccanismo p38MAPK-dipendente. L'up-regolazione della biogenesi ribosomiale riduce l'espressione di p53 attraverso l'attivazione della via della proteina ribosomale-MDM2. La down-regolazione di p53 produce l’acquisizione di modifiche fenotipiche e funzionali caratteristiche della epitelio mesenchimale di transizione, un processo associato a trasformazione maligna e progressione tumorale. I nostri dati mostrano che questi cambiamenti avvengono anche nelle cellule epiteliali del colon di pazienti affetti da colite ulcerosa, un esempio rappresentativo di una infiammazione cronica soggetta a trasformazione neoplastica, che scompaiono dopo trattamento con farmaci antinfiammatori. Questi risultati svelano un nuovo effetto oncogenico indotto dall’IL-6 che può contribuire notevolmente ad aumentare il rischio di sviluppare il cancro non solo in pazienti con infiammazioni croniche, ma anche in quei pazienti con condizioni patologiche caratterizzate da elevato livello di IL-6 nel plasma, quali l'obesità e e il diabete mellito di tipo 2.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Targeting the p53–MDM2 interaction by the small-molecule MDM2 antagonist Nutlin-3a: a new challenged target therapy in adult Philadelphia positive acute lymphoblastic leukemia patients

The human p53 tumor suppressor, known as the “guardian of the genome”, is one of the most important molecules in human cancers. One mechanism for suppressing p53 uses its negative regulator, MDM2, which modulates p53 by binding directly to and decreasing p53 stability. In testing novel therapeutic approaches activating p53, we investigated the preclinical activity of the MDM2 antagonist, Nutlin-3a, in Philadelphia positive (Ph+) and negative (Ph-) leukemic cell line models, and primary B-Acute lymphoblastic leukemia (ALL) patient samples. In this study we demonstrated that treatment with Nutlin-3a induced grow arrest and apoptosis mediated by p53 pathway in ALL cells with wild-type p53, in time and dose-dependent manner. Consequently, MDM2 inhibitor caused an increase of pro-apoptotic proteins and key regulators of cell cycle arrest. The dose-dependent reduction in cell viability was confirmed in primary blast cells from Ph+ ALL patients with the T315I Bcr-Abl kinase domain mutation. In order to better elucidate the implications of p53 activation and to identify biomarkers of clinical activity, gene expression profiling analysis in sensitive cell lines was performed. A total of 621 genes were differentially expressed (p < 0.05). We found a strong down-regulation of GAS41 (growth-arrest specific 1 gene) and BMI1 (a polycomb ring-finger oncogene) (fold-change -1.35 and -1.11, respectively; p-value 0.02 and 0.03, respectively) after in vitro treatment as compared to control cells. Both genes are repressors of INK4/ARF and p21. Given the importance of BMI in the control of apoptosis, we investigated its pattern in treated and untreated cells, confirming a marked decrease after exposure to MDM2 inhibitor in ALL cells. Noteworthy, the BMI-1 levels remained constant in resistant cells. Therefore, BMI-1 may be used as a biomarker of response. Our findings provide a strong rational for further clinical investigation of Nutlin-3a in Ph+ and Ph-ALL.