Estrutura populacional e filogeografia de Panulirus argus (Latreille, 1804)

Panulirus argus (Latreille, 1804) é uma das principais espécies de lagosta no Atlântico, sendo um dos maiores recursos pesqueiros do Atlântico Ocidental, onde apresenta um alto valor comercial. A forte explotação da espécie resulta em uma grande pressão sobre suas populações. Recentemente, foi descoberto que sob o binômio P. argus estão contidas duas espécies crípticas que ocorrem em alopatria, uma na região do Caribe e outra na costa brasileira. Esta tese tem como objetivo estudar como se estruturam geneticamente as populações dessas duas espécies, com o propósito de fornecer mais informações para a determinação de estoques e um correto manejo das espécies, e analisar os processos históricos evolutivos que moldaram suas histórias demográficas. Para tal, foram estudados dois marcadores mitocondriais (região controle e o gene da Citocromo Oxidase I) e loci de microssatélites de indivíduos de 7 regiões do Caribe (Florida, Bahamas, Turks e Caicos, Porto Rico, Cuba, Colômbia e Venezuela) e 11 estados do Brasil (Pará, Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo). Dentro de cada espécie foram observadas duas linhagens mitocondriais diferentes, que co-ocorriam, de maneira homogênea, ao longo de suas distribuições. Hipotetiso que essas linhagens foram formadas a partir de um evento de vicariância com contato secundário ou como consequência de um efeito gargalo seguido de expansão. As duas linhagens são evidentes nas sequências da região controle mitocondrial, mas no gene da COI foram evidentes apenas em P. cf. argus do Caribe. As linhagens do Brasil se separaram há aproximadamente 233 - 288 mil anos e cada uma sofreu expansão em tempos diferentes, a primeira se expandiu há 100 mil anos e a segunda linhagem há 50 mil anos. As linhagens do Caribe se separaram cerca de 1 milhão de anos atrás e possuem o mesmo tempo de expansão, 50 mil anos. Os microssatélites não revelaram subdivisão populacional para nenhuma das duas espécies, porém os marcadores, juntos, sugeriram um fluxo gênico diferenciado entre localidades expostas a diferentes correntes marítimas. Considerando que essas lagostas são intensamente explotadas, é importante ser cuidadoso no momento de definir estoques pesqueiros. Para a espécie do Brasil, dois estoques pesqueiros foram sugeridos, o primeiro do Pará à Bahia e o segundo do sul da Bahia a São Paulo. Para a espécie do Caribe, foi mantida e reforçada a hipótese de quatro estoques sugerida pela FAO (Norte, Sul, Centro-Norte e Centro-Sul).

Differenzierung von Kammmuscheln durch DNA-Analyse

Abstract In the last years scallops have reached a considerable popularity and the import of scallops into the EU has increased about 20 % over the last fi ve years from some 50.000 t to nearly 63.000 t in the year 2010. Scallops are fi shed or farmed, and traded as fresh or deep frozen product. Recently investigation of scallop products of various origins by determining the species using molecular biological techniques showed that the species had been mislabelled in a considerable proportion of samples. Determination of the species was performed by PCR-based DNA-analysis of mitochondrial DNA followed by (i) sequencing the PCR product and (ii) comparison of the DNA sequence with entries in GenBank using BLAST. The deduced sequences of the analysed samples were considerably different from each other allowing the unambiguous assignment of samples to a certain species. Kurzfassung Die Nachfrage von Kammmuscheln in der EU hat in den letzten fünf Jahren erheblich zugenommen. Der Import stieg von knapp 53.000 t im Jahr 2005 um 20% auf annähernd 63.000 t im Jahr 2010. Gehandelt werden Kammmuscheln sowohl als frische als auch als Tiefkühlware aus Wildfängen und Aquakultur. Untersuchungen von Kammmuschel-Proben aus verschiedenen Ursprungsländern und Bestimmung der Spezies auf molekularbiologischer Basis zeigten, dass ein erheblicher Anteil der Proben falsch deklariert war. Die Bestimmung der Spezies erfolgte durch Vervielfältigung eines Abschnitts des 16S rRNA Gens durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR), anschließender Sequenzanalyse der PCR-Produkte und Vergleich der DNA Sequenzen untereinander und mit Dateneintragungen in GenBank. Die DNA-Sequenzen der ermittelten Abschnitte der 16S rRNA der Proben unterschieden sich erheblich voneinander und erlaubten eine eindeutige Zuordnung zu jeweils einer Spezies.

Diversidade genética em um grupo de anuros em miniatura endêmico da Mata Atlântica brasileira (Euparkerella Griffiths 1959).

A Mata Atlântica (MA) está entre as regiões com maior biodiversidade e mais ameaçadas do planeta. Esforços em diversas áreas do conhecimento têm sido feitos para que se tenha uma estimativa mais refinada da diversidade existente e sua organização ao longo do bioma. O crescente número de estudos que buscam reconstituir a história da diversificação da MA apontam para um cenário espacial e temporal complexo, havendo ainda uma lacuna no conhecimento dos processos em pequena escala. Vertebrados em miniatura têm se mostrado uma boa ferramenta para estudos de processos evolutivos em pequena escala. Assim, o gênero Euparkerella, endêmico de uma pequena região da MA dos Estados do Rio de Janeiro (RJ) e Espírito Santo (ES), foi escolhido como modelo para este estudo. No primeiro capítulo buscou-se descrever a diversidade existente dentro do gênero a partir de uma filogenia molecular. Para isso, utilizaram-se métodos bayesianos para gerar genealogias de genes e de espécies a partir de um fragmento de gene mitocondrial e quatro fragmentos de genes nucleares. Os resultados obtidos apontaram para uma grande diversidade críptica no gênero. Foram identificadas seis unidades evolutivas significativamente divergentes para o RJ: duas em Euparkerella cochranae, três em Euparkerella brasiliensis, e Euparkerella sp.. A espécie mais basal recuperada foi Euparkerella robusta, do ES, e estimou-se o início da diversificação do gênero para o final do Mioceno. O segundo capítulo descreve onze marcadores de microssatélites desenvolvidos para Euparkerella brasiliensis através do método de pirosequenciamento de nova geração 454. No terceiro capítulo estudou-se apenas uma unidade evolutiva, Euparkerella brasiliensis da área dos Três Picos/ RJ. A partir de marcadores de evolução rápida (microssatélites) e lenta (sequências de DNA) buscou-se compreender a estrutura e a dinâmica populacional desta unidade evolutiva em uma área bastante pequena (aprox. 20 km) sob influência de um gradiente ambiental altitudinal (40 m 1000 m). Foram identificadas, a partir dos microssatélites, duas subpopulações geneticamente distintas nas bordas do gradiente. O fluxo gênico se deu predominantemente das bordas para a zona de contato, onde foi observado o maior efetivo populacional. Tais resultados indicam que pequenas variações ambientais podem atuar no isolamento populacional em Euparkerella e corroboram o padrão de formas microendêmicas identificadas na filogenia. Futuros estudos devem ser feitos no sentido de buscar caracterizar morfologicamente as unidades evolutivas aqui identificadas; preencher as lacunas amostrais, especialmente no ES; e descrever os processos que atuam em pequena escala nas zonas de contato entre as unidades evolutivas e fatores limitantes a distribuição das mesmas.

Estudo do reparo das lesões induzidas no DNA de Escherichia coli pela radiação ultravioleta C (UVC)

Didaticamente, podemos dividir o espectro da radiação ultravioleta (UV) em três faixas: UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC (290 a 100 nm). Apesar do UVC ou UV-curto ser eficientemente filtrado pela camada de ozônio da Terra e sua atmosfera, este é uma das faixas do espectro de UV mais usadas para explorar as consequências de danos causados ao DNA, já que a letalidade induzida por este agente está relacionada aos danos diretos no genoma celular, como as lesões dímero de pirimidina, que são letais se não reparadas. Contudo, demonstrou-se que a radiação UVC pode gerar espécies reativas de oxigênio (ERO), como o oxigênio singleto (1O2). Embora, o radical hidroxil (OH) cause modificações oxidativas nas bases de DNA, alguns trabalhos indicam que o 1O2 também está envolvido nos danos oxidativos no DNA. Esta ERO é produzida por vários sistemas biológicos e reações fotossensibilização, quando cromóforos são expostos à luz visível ou são excitados pela luz UV, permitindo que essa energia possa ser transferida para o oxigênio sendo convertido em 1O2, que é conhecido por modificar resíduos de guanina, gerando 8-oxoG, que caso não seja reparada pode gerar uma transversão GC-TA. O objetivo deste trabalho foi o de elucidar a participação de ERO nos efeitos genotóxicos e mutagênicos gerados pela radiação UVC, assim como as enzimas envolvidas no processo de reparação destas lesões em células de Escherichia coli. Nos ensaios as culturas foram irradiadas com o UVC (254 nm; 15W General Electric G15T8 germicidal lamp, USA). Nossos resultados mostram que o uso de quelantes de ferro não alterou a letalidade induzida pelo UVC. A azida sódica, um captador de 1O2, protegeu as cepas contra os danos genotóxicos gerados pelo UVC e também diminuiu a frequência de mutações induzidas no teste com rifampicina. A reversão específica GC-TA foi induzida mais de 2,5 vezes no ensaio de mutagênese. A cepa deficiente na proteína de reparo Fpg, enzima que corrige a lesão 8-oxoG, apresentou menos quebras no DNA do que a cepa selvagem no ensaio de eletroforese alcalina. A letalidade induzida pelo UVC foi aumentada nos mutantes transformados com o plasmídeo pFPG, ao mesmo tempo que representou uma redução na indução mutagênica. Houve dimuição na eficiência de transformação com plasmídeo pUC 9.1 na cepa fpg quando comparado a cepa selvagem. Assim como, um aumento da sensibilidade ao UVC na associação entre mutantes fpg e uvrA. Estes resultados mostram que o 1O2 participa dos danos induzidos pelo UVC, através da geração da lesão 8-oxoG, uma lesão mutagênica, que é reparada pela proteína Fpg

Distribuição e conservação dos genes que codificam as proteínas VgrG e Hcp em espécies de Aeromonas

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo

Ecologia molecular de ostras (Crassostrea spp.) do Atlântico Tropical

Crassostrea (Sacco, 1897) é o gênero mais importante do mundo de ostras de cultivo e consiste de 34 espécies distribuídas pelas regiões tropicais e temperadas do globo. C. gasar e C. rhizophorae são as duas espécies nativas que estão distribuídas ao longo de toda a costa do Brasil até o Caribe. C. gasar também ocorre na costa da Africa. Ainda que sua distribuição seja extensa e com disponibilidade abundante, o cultivo de ostras nativas no Brasil ainda é incipiente e a delimitação correta dos estoques mantém-se incerta. O sucesso do desenvolvimento da malacocultura, que é recomendada internacionalmente como forma sustentável de aquicultura, depende da resolução desses problemas. Assim, com o objetivo de determinar geneticamente seus estoques no Atlântico como também estimar sua história demográfica, dois diferentes marcadores moleculares foram empregados: sequências de DNA da região controle mitocondrial e loci de microssatélites espécie-especifícos, desenvolvidos no presente estudo. Foram sequenciados fragmentos da região controle de um total de 930 indivíduos de C. gasar e C. rhizophorae coletados em 32 localidades que incluíram o Caribe, a Guiana Francesa, a costa brasileira e a África. Também foram realizadas genotipagens de 1178 indivíduos, e ambas as espécies, com 9 e 11 loci de microssatélites para C. gasar e C. rhizophorae, respectivamente. Os dados genéticos foram analisados através de diferentes abordagens (índices de estruturação (FST) e de (Jost D), análise molecular de variância (AMOVA), análise espacial molecular de variância (SAMOVA), Bayesian Skyline Plots (BSP), análise fatorial de correspondência (AFC) e análise de atribuição Bayesiana (STRUCTURE)). Os resultados indicaram um padrão geral de estruturação, onde dois diferentes estoques foram detectados para ambas as espécies: grupos do norte e do sul, onde o Rio de Janeiro seria a região limitante entre os dois estoques. Os maiores valores dos índices de estruturação foram encontrados para C. gasar, indicando que esta espécie estaria mais estruturada do que C. rhizophorae. As análises demográficas indicaram uma provável expansão das populações durante o ultimo período glacial e uma possível origem americana das populações africanas. Todos os resultados sugeriram a existência de uma barreira geográfica próxima ao Rio de Janeiro, que poderia ser a cadeia de Vitória-Trindade e o fenômeno de ressurgência que ocorre em Cabo Frio (RJ). Esses resultados serão de grande utilidade para estabelecer critérios para seleção de sementes para cultivo ao longo da costa do Brasil que permitirá o manejo adequado dos estoques ostreícolas, prevenindo seu desaparecimento como já ocorrido em outros recifes no mundo.

Surface mucous as a source of genomic DNA from Atlantic billfishes (Istiophoridae) and swordfish (Xiphiidae)

Procedures for sampling genomic DNA from live billfishes involve manual restraint and tissue excision that can be difficult to carry out and may produce stresses that affect fish survival. We examined the collection of surface mucous as a less invasive alternative method for sourcing genomic DNA by comparing it to autologous muscle tissue samples from Atlantic blue marlin (Makaira nigricans), white marlin (Tetrapturus albidus), sailfish (Istiophorus platypterus), and swordfish (Xiphias gladius). Purified DNA from mucous was comparable to muscle and was suitable for conventional polymerase chain reaction, random amplified polymorphic DNA analysis, and mitochondrial and nuclear locus sequencing. The nondestructive and less invasive characteristics of surface mucous collection may promote increased survival of released specimens and may be advantageous for other marine fish genetic studies, particularly those involving large live specimens destined for release.

Evolutionary associations between sand seatrout (Cynoscion arenarius) and silver seatrout (C. nothus) inferred from morphological characters, mitochondrial DNA, and microsatellite markers

The evolutionary associations between closely related fish species, both contemporary and historical, are frequently assessed by using molecular markers, such as microsatellites. Here, the presence and variability of microsatellite loci in two closely related species of marine fishes, sand seatrout (Cynoscion arenarius) and silver seatrout (C. nothus), are explored by using heterologous primers from red drum (Sciaenops ocellatus). Data from these loci are used in conjunction with morphological characters and mitochondrial DNA haplotypes to explore the extent of genetic exchange between species offshore of Galveston Bay, TX. Despite seasonal overlap in distribution, low genetic divergence at microsatellite loci, and similar life history parameters of C. arenarius and C. nothus, all three data sets indicated that hybridization between these species does not occur or occurs only rarely and that historical admixture in Galveston Bay after divergence between these species was unlikely. These results shed light upon the evolutionary history of these fishes and highlight the genetic properties of each species that are influenced by their life history and ecology.

Mitochondrial DNA markers to identify commercial spiny lobster species (Panulirus spp.) from the Pacific coast of Mexico: an application on phyllosoma larvae

Molecular markers based on mitochondrial DNA (mtDNA) are extensively used to study genetic relationships. mtDNA has been used in phylogenetic studies to understand the evolutionary history of species because it is maternally inherited and is not subject to genetic recombination (Gyllensten et al., 1991). The high mutation rate of mtDNA makes it a useful tool for differentiating between closely related species (Brown et al., 1979)—a tool that is especially important when significant variations occur between species, but not within species (Hill et al., 2001; Blair et al., 2006; Chow et al., 2006a).

Atividade in vitro da pterocarpanoquinona LQB-118 sobre o Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é endêmica na América Latina sendo considerada uma doença negligenciada com grande impacto socioeconômico. A infecção é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi que é transmitido pela forma vetorial, entre outros mecanismos. O tratamento consiste basicamente no uso de dois fármacos, o benznidazol e o Nifurtimox que apresentam uma série de efeitos colaterais e atuam muito pouco nas formas amastigotas intracelulares o que faz com que o tratamento atual seja restrito e insatisfatório.Várias atividades farmacológicas foram atribuídas ao lapachol e a pterocarpanos, tais como atividade antitumoral e antiparasitária. Devido a esse potencial foi sintetizado uma molécula híbrida, a pterocarpanoquinona LQB-118, e algumas moléculas derivadas. A LQB-118 mostrou anteriormente atividade antitumoral e anti-Leishmania. O objetivo do presente trabalho foi investigar a atividade in vitro da LQB-118 e suas moléculas derivadas sobre o Trypanosoma cruzi clone Dm28c. Para avaliação inicial do efeito anti-parasitário das moléculas, amastigotas intracelulares, tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas foram incubados com 20 M das LQBs 118, 168, 187, 182 e 236. A LQB-118 demonstrou atividade antiparasitária nas três formas evolutivas (90% na forma amastigota, 44% na forma tripomastigota e 70% na forma epimastigota) do parasito, enquanto as moléculas derivadas não mostraram atividade significativa. Sendo assim os estudos foram continuados com a molécula LQB-118. A ação da LQB-118 sobre as amastigotas intracelulares foi dose dependente, com redução do índice de infecção em 81% e 88% nas concentrações de 20 e 30 M respectivamente. Já sobre tripomastigotas, a LQB-118 foi menos ativa reduzindo a mobilidade dessas formas em até 45% a 30 M. Sobre a forma epimastigota a ação foi dose-dependente chegando a inibir 96% o crescimento dos parasitos a 20 M, com alterações da morfologia tais como arrendondamento do corpo celular e perda do flagelo. A dose capaz de inibir 50% foi de 4,2 M para amastigota intracelular e 38,1 M para tripomastigotas. Para macrófagos, a LC50 ficou em 40 M, uma concentração quase dez vezes maior que a IC50 para amastigotas. A capacidade das formas amastigotas intracelulares se diferenciarem em tripomatigotas e lisar os macrófagos foi avaliada após o tratamento com a LQB-118 por 72h. Observou-se um atraso do ciclo intracelular do parasito de modo dose-dependente, onde na concentração de 30 M o surgimento de tripomastigota foi no 9 dia enquanto nos controles foi no 5 dia de cultura. Para delinear o mecanismo de ação, foi avaliado o efeito direto sobre o parasito como a indução da fragmentação de DNA. A análise de indução da fragmentação do DNA feita pela marcação pelo TUNEL mostrou que o tratamento com a LQB-118 induziu seletivamente a fragmentação do núcleo das amastigotas enquanto o núcleo dos macrófagos se mantiveram íntegros. Macrófagos peritoneais pré-tratados com LQB-118 por 24 horas foram capazes de reduzir o número de amastigotas após 72h de cultivo na ausência da molécula, mas sem alteração na produção de óxido nítrico. Esses resultados mostram que a LQB-118 é ativa contra o T. cruzi, principalmente sobre a forma amastigota intracelular, que é a forma presente na fase crônica da infecção. O mecanismo de ação sugere que a LQB-118 é capaz de ser seletivamente tóxica para o parasito e também ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos de modo independente da produção de óxido nítrico.

Genetic variability in spotted seatrout (Cynoscion nebulosus), determined with microsatellite DNA markers

Variation in the allele frequencies of five microsatellite loci was surveyed in 1256 individual spotted seatrout (Cynoscion nebulosus) obtained from 12 bays and estuaries from Laguna Madre, Texas, to Charlotte Harbor, Florida, to St. John’s River on the Florida Atlantic Coast. Texas and Louisiana collection sites were resampled each year for two to four years (1998−2001). Genetic differentiation was observed. Spotted seatrout from Florida waters were strongly differentiated from spotted seatrout collected in Louisiana and Texas. The greatest genetic discontinuity was observed between Tampa Bay and Charlotte Harbor, and Charlotte Harbor seatrout were most similar to Atlantic Coast spotted seatrout. Texas and Louisiana samples were not strongly structured within the northwestern Gulf of Mexico and there was little evidence of temporal differentiation within bays. These findings are contrary to those of earlier analyses with allozymes and mitochondrial DNA (mtDNA) where evidence of spatial differentiation was found for spotted seatrout resident on the Texas coast. The differences in genetic structure observed among these markers may reflect differences in response to selective pressure, or may be due to differences in underlying genetic processes.