La ultraestructura de los panza blanca, moteados y vitreos, en tres especies de trigos cultivados : en la región semiárida trigera Argentina

p.65-72

Selección de cepas de Rhizobium japonicum para la inoculación de soja en el Noroeste Argentino

p.255-261

Papas chips XII : tratamiento con CIPC de tubérculos almacenados : su incidencia en la composición química y su relación con la calidad de la chip

p.41-50

Evaluación del forraje diferido de panicum coloratum cv. verde fertilizado con nitrógeno

p.55-62

El estrés térmico post - floración y sus efectos sobre el peso y la calidad de los granos en maíces de diferente destino de producción

En maíz, los golpes de calor (días con temperaturas menor a 35 grados C) ocurridos tempranamente durante el período post-floración pueden afectar negativamente el peso individual de los granos, a traves de limitaciones del crecimiento del cultivo. El conocimiento que existe respecto a las bases eco-fisiológicas de la respuesta de la calidad de los granos a la incidencia de este estres durante el llenado efectivo es prácticamente nulo. El objetivo de este trabajo fue analizar en condiciones a campo el impacto de los golpes de calor durante las etapas tempranas y tardías del llenado efectivo sobre el peso, la calidad general y específica de la industria de los granos en híbridos de maíz de diferente destino de producción (colorado duro o flint, pisingallo y semi-dentad). Los golpes de calor, especialmente aquellos ocurridos durante las etapas tempranas del llenado, redujeron el crecimiento de los cultivos por caídas de la eficiencia en el uso de la radiacion interceptada. Esto produjo un desbalance entre la disponibilidad de asimilados y el requerimiento de estos por parte de los granos que se tradujo en una interrupción prematura del llenado. Consecuentemente, se obtuvieron granos mas livianos con concentraciones mas bajas de aceite y mas altas de proteína. Estas respuestas fueron acompanadas de alteraciones en la composición específica de las proteínas de reserva, incrementándose la abundancia relativa de glutelinas, y ƒÀ- y ƒÁ- zeinas, en detrimento de aquella de ƒ¿-zeinas. Asimismo, los golpes de calor provocaron efectos negativos sobre los diversos parámetros de calidad industrial de los granos, asociados principalmente a disminuciones en la abundancia relativa de ƒ¿-zeínas. Para la mayoría de los rasgos mencionados, los híbridos semi-dentados tuvieron una respuesta mas pronunciada al estrés que los híbridos colorado duro y pisingallo, aparentando ser sensibles a temperaturas del aire incluso inferiores a 35 grados C.

The forage supply service in the Chaco native forest : an approach to economic analysis

p.37-45

Botany origin and protein content of homemade honeys from Galicia hives (NW Spain)

The botanic origin and the protein content of 15 honeys from small bee farms exploitations of Galicia, for family consume, were studied; the aim is to check if the protein wealth and the pollen wealth are dependent parameters. Seven honeys resulted to be Rhamnus frangula unifloral (pollen patterns with low diversity), two Castanea sativa Miller unifloral, other one heather unifloral, and five was multifloral honeys of various pollen patterns (four Castanea predominant and one Rhamnus frangula predominant). Their pollen wealth was low; eight honeys classified in the Maurizio Class I, 3 in Class II, 2 in Class III, and one in Maurizio Class IV. There has been a wide variability in its protein content (0.09- 4.83 mg prot./g honey). The relative amount of pollen from different taxa has a direct or inverse proportionality to wealth protein.

O sistema dois-hidrido de levedura para confirmação da sinalização de APP Tipo-Noth

Inúmeras potenciais funções foram sugeridas para a APP (Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer), contudo, fisiologicamente, a função precisa da APP não foi ainda desvendada. A APP tem características consistentes com a função de molécula-receptora, capaz de reconhecer sinais extracelulares. Também relevante para este trabalho, é o facto de que a sinalização através de RIP (Proteólise Intramembranar Regulada) tem consequências na expressão génica, como no caso da sinalização tipo-Notch. Tal como a proteína Notch, a APP é processada resultando num fragmento C-terminal designado por AICD (Domínio Intracelular da APP). Neste trabalho é focado o papel importante na sinalização nuclear desempenhado pelo fragmento AICD, especificamente através da interacção com proteínas adaptadoras, promovendo a transcrição. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da base molecular da DA (Doença de Alzheimer), torna-se importante investigar as vias de localização nuclear do AICD e o seu envolvimento na transcrição génica, possivelmente afectando proteínas até agora não associadas à DA. Por estes motivos é fundamental a identificação de novas proteínas que interajam com a APP. Um rastreio foi efectuado, utilizando o sistema Dois-Híbrido em Levedura, para identificar interacções específicas do AICD no cérebro humano e, assim, caracterizar o interactoma do AICD. Foi feito o rastreio de aproximadamente 1.1x108 clones de uma biblioteca de cDNA de cérebro humano com o domínio C-terminal da APP com a mutação Y687E, que mimetiza o estado fosforilado. De experiências anteriores deste laboratório sabemos que a tirosina-687 afecta a localização subcelular da APP e é também consensual que a fosforilação é importante nos mecanismos de transdução de sinais, daí a utilização deste mutante parecer apropriada. O rastreio originou 55 clones positivos que foram analisados para identificar proteínas que interagem com a APP. Dois clones são particularmente importantes, a RanBPM e a Transportin-SR2, visto que estão associadas ao transporte de proteínas para o núcleo e confirmam a sinalização nuclear da APP. ABSTRACT: Many putative functions for APP (Alzheimer’s amyloid precursor protein) have been suggested, although the precise physiological function of APP remains to be elucidated. APP has characteristics consistent with it having a role as a receptor, capable of mediating extracellular signals. Also of relevance to the work described here is that RIP (Regulated Intramembrane Proteolysis) signalling can have consequences in gene expression, similar to Notch signalling. Like the latter, APP is processed by RIP resulting in a C-terminal fragment known as AICD. Here we test the hypothesis that the AICD fragment may play an important role in nuclear signalling, specifically by interacting with adaptor proteins potentiating transcription. Therefore, in order to contribute to our understanding of the molecular basis of AD (Alzheimer’s disease) it is important to investigate the pathways of AICD nuclear targeting and its involvement in gene transcription, possibly affecting other proteins hitherto not associated with AD. Thus, it is important to identify AICD binding proteins. A Yeast Two-Hybrid (YTH) screen was performed to identify human brainspecific AICD binding proteins, and thus characterize the AICD interactome. The screen of approximately 1.1 x108 clones from a human brain cDNA library was carried out using the AICD fragment with an Y687E mutation, which mimics phosphorylation on that residue. From previous work carried out in the laboratory we know that tyrosine-687 phosphorylation affects subcellular localization of APP, and it is also recognized that phosphorylation events are important in signal transduction mechanisms, hence the use of this mutant is appropriate. The YTH screen yielded 55 positive clones that were analysed and several novel brain-specific APP binding proteins were identified. Two clones were particularly important, RanBPM and Transportin-SR2, being that they are associated with the nuclear transport of proteins, and support the nuclear signalling for APP.

Aß biology and its contribution to Alzheimer's disease

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva patologicamente caracterizada pela presença de placas de amilóide (placas senis) insolúveis e também pela presença de tranças neurofibrilhares,formadas pela proteína Tau hiperfosforiladada. O principal constituinte das placas senis é o peptídeo beta-amilóide (Ab), que deriva do processamento proteolítico da proteína precursora de amilóide de Alzheimer (APP). Embora Ab exista como um agregado pouco solúvel nas placas senis, ele é secretado pelas células como uma molécula solúvel. O Ab “per se” pode afectar o metabolismo da APP. Alguns autores sugerem que o Ab exerce o seu efeito alterando o processamento ou catabolismo da APP, outros sugerem que ele também induz a transcrição da APP, onde aumentando os níveis da APP pode estar a contribuir para a sua própria produção (mecanismo de “feedback” positivo). Assim sendo, torna-se difícil consolidar todas estas observações e identificar as potenciais funções fisiológicas do Ab “in vivo”, ou as consequências da sua produção. Neste trabalho caracterizaram-se os efeitos do Ab no metabolismo da APP. Os nossos estudos revelaram que um dos mecanismos induzidos pelo Ab é a acumulação intracelular do fragmento neuroprotector sAPP (isAPPa) em estruturas com características vesiculares associadas ao citosqueleto. Estudos adicionais em culturas primárias revelaram que o Ab estava a exercer o seu efeito ao nível da secreção vesicular, provavelmente interferindo com o transporte de APP/sAPP ao longo da rede do citosqueleto. Esta hipótese é sustentada pelo facto do Ab estar a afectar a estabilidade e a polimerização de proteínas envolvidas na dinâmica do citosqueleto. Contrariamente a publicações anteriores o Ab não induziu a transcrição da APP, na verdade em culturas primárias neuronais foi observado uma diminuição nos níveis de expressão da APP. Isto foi acompanhado por um aumento nos fragmentos C-terminais da APP (CTFs) e uma diminuição na localização nuclear do seu domínio intracelular (AICD), sugerindo alterações na sinalização nuclear da APP. O Ab pode afectar outras vias de sinalização, particularmente alterando o balanço entre as actividades das proteínas cinases e fosfatases, o que pode ter consequências para o desenvolvimento da doença. Os dados obtidos indicam que o Ab é capaz de inibir a actividade da proteína fosfatase1, a sua importância numa perspectiva de futuras terapias é discutida. Devido à relevância da agregação do Ab para a sua toxicidade, a formação de complexos com proteínas que promovem a sua desagregação/degradação e o seu efeito no processamento da APP foi avaliado. Na presença destes complexos observou-se uma reversão da acumulação isAPP, demonstrando o potencial terapêutico destas proteínas como moduladores do metabolismo da APP. Este trabalho permitiu compreender melhor os mecanismos envolvidos nos efeitos do Ab no processamento da APP e descobrir algumas moléculas que podem ser relevantes numa perspectiva de diagnóstico e terapia na DA.

Influence of speciation in the bioavailability of cadmium to an isopod

Devido às actividades antropogénicas várias substâncias químicas têm sido introduzidas no meio ambiente em concentrações que de outro modo não ocorreriam de forma tão elevada naturalmente. Assim, o conhecimento acerca das características de um químico, tais como, o potencial para se acumular em diferentes níveis tróficos, a sua mobilidade dentro do ecossistema, a toxicidade específica e a bioacumulação, é fundamental para compreender os seus efeitos nos ecossistemas. Esta tese investiga a influência de especiação, na biodisponibilidade do cádmio (Cd) para o isópode Porcellio dilatatus, incluindo os efeitos de especiação do metal: (i) na assimilação do Cd, (ii) no modo como o Cd se distribui internamente no organismo, e (iii) como a sobrevivência e a reprodução são afectadas em isópodes terrestres. Num primeiro ensaio laboratorial avaliou-se a importância da transferência trófica na assimilação do Cd em P. dilatatus. Para tal analisou-se a eficiência de assimilação (EA) do Cd em isópodes, adicionado superficialmente ao alimento (alface) na forma de Cd(NO3)2 e contaminando o meio de crescimento da alface. A hipótese era de que a alface contaminada biologicamente através do cultivo em meio hidropónico contaminado teria uma maior proporção de complexos com proteína ou conjugado na forma de Cd (ex. Cd cisteína). A EA de Cd foi maior entre os isópodes que foram alimentados com o sal (71%, SE = 7%), do que entre os isópodes que se alimentaram de alface contaminada biologicamente (52%, SE = 5%), demonstrando-se assim num teste laboratorial que é provável que a especiação do Cd influencie a taxa de assimilação e acumulação do Cd. Na experiência alimentar que se seguiu, estudou-se em detalhe a especiação do metal comparando as EA do Cd conjugado com cisteína (Cd(Cys)2) e na forma de Cd(NO3)2, com os quais se contaminou gelatina com alface. A utilização de Cd-cisteína, proporcionou uma forma experimental para explorar a biodisponibilidade do Cd complexado dentro do tecido biológico. Como esperado, a EA de Cd em isópodes alimentados com nitrato de Cd (64%, SE = 5%) foi maior do que no caso de isópodes alimentados com o conjugado de cisteína (20%, SE = 3%). De seguida estudou-se a distribuição subcelular das espécies de Cd assimilado através de um processo de fraccionamento. Supunha-se que as diferenças de especiação de Cd reflectiria diferentes estratégias de compartimentalização, com consequências ao nível da detoxificação, armazenamento celular e distribuição subcelular do metal. O “sequestro” na forma de metal biologicamente detoxificado (BDM = proteínas estáveis ao calor - HSP e grânulos ricos em metal - RMG) foi maior nos isópodes alimentados com Cd(NO3)2, sugerindo que são mais eficientes na detoxificação de Cd (22%) do que quando alimentados com Cd(Cys)2 (15%). Foi também demonstrado que os isópodes alimentados com Cd(Cys)2 possuíam níveis de armazenamento de Cd superior nas fracções sensíveis ao metal (MSF = organelos e proteínas desnaturadas pelo calor - HDP) consideradas fracções potencialmente vulneráveis e afectando os isópodes em termos de toxicidade. As diferentes distribuições internas que se seguiram à assimilação e detoxificação das diferentes espécies de Cd foram finalmente avaliadas em termos da sobrevivência e reprodução dos isópodes. O tratamento com Cd(Cys)2 teve maior mortalidade, provavelmente devido à maior disponibilidade de Cd ingerido com implicações ao nível dos processos fisiológicos. Os isópodes alimentados com Cd(NO3)2 armazenaram o Cd nos MRG, como estratégia de detoxificação, sendo mais eficientes a detoxificar o Cd ainda que aumentando a concentração total do metal que se tornou menos tóxico para o isópode. Desta forma, o Cd nos grânulos não estava disponível para os processos fisiológicos e deixou de ser tóxico. Isso poderia estar relacionado com a resistência e tolerância aos metais devido à capacidade dos isópodes compartimentalizarem o Cd no hepatopâncreas, que actua como um mecanismo de detoxificação e contribui para a tolerância a altos níveis de cádmio. Em termos de parâmetros reprodutivos, observou-se uma redução de gestações e duração da gestação na presença de ambas as espécies de metal, mas no caso do Cd(Cys)2 as gravidezes não se concluíram. O número de jovens produzido por fêmeas alimentadas com Cd(NO3)2 foi menor do que no controlo, mas os pesos dos juvenis foram superiores. Finalmente sugere-se assim que esta abordagem seja considerada em estudos do movimento trófico de metais nas cadeias alimentares dado que se espera que a especiação de metais implique diferentes fluxos, dentro de uma dada cadeia trófica.

Contribuição para a melhoria da qualidade nutricional do sorgo

Este trabalho teve como principal objectivo sugerir uma forma de processamento de sorgo adaptável à escala industrial que, sendo culturalmente aceite e sensível aos hábitos alimentares, aos factores sociais e às limitações económicas e tecnológicas das populações Africanas de consumo, pudesse dar origem a um produto alimentar seguro e enriquecido em termos nutricionais. Numa primeira fase, efectuou-se um estudo comparativo entre os efeitos promovidos por diferentes formas de processamento: cozimento em água, aquecimento em banho-maria, pipocagem, germinação, fermentação e altapressão. Foram ainda determinadas as condições óptimas de aplicação do processo germinativo e da tecnologia de alta-pressão. Verificou-se que a fermentação, a germinação e a alta-pressão permitem uma melhoria significativa da digestibilidade proteica da farinha de sorgo. A pipocagem conduziu a uma redução da extractibilidade das proteínas não promovendo, contudo, alterações na sua digestibilidade. Comparativamente ao cozimento em água, que promove uma diminuição acentuada na digestibilidade proteica, o cozimento em banho-maria promove uma diminuição ténue e significativamente inferior. Deste estudo comparativo, foi possível concluir que a extractibilidade das proteínas não está correlacionada com a sua digestibilidade e que a água exerce um papel fundamental na diminuição da digestibilidade proteica com o aquecimento. Numa segunda fase, pretendeu-se desenvolver um processo fermentativo que conduzisse a um produto de sorgo com características nutricionais incrementadas. Para tal, foram testadas daiferentes espécies de bactérias lácticas isoladas e conjugadas entre si. Foi ainda testada a adição de malte de sorgo previamente à fermentação e a adição de leveduras ao inóculo. Com este estudo, foi possível concluir que a fermentação do sorgo com um inóculo constituído por culturas puras de Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum e Streptococcus thermophilus permite a obtenção de uma preparação alimentar com características nutricionais melhoradas no que respeita ao balanço em aminoácidos essenciais, à digestibilidade da proteína e do amido e à viscosidade do produto final.

Lichenicidin biosynthesis and search for novel antibacterial peptides

A estirpe Bacillus licheniformis I89 possui a capacidade de produzir alguns compostos com actividade antibacteriana. No presente estudo, a separação desses compostos foi realizada através da aplicação de vários procedimentos, incluindo extracção em fase sólida e cromatografia liquida de alta pressão. Dois destes compostos bioactivos constituem o lantibiótico de classe II lichenicidina e são caracterizados pela massas molecular de 3250 Da (Bliα) e 3020 Da (Bliβ). O cluster responsável pela biossíntese da lichenicidina foi heterologamente expresso em Escherichia coli, constituindo a primeira descrição da produção de um lantibiótico totalmente in vivo num hospedeiro Gram-negativo. Este sistema foi subsequentemente explorado com o objectivo de relacionar cada proteína codificada no cluster genético da lichenicidina na produção dos péptidos Bliα e Bliβ. O desenvolvimento do sistema de trans complementação possibilitou a produção de variantes destes péptidos. A análise das massas moleculares destas variantes assim como a análise dos padrões de fragmentação obtidos por MS/MS permitiu a revisão de algumas das características estruturais previamente proposta para Bliα e Bliβ. A análise dos genes hipoteticamente envolvidos na protecção da estirpe produtora contra a acção antibiótica da lichenicidina revelou, que em E. coli, a sua ausência não resulta no aumento da susceptibilidade a este composto. Verificou-se também que a presença destes genes não é essencial para a produção de lichenicidina em E. coli. Foi também confirmado experimentalmente que a membrana externa da E. coli constitui uma barreira natural para a entrada dos péptidos na célula. De facto, uma das características intrigantes da produção de lichenicidina por uma bactéria de Gram negativo reside no mecanismo de transporte dos dois péptidos através da membrana externa. Neste estudo foi demonstrado que na ausência da proteína de membrana TolC, a massa molecular de Bliα e Bliβ não foi identificada no sobrenadante de E. coli, demonstrando assim que a sua presença no ambiente extra-celular não se devia a um processo de lise bacteriana. Foi ainda avaliada a capacidade da maquinaria biossintética da lichenicidina para produzir o lantibiótico haloduracina, através do processamento de chimeras lichenicidina-haloduracina, contudo, os resultados foram negativos. Verificou-se ainda que em determinadas condições de incubação, a diferenciação da morfologia original da estirpe B. licheniformis I89 pode ocorrer. Esta dissociação implicou a transição da colónia parental e rugosa para uma colónia de aparência mais simples e suave. Desta forma, as diferenças das duas morfologias em termos de taxa de crescimento, esporulação e actividade antibiótica foram investigadas. Considerando especificamente Bliα e Bliβ verificou-se que a abundância destes péptidos nas culturas do fenótipo fino é geralmente inferior aquela identificada nas culturas do fenótipo parental. Por último, a diversidade de elementos genéticos constituintes de péptido sintetases não ribossomais (NRPS) foi investigada em lagoas no centro de Portugal e em solos provenientes de caves do sul de Portugal, revelando a presença de potenciais novas NRPS nestes ambientes.

Progesterone actions in protein phosphorylation in the central nervous system

O presente trabalho propõe-se esclarecer o papel que a progesterona e os seus metabolitos exercem no sistema nervoso central. Nos últimos anos, com a descoberta da síntese local de esteróides no cérebro, a progesterona, assim como outras hormonas sexuais, ganharam uma relevância crescente em fenómenos tais como plasticidade neuronal e neuroprotecção. Ainda que já se comece a entender o papel de muitas hormonas no cérebro, tal como o estrogénio, o papel da progesterona continua menos conhecido. Deste modo, o nosso trabalho centrou-se na elucidação dos efeitos da progesterona em fenómenos de sobrevivência celular, plasticidade neuronal/sináptica. Graças à colaboração com um grupo pioneiro em estudos sobre hormonas sexuais neuroactivas, o presente trabalho fornece uma importante contribuição ao entendimento do papel desta hormona no sistema nervoso central. Este trabalho fornece novos dados, relativamente ao papel da progesterona e dos seus metabolitos reduzidos na regulação de vias de sinalização associadas com sobrevivência celular, tal como Akt/PI3K e ERK. Também é analisado o efeito do tratamento hormonal na expressão e estado de fosforilação da proteína Tau, sendo ainda motivo de estudo cinases e fosfatases envolvidas nestes mecanismos.

Relação do aroma e da espuma dos vinhos espumantes com o potencial enológico das uvas e dos vinhos

Os espumantes produzidos segundo o método Champanhês são obtidos após uma segunda fermentação em garrafa. Quando o vinho é vertido no copo, o CO2 produzido é libertado, sendo a espuma formada o resultado da sua interacção com os constituintes do vinho. A quantidade e a estabilidade da espuma do vinho espumante estão relacionadas com a sua composição química. Para além da espuma, o aroma é também um parâmetro importante de qualidade na apreciação geral de um vinho espumante. O aroma de um vinho espumante provém do contributo das uvas assim como do processo fermentativo. Dependendo do estado de maturação da uva, o contributo dos compostos voláteis para o aroma é diferente. Em virtude da vindima para os vinhos espumantes ser realizada antes da vindima para os vinhos maduros, dependendo da variedade, as uvas poderão não ser colhidas na expressão máxima do seu aroma, podendo verificar-se uma perda significativa do seu potencial varietal volátil. O objectivo desta dissertação é relacionar o aroma e a espuma dos vinhos espumantes com o potencial enológico das uvas e dos vinhos. Para isso, foi estudada a composição volátil das duas castas principais da Bairrada, a casta branca Fernão-Pires (FP) e a casta tinta Baga (BG), sendo estas duas das castas usadas para a produção de espumante. Para estudar a composição volátil das uvas durante a maturação, com vista a avaliar este efeito na expressão máxima de compostos voláteis, foi optimizada para este propósito a metodologia de microextracção em fase sólida em espaço de cabeça (HS-SPME). As uvas foram colhidas semanalmente, em duas vinhas, do pintor à pós-maturidade sendo posteriormente analisadas pela metodologia de HS-SPME seguida de cromatografia de gás acoplada à espectrometria de massa com quadrupolo (GC–qMS). No caso das uvas BG, observou-se um aumento acentuado na expressão máxima de compostos voláteis próximo da maturidade da uva determinada pelo teor em açúcar e acidez titulável, mantendo-se constante durante a pós-maturidade. Na determinação do perfil volátil das uvas ao longo da maturação foram identificados 66 compostos varietais nas uvas provenientes de uma vinha (Pedralvites) e 45 da outra vinha (Colégio). Em ambas as vinhas foram identificados 23 sesquiterpenóides, 13 monoterpenóides, 6 norisoprenóides, 2 álcoois aromáticos e 1 diterpenóide. Os sesquiterpenóides, devido à sua abundância em número e em área cromatográfica, podem ser considerados marcadores da casta BG. As uvas FP apresentaram um comportamento diferente do das uvas BG, sendo a expressão máxima de compostos voláteis expressa durante um curto período de tempo (1 semana), que coincide com a maturidade da uva. Depois de atingido este pico, observa-se uma diminuição drástica logo na semana seguinte. Este comportamento foi observado em ambas as vinhas, onde foram identificados 20 compostos voláteis varietais e 5 pré-fermentativos (álcoois e aldeídos em C6). Estes resultados mostram que quando estas castas são colhidas precocemente (1 semana antes da maturidade) para a produção de espumante, é observada uma redução significativa do potencial volátil que é expresso na maturidade. Para a análise da composição volátil dos vinhos espumantes foi optimizada uma metodologia de microextracção que permite usar uma maior quantidade de fase estacionária, a extracção sorptiva em barra de agitação (SBSE). O método foi optimizado usando 10 padrões de compostos voláteis representativos das principais famílias químicas presentes no vinho, nomeadamente, ésteres, monoterpenóides, sesquiterpenóides, norisoprenóides em C13 e álcoois. O método proposto apresenta uma boa linearidade (r2 > 0,982) e a reprodutibilidade varia entre 8,9 e 17,8%. Os limites de detecção para a maioria dos compostos é bastante baixo, entre 0,05 e 9,09 μg L-1. O método foi aplicado para a análise da composição volátil dos vinhos espumantes. Dentro dos vinhos espumantes analisados, foi estudada a influência da casta, do tipo de solo e do estado de maturação das uvas na sua composição volátil. A casta FP pode dar origem a vinhos com maior potencial de aroma do que a casta BG. Relativamente à avaliação dos diferentes estados de maturação, verificou-se que as uvas da maturidade e as da colheita tardia (uma semana depois da maturidade) deram origem aos vinhos com maior quantidade de compostos voláteis. Para os três tipos de solo estudados (arenoso, argiloso e argilo-calcário), o vinho obtido a partir de uvas colhidas no solo argilo-calcário foi o que mostrou a maior concentração de compostos voláteis varietais. A espuma destes vinhos espumantes foi também avaliada quanto à sua quantidade máxima (HM) e tempo de estabilidade (TS). O vinho espumante que apresentou um maior TS foi o vinho produzido a partir da casta FP proveniente de uma colheita tardia e solo argiloso. Os vinhos provenientes dos solos arenosos e argilo-calcários são os que apresentaram valores mais baixos de TS. Com vista a avaliar quais os conjuntos de moléculas do vinho que estão relacionados com as propriedades da espuma e possíveis sinergismos entre eles, para cada vinho espumante foi separada a fracção hidrofóbica de baixo peso molecular (MeLMW), a fracção de elevado peso molecular (HMW) e duas fracções de peso molecular intermédio (AqIMW e MeIMW). As propriedades da espuma dos vinhos modelo, reconstituídos com estas fracções e suas misturas, foram avaliadas. A combinação da fracção HMW com a MeLMW aumentou o TS 2,7 vezes quando comparado com o observado para a fracção HMW isoladamente, produzindo um efeito sinergético. Este aumento do TS ainda foi maior quando se combinou a fracção HMW com as subfracções obtidas a partir da fracção MeLMW, principalmente para as fracções menos apolares. A subfracção hidrofóbica menos apolar foi caracterizada por espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS/MS) tendo sido identificada uma série de oligómeros de polietileno glicol e um potencial composto tensioactivo, o 8-hidroxi-tridecanoato de dietilenoglicolglicerilacetato. A fracção MeLMW foi também isolada da espuma do vinho espumante e caracterizada por ESI-MS/MS, permitindo identificar vários compostos potenciais tensioactivos, nomeadamente, dois monoacilgliceróis e quatro derivados de ácidos gordos com gliceriletilenoglicol. Estes resultados confirmam que estes compostos relacionados com a estabilidade da espuma existem em maior número na espuma do que no vinho. O vinho foi ainda fraccionado em 12 grupos de moléculas: 3 fracções de manoproteínas, 3 de arabinogalactanas, 3 de misturas de polissacarídeos, proteínas e compostos fenólicos e 3 fracções de peso molecular intermédio e baixo, compostas por uma mistura de hidratos de carbono, peptídeos e compostos fenólicos. Foram usados vinhos modelo reconstituídos com cada uma das fracções isoladas na concentração em que estas se encontraram no vinho. Foram também efectuados ensaios com soluções modelo dez vezes mais concentradas e com misturas de algumas das fracções. Todas as soluções formadas foram avaliadas quanto às propriedades da espuma. O aumento da concentração para dez vezes faz com que a solução contendo a fracção rica em manoproteínas (MP1) aumente para mais do dobro a HM e 7,4 vezes mais o TS. A combinação entre a fracção MP1 e a MeLMW produziu um aumento significativo nos parâmetros de HM e TS. A combinação da fracção HMW (manoproteínas com baixo teor em proteína) com a MeLMW (tensioactivos derivados de ácidos gordos com gliceriletilenoglicol) contém os compostos chave de um vinho espumante para se obter uma maior quantidade e estabilidade da espuma.

Study of oxidation and non-enzymatic glycosylation posttranslational modifications using a proteomic approach

A glicosilação não-enzimática e o stress oxidativo representam dois processos importantes visto desempenharem um papel importante no que respeita às complicações de vários processos patofisiológicos. No presente, a associação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação de proteínas é reconhecida como sendo um dos principais responsáveis pela acumulação de proteínas não-funcionais que, por sua vez, promove uma contínua sensibilização para um aumento do stress oxidativo ao nível celular. Embora esteja disponível bastante informação no que respeita aos dois processos e suas consequências ao nível estrutural e funcional, permanecem questões por esclarecer acerca do que se desenvolve ao nível molecular. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação, proteínas modelo (albumina, insulina e histonas H2B e H1) foram submetidas a sistemas in vitro de glicosilação não-enzimática e oxidação em condições controladas e durante um período de tempo específico. A identificação dos locais de glicosilação e oxidação foi realizada através de uma abordagem proteómica, na qual após digestão enzimática se procedeu à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF). Esta abordagem permitiu a obtenção de elevadas taxas de cobertura das sequências proteicas, permitindo a identificação dos locais preferenciais de glicosilação e oxidação nas diferentes proteínas estudadas. Como esperado, os resíduos de lisina foram os preferencialmente glicosilados. No que respeita à oxidação, além das modificações envolvendo hidroxilações e adições de oxigénio, foram identificadas deamidações, carbamilações e conversões oxidativas específicas de vários aminoácidos. No geral, os resíduos mais afectados pela oxidação foram os resíduos de cisteína, metionina, triptofano, tirosina, prolina, lisina e fenilalanina. Ao longo do período de tempo estudado, os resultados indicaram que a oxidação teve início em zonas expostas da proteína e/ou localizadas na vizinhança de resíduos de cisteína e metionina, ao invés de exibir um comportamente aleatório, ocorrendo de uma forma nãolinear por sua vez dependente da estabilidade conformacional da proteína. O estudo ao longo do tempo mostrou igualmente que, no caso das proteínas préglicosiladas, a oxidação das mesmas ocorreu de forma mais rápida e acentuada, sugerindo que as alterações estruturais induzidas pela glicosilação promovem um estado pro-oxidativo. No caso das proteínas pré-glicosiladas e oxidadas, foi identificado um maior número de modificações oxidativas assim como de resíduos modificados na vizinhança de resíduos glicosilados. Com esta abordagem é realizada uma importante contribuição na investigação das consequências do dano ‘glico-oxidativo’ em proteínas ao nível molecular através da combinação da espectrometria de massa e da bioinformática.