922 resultados para fluxo urinário


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Dissertação apontada para cumprimentos dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Antropologia – Natureza e Conservação

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RESUMO - Durante todo o seu ciclo de vida, o medicamento está sujeito a padrões de qualidade, segurança e eficácia, alicerçados numa atuação conjunta dos responsáveis pela sua colocação no mercado, das autoridades competentes nacionais e comunitárias. Os diferentes intervenientes estão sujeitos a um conjunto de obrigações e procedimentos que englobam também a sua fase final de retirada do mercado, devolução, recolha e valorização ou reciclagem. Neste trabalho é caracterizada a cadeia de distribuição do medicamento assim como o seu fluxo físico no sentido inverso, ou seja, o processo de devolução e de tratamento ambientalmente adequado para os resíduos de medicamentos. A maioria da literatura a respeito das devoluções de medicamentos enfatiza a vertente ecológica do sistema de logística inversa. Neste trabalho, as questões ambientais são discutidas , mas o objectivo primário focaliza questões económicas relacionadas com o processo de devoluções. São apresentadas as possíveis vantagens teóricas da criação de um sistema centralizado de gestão de devoluções, por oposição ao atual sistema de circuitos dispersos. Com a aplicação de um inquérito a armazenistas com larga responsabilidade no processo de devoluções, pretendeu-se avaliar os custos inerentes ao atual modelo. Os resultados obtidos indicam que existe margem potencial para reduzir custos neste processo, para a grande maioria dos armazenistas. Na área específica dos medicamentos fora de prazo de validade, o crescente desenvolvimento e aperfeiçoamento dos processos de devolução poderá direcionar-se no sentido da criação de centrais de devolução centralizadas.

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Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

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Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em História Contemporânea

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Num mundo cada vez mais globalizado, mais de metade da população (54%) reside em áreas urbanas. Espera-se que este valor alcance os 66% em 2050, o que se reflecte num acelerado processo de urbanização do planeta nas últimas seis décadas. Enquanto o planeta se torna cada vez mais urbano, surgem desafios ao seu desenvolvimento sustentável em centros urbanos, com particular incidência nas cidades de países em desenvolvimento. Tal exige que sejam adoptadas políticas integradas para melhorar a qualidade de vida da sua população. As regiões do continente africano e asiático são as que apresentam a taxa de urbanização mais acelerada do mundo. Em África espera-se que mais de 50% do continente esteja urbanizado em 2040. Em menos de um século, a população rural mundial decresceu de 80% para 45%. Numa altura em que a maioria da população africana (62,1%) contínua ainda rural, e o crescimento urbano atinge os 4% por ano, a pobreza contínua um fenómeno massivo nos países em vias de desenvolvimento, representando 70% da população. Neste sentido, esta dissertação tem como objectivo compreender os modelos e os processos para a infraestruturação das áreas rurais nos países em desenvolvimento. Decorrente desse estudo é proposta uma abordagem metodológica que, tendo por base um conjunto de indicadores, se avalia e analisa o caminho da urbanização nas áreas rurais. A urbanização das grandes cidades africanas tende a concentrar-se de forma desordenada, desequilibrada e sem capacidade de absorver novos emigrantes. O fracasso do planeamento urbano e do sector da construção, no que diz respeito às habitações, conduziu ao desenvolvimento de subúrbios não infraestruturados. A expectativa de obter melhor qualidade de vida nestas áreas raramente se torna realidade, e os emigrantes deparam-se com habitações de caracter provisório, inadequado acesso a serviços básicos e falta de oportunidades de emprego. O fluxo migratório rural-urbano pode ser minimizado se forem criadas alternativas compensadoras e competitivas de urbanização nas áreas rurais. Concluiu-se que a adopção de um conjunto de parâmetros e indicadores pode potenciar o desenvolvimento de um guia orientador para equipas de planeamento e identidades oficiais que pretendam construir um modelo para urbanização em áreas rurais, com especial destaque para regiões Africanas.

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RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

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RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

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O intenso fluxo migratório na Europa nas últimas décadas, em função do desemprego e de carências sociais e económicas noutras regiões, que obrigou as populações a deslocarem-se para outros territórios em busca de melhores condições de vida, conduziu a novos questionamentos. Esta nova reconfiguração populacional originou novas gerações de imigrantes espalhados pela Europa. Portugal não fica atrás desta mudança, pelo contrário, pois é um dos países dentro da União Europeia (UE) que mais acolhe os imigrantes. Perante estas novas mudanças na Europa, nomeadamente em Portugal, como estas novas gerações de imigrantes veem esta nova realidade? Quais são os seus sonhos e objetivos? O que eles pensam acerca do futuro? O presente estudo tem por objetivo saber o que pensam os jovens imigrantes e economicamente desfavorecidos num mundo cada vez mais globalizado, pois acredita-se que a forma como vemos o mundo irá definir não somente o futuro de cada indivíduo mas também o futuro do país onde vivemos. A escola, como um dos principais meios para o desenvolvimento integral dos seus alunos, tem um papel definitivo na sua formação. Por isso, o presente trabalho realizou uma investigação empírica com alunos do 1º, 2º e 3º ciclos de origem portuguesa, africana, brasileira e ucraniana numa Escola em Lisboa, a fim de saber quais são os seus sonhos e expetativas em relação ao futuro. O trabalho divide-se em duas partes: a primeira compreende a apresentação de conceitos referentes à educação multicultural, contexto economicamente desfavorecido, jovem do ensino básico e economicamente desfavorecido, expetativas e autoestima em contexto escolar. Já na segunda parte, a investigação apresenta a metodologia, a qual tem uma abordagem qualitativa e exploratória. Neste capítulo houve dois procedimentos para a recolha de dados: o primeiro foi a aplicação de 35 questionários aos alunos e o segundo foi uma entrevista presencial com a Direção da Escola. Estas técnicas de recolha de informação permitiram-nos confrontar as expetativas dos jovens de origem imigrante e economicamente desfavorecida com as expetativas da Escola em relação a eles, apontando para uma clara dissonância face às ideias dos jovens e às da Instituição Educativa. Perante este cenário de divergências, o presente trabalho levanta questões para futuras investigações, entre elas: como a escola portuguesa trabalha a autoestima dos jovens imigrantes e economicamente desfavorecidos? Por que um professor tem a tendência de acreditar que um jovem de classe social desfavorecida não tem condições de chegar a um curso superior? Estas e outras questões ficam para futuras investigações

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Esta Memória de Projecto Cinco Lugares – No exercício da sua função funciona como um fluxo de ideias livres e inevitavelmente dispersas, que não são mais que uma consequência do pensamento sobre cada plano, cena e sequência que compõem o filme criado. A tese principal do filme, entre as várias ideias que nele se pretenderam elaborar, encontra reflexos e ressonâncias nas interpretações expressas ao longo dos vários capítulos iniciais. Assim, na Parte I (Caminhos do Tempo), faz-se uma contextualização teórica, com base nos textos de André Bazin, Gilles Deleuze e Marc Augé sobre as concepções de espaço e tempo, e analisam-se algumas das mais radicais obras do cinema contemporâneo (de Yasujirô Ozu, Robert Flaherty, Andy Warhol, Michael Snow a Victor Erice, Wang Bing, Abbas Kiarostami e James Benning). Esta contextualização e análise constituem fundamento à presente Memória, aprofundando-se a possibilidade do Tempo como categoria estrutural principal de um texto fílmico. Na Parte II, dá-se nota do percurso de Cinco Lugares, filme que congrega um conjunto de memórias sobre cinco lugares de uma cidade (Lisboa), ensurdecedora e em crescente movimento, e no qual se procurou registar, plano a plano, essas memórias pela, para usar uma expressão de Tarkovsky, “pressão do tempo no plano”. Iniciado no tempo do silêncio (público) do Pátio da Galé, o filme passou ao espaço privado e interior de uma habitação na Rua Nova do Loureiro, que a arquitectura tão naturalmente separa e resguarda do exterior. Do registo fílmico de um ritual religioso, numa Igreja de convento, transitámos para um dos lugares mais esquecidos da cidade, a Mãe d’Água/ Aqueduto das Águas Livres. Por fim, aportámos num antigo antro de loucura contida, o Pavilhão Panóptico do Hospital Miguel Bombarda, hoje museu de um conjunto de memórias – memórias que também constituem matéria de uma outra memória cinematográfica de João César Monteiro. Em comum, estes cinco lugares têm tudo e não têm nada. São arquitecturas que se estabelecem numa fronteira entre um interior e um exterior. São também matéria própria, constituída por tempos, espaços e identidades totalmente diferentes. São, ainda, cinco tipos de silêncio urbano e momentos de realidade documentados sob uma perspectiva de um mundo em aceleração. Em suma, os capítulos seguintes de ambas as Partes são uma das muitas conversas possíveis e inacabadas, qual coda num trecho musical, a ter sobre o que interessa verdadeiramente neste trabalho de projecto – o filme em si.

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RESUMO: O cancro colo-rectal (CCR) é um dos cancros que possui maior taxa de mortalidade a nível mundial. Em Portugal esta patologia é responsável pela morte de cerca de 3700 pessoas por ano, sendo que estes números aumentam de ano para ano. Ao longo das últimas décadas o papel das alterações genéticas na etiologia das patologias oncológicas tem vindo a ter cada vez mais um maior destaque. O número de estudos que avaliam a importância de polimorfismos, mutações, alterações na regulação génica e interacções entre genes no desenvolvimento destas patologias tem aumentado exponencialmente. Com o aumento do conhecimento da forma como estas alterações influenciam o desenvolvimento do cancro surgiram os primeiros meios de diagnóstico genético, levando assim a uma alteração da forma como são encarados o diagnóstico e a prevenção destas doenças. No CCR as formas hereditárias com alterações genéticas inequivocamente identificadas representam apenas 5% dos casos. Existem cerca de 25% que representam formas hereditárias para as quais ainda não foram estabelecidos os padrões de alterações genéticas subjacentes. Desta forma, estudos que venham contribuir para um maior conhecimento dos mecanismos moleculares responsáveis pelo aumento da susceptibilidade dos indivíduos para o desenvolvimento de CCR são extremamente importantes. O CCR é uma patologia multifactorial, onde factores genéticos interagem com factores ambientais no surgimento e desenvolvimento da doença. Assim, torna-se essencial integrar o estudo das alterações genéticas no contexto ambiental onde os indivíduos em estudo se encontram. No caso desta patologia um dos principais factores ambientais estudado é a nutrição. Vários estudos têm sido realizados ao longo dos últimos anos de forma a compreender como pode a ingestão dos nutrientes influenciar o desenvolvimento de CCR e de que forma interage com as alterações genéticas individuais. O ciclo do folato é um dos processos metabólicos onde o papel da nutrição em interacção com alterações genéticas mais tem sido estudado nos últimos anos. Deste cruzamento entre o estudo das alterações genéticas e ambientais surge a Nutrigenética. O conjunto de estudos da presente tese tem como objectivo aumentar o conhecimento do papel das alterações em genes do ciclo do folato, em interacção com factores nutricionais e de estilo de vida, não só no desenvolvimento de CCR, mas também de outra patologia do tracto gastrointestinal, a Doença de Crohn (DC), uma doença inflamatória muitas vezes associada como factor de risco para o desenvolvimento de CCR. Este estudo debruçou-se essencialmente no estudo dos genes timidilato sintetase (TYMS) e metionina sintetase (MTR) em populações com CCR e DC, bem como no padrão nutricional destas populações com particular incidência nos nutrientes envolvidos no ciclo do folato (folato, metionina, vitamina B6, vitamina B12). Analisando o conjunto de resultados obtidos para os estudos do CCR podemos concluir que quer a TYMS quer a MTR possuem um papel relevante na susceptibilidade para desenvolver esta patologia, assim como têm destaque no funcionamento do ciclo celular durante o processo oncogénico. Os resultados demonstram que os factores que levam a uma menor disponibilidade de grupos metil no ciclo de folato (baixos níveis de folato, alteração da actividade de MTR, elevada expressão de TYMS) constituem factores de risco, muito provavelmente por contribuírem para uma desregulação dos níveis de metionina disponível para a metilação do DNA da célula. Demonstram ainda que em células tumorais ocorrem alterações na regulação do ciclo do folato de forma a favorecer a síntese de DNA em detrimento da metilação do mesmo, alterando para isso a expressão dos genes de forma a que o fluxo de grupos metil provenientes do folato sejam encaminhados para a enzima TYMS. O polimorfismo de deleção 6pb da TYMS surge como um factor de diagnóstico e de prognóstico de CCR para a população portuguesa. Dos factores nutricionais analisados apenas o folato aparenta ter um papel relevante na modelação do risco de desenvolver CCR. Na doença de Crohn (DC) podemos verificar que a homocisteína e o seu metabolismo poderão contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da patologia. O aumento da homocisteína poderá ser o responsável por um aumento da resposta auto-imune do organismo, promovendo o aparecimento da DC. O polimorfismo A2756G MTR desempenha um papel preponderante como factor de diagnóstico da DC, tendo sido associado pela primeira vez a esta patologia. Tem também um papel importante no desenvolvimento da doença, uma vez que está associado a uma idade de diagnóstico mais baixa, sugerindo assim que o desenvolvimento da doença ocorre de forma mais precoce. Concluindo, com este estudo pensamos ter contribuído para um melhor entendimento do papel do ciclo do folato no desenvolvimento de CCR e DC, sendo um ponto de partida para futuras investigações que possam revelar cada vez melhor as complexas interacções metabólicas desta via e a sua influência nas patologias estudadas. Do nosso estudo destacamos a importância de uma análise global das várias etapas do ciclo do folato para que se possa compreender a dinâmica que se estabelece no desenvolvimento destas patologias, podendo diversas alterações, quer a nível genético quer a nível nutricional, exercerem efeitos diferentes consoante o estado dos restantes intervenientes do ciclo do folato. Acreditamos que no futuro este estudo permitirá que o conhecimento do ciclo do folato tenha cada vez mais uma relevância fundamental a nível de diagnóstico e terapêutica destas patologias.------------ ABSTRACT: Colorectal Cancer (CRC) is one of the cancers that have a higher rate of mortality worldwide. In Portugal this pathology is responsible for the deaths of about 3700 people per year, and these numbers increase each year. Over the past few decades the role of genetic changes in the etiology of oncological pathologies has had an increasingly greater emphasis. The number of studies that evaluate the importance of polymorphisms, mutations, changes in gene regulation and gene interactions in the development of these diseases has increased exponentially. With the increased knowledge of how these changes influence the development of cancer, appeared the first means for genetic diagnostic, leading to a change in the way diagnosis is seen and in the prevention of these diseases. In CRC the hereditary forms with clearly identified genetic changes represent only 5% of cases. There are about 25% representing hereditary forms for which the patterns of genetic changes haven’t been established. In this way, studies that will contribute to a greater understanding of the molecular mechanisms responsible for increased susceptibility of individuals to the CRC development are extremely important. CRC is a multifactorial pathology, where genetic factors interact with environmental factors in the emergence and development of the disease.Thus, it is essential to integrate the study of genetic changes in the environmental context of the individuals under study. In the case of this pathology one of the main environmental factors studied is nutrition. Several studies have been conducted over the past few years in order to understand how the intake of nutrients can influence the development of CRC and how nutrients interact with the individual genetic changes. The folate cycle is one of the metabolic processes where the role of nutrition in interaction with genetic alterations has been studied in recent years. This cross between the study of genetic and environmental changes developed Nutrigenetics. The set of studies of this thesis aims to increase awareness of the role of changes in genes of the folate cycle, in interaction with nutritional factors and lifestyle, not only in the development of CRC, but also of another pathology of the gastrointestinal tract, Crohn's disease (CD), an inflammatory disease often associated as a risk factor for the development of CRC. This study dealt mainly in the study of genes thymidylate synthase (TYMS) and methionine synthase (MTR) in populations with CRC and CD, as well as in the nutritional pattern of these populations with particular focus on nutrients involved in the folate cycle (folate, methionine, vitamin B6, vitamin B12). Analyzing the results obtained for the CRC studies we conclude that either the MTR TYMS have a relevant role in susceptibility to develop this pathology, and have an important role in the functioning of the cell cycle during oncogenesis. The results show that the factors that lead to a lower availability of methyl groups in folate cycle (low levels of folate, change the activity of MTR, high expression of TYMS) constitute risk factors, most likely by contribute to a dysregulation of methionine levels available for DNA methylation of the cell. Our results also demonstrate that in tumor cells occur changes in the regulation of the folate cycle in order to promote the synthesis of DNA, to the detriment of methylation of the same by changing the expression of genes so that the methyl groups from folate are forwarded to the TYMS enzyme reaction. The deletion polymorphism 6bp of TYMS emerges as a diagnostic and prognostic factor of CCR for the Portuguese population. Nutritional factors analyzed only folate appears to have a major role in modulating the risk of developing CCR.In Crohn’s disease (CD) we can check that homocysteine and its metabolism may contribute to the emergence and development of this pathology. Increased homocysteine may be responsible for an increase in the body's autoimmune response, promoting the emergence of CD. The polymorphism A2756G MTR plays a leading role as a factor of diagnosis of DC, having been associated with this pathology for the first time. It also has an important role in the development of the disease, since it is associated with a lower diagnostic age, suggesting that the development of the disease occurs earlier. In conclusion, our study has contributed to a better understanding of the role of folate cycle in the development of CRC and CD, being a starting point for future research that may prove increasingly complex metabolic interactions in this via and its influence on the pathologies studied. In our study we highlight the importance of a comprehensive analysis of the various steps of the folate cycle in order to understand the dynamics that settles in the development of these pathologies, and a number of amendments, whether at the genetic level or at the nutritional level, exercise different effects depending on the stage of the remaining participants in the folate cycle. We believe that in the future this study will allow the knowledge of folate cycle to have increasingly a fundamental relevance at the level of diagnosis and treatment of these diseases.

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RESUMO: Na descrição deste estudo foi utilizada a terminologia anatómica da Sociedade Brasileira de Anatomia adaptada ao português por J. A. Esperança-Pina de acordo com o tratado Anatomia Humana da Relação. Os actuais estudos sobre hipoacusia sensorioneural implicam um grupo crescente de situações, em que a lesão se situa ao nível da microvascularização coclear, daí que o conhecimento exacto da angiomorfologia normal se torne essencial na fase actual do conhecimento. A autora tem vindo a estudar, desde 1986, a angiomorfologia do ouvido Interno no modelo experimental, o Cobaio, utilizando várias técnicas microvasculares. sendo dado enfâse particular neste estudo à técnica de microscopia electrónica de varrimento em moldes vasculares. Os animais usados no presente estudo pertencem à espécie cavia porcellus, cobaio, por serem considerados na comunidade cientifica internacional como o melhor modelo experimental para estudo do ouvido interno, pelo facto de a morfologia coclear ser muito semelhante à do Homem e por isso ser um modelo fiável para cirurgia experimental e microdissecção. Este estudo foi realizado em 100 cobaios, cavia porcellus, de ambos os sexos com peso médio de 450g. A vascularização do ouvido interno, no cobaio como no homem, faz-se através dos ramos de divisão da artéria auditiva interna ou labiríntica. A artéria labiríntica origina-se como ramo colateral da artéria cerebelosa ântero-inferior a qual tem origem na artéria basilar ou na artéria vertebral. Embora no homem a artéria auditiva interna possa também destacar-se da artéria basilar e até da artéria vertebral, no cobaio em todos os casos estudados a sua origem verificou-se sempre na artéria cerebelosa ântero-inferior. A artéria labiríntica, ao passar abaixo do meato auditivo interno, divide-se na artéria vestibular anterior e na artéria coclear comum.A artéria vestibular anterior dirige-se para o nervo vestibular, emite vasa nervorum para este nervo e vasculariza o utrículo e os canais semicirculares. A artéria coclear comum origina dois ramos principais, a artéria vestíbulo‑coclear ou vestibular posterior no cobaio, a qual se destaca junto à espira basal da cóclea e a artéria coclear, como ramo terminal, que passa a denominar-se de artéria modiolar ou espiralada, após entrar no modíolo. A artéria modiolar ascende no modíolo promovendo através dos seus ramos colaterais e dos seus ramos terminais a microvascularização coclear, numa vascularização de órgão de tipo terminal. Ao longo do seu trajecto verificou‑se de modo constante uma redução gradual de calibre em cada uma das espiras, por emissão de ramos colaterais, sendo que o calibre da artéria na base da cóclea apresenta um valor que diminui gradualmente até ao ápice. A artéria modiolar origina em todo o seu trajecto ramos colaterais, cujo número diminui em valor absoluto da base para o ápice: Arteríolas radiárias internas, arteríolas de trajecto flexuoso que caminham junto às estruturas sensorioneurais da parede interna da cóclea, junto ao lábio timpânico da lâmina espiral óssea e na parede do próprio modíolo, que se relacionam intimamente com este. As arteríolas radiárias internas originam‑se no flanco da artéria modiolar espiralada. Contam‑se dez a doze em cada espira, extraordinariamente flexuosas desde a sua origem. As arteríolas radiárias internas originam como ramos colaterais, vários grupos de arteríolas de menor calibre, que vascularizam distintas regiões da parede interna da cóclea, as arteríolas do gânglio espiral, a rede espiral interna, as arteríolas de origem dos glomérulos de Schwalbe e a arteríola da lâmina basilar. As arteríolas radiárias externas importantes ramos colaterais da artéria modiolar espiralada promovem a vascularização de importantes estruturas da parede externa. Ao atingir o limite externo do ligamento espiral, as arteríolas radiárias externas dividem‑se em vários ramos arteriolares de menor calibre, ao longo da convexidade do limite externo do ligamento espiral, originando a rede capilar pós-estriada que ocupa a porção lateral do ligamento espiral e a rede capilar ad‑ -estriada, na sua porção mais medial em íntima relação com a estria vascular. A espira basal da cóclea apresenta grande riqueza de vascularização, com características particulares apenas a esta espira, a qual é metabolicamente a mais exigente. A arteríola da janela da cóclea aborda a janela da cóclea pela sua convexidade e divide-se numa rica rede vascular da qual emergem arteríolas pré-capilares que se ramificam em capilares, os quais se dirigem em profundidade penetrando a rampa timpânica da cóclea ao nível da espira basal. Importou neste estudo verificar quais as semelhanças em termos de calibre de estruturas análogas, na parede interna e na parede externa da cóclea, com particular incidência na rede capilar. Do estudo estatístico realizado com testes paramétricos de Tamahane e não paramétricos de Mann-Whitney, verifica-se que comparando todas as estruturas consideradas estas têm calibres diferentes, com excepção dos capilares da estria vascular e do ligamento espiral, pertencentes à parede externa da cóclea que têm calibres iguais aos capilares da rede espiral interna e aos capilares da parede interna da cóclea, dependentes das arteríolas da rede espiral interna. As redes capilares dependentes das arteríolas radiárias internas que vascularizam as estruturas sensorioneurais junto á parede interna do modiolo são em tudo semelhantes em termos de calibre às redes capilares da parede externa da cóclea, incluindo os capilares da estria vascular. Esta particularidade traduz num órgão com vascularização de tipo terminal,um mecanismo de controlo do fluxo sanguíneo coclear tão importante na parede interna como na parede externa da cóclea. ------------ ABSTRACT:Current studies on sensorineural hearing loss, imply a growing group of situations in which the lesion is located at the level of the cochlear microvasculature, hence the exact knowledge of normal angiomorfology becomes essential in current state of knowledge. The author has been studying since 1986, the angiomorfology of inner on the experimental model, the guinea pig, using various microvascular techniques being given particular emphasis in this study to the results of the technique of scanning electron microscopy on corrosion casts. The animals used in this study belong to the species cavia porcellus, guinea pig, to be considered in the international scientific community as the best experimental model for the study of the inner ear, the cochlear morphology is very similar to human and therefore a reliable model for experimental surgery and microdissection. This study was performed in 100 guinea pigs of both sexes with average weight of 450g. There shall be a brief description of embryology, anatomy and cochlear physiology in the light of developmental biology, regarding also the spatial location of the cochlea and the determinism of morphogenetic fields in their development and function. The cochlear transduction mechanism converts the sound wave in stimuli sound and so afferent auditory nerve fibres and deafness are closely related to the cochlear microvasculature. Cochlear ischemia is accompanied by immediate hearing loss. The different type of cochlear injury that leads to sensorineural deafness is well studied in presbycusis where an objective link with the audiometric pattern as been established. The sensory type of deafness, is closely related to the degeneracy of the organ of Corti and damage to the outer hair cells at the basal turn of the cochlea. Keeping in mind cochlear tonotopy with location of high frequency sounds at the level of the base of the cochlea, it explains the audiometric pattern with loss in high frequencies. The neural type of deafness, is characterized by neuronal loss with loss of descendant important neuronal afferents, with audiometric translation on a gradually curve with important loss of auditory discrimination. The metabolic type of deafness results in atrophy of the vascular stria, with consequent change in the potential of the endolymph by decreasing the vascular stria cells and changes in K + recycling mechanism. There is also a change in the morphology of the spiral ligament and the audiometric patern as a flattened curve with loss at all frequencies. Bearing in mind cochlear tonotopy and being characterized all types of sensorineural deafness, we may inquire to what extent the cochlear microvasculature, considering not only the cochlea as a whole but different regions of the inner wall and the outer wall of the cochlea, contributes to deafness. We analysed the entire cochlear morphology on scanning electron microscopy with particular emphasis on bone and membranous cochlea. The inner wall of the cochlea and intramodiolar structures such as the spiral ganglion, the morphology of its cell bodies and their axons are analyzed. The morphology of Corti’s organ is described in detail, with description and large detail of the inner and outer hair cells. Is then presented the study of the microvasculature itself. The spiral modiolar artery is observed with the diaphanization technique and the technique of scanning electron microscopy on corrosion vascular casts. After emergence of collateral branches of the greatest importance, the radiating internal and external arterioles, the modiolar artery gives rise to its terminal branches, the arterioles of the cochear apex. Arterial vasa vasorum and vasa nervorum are displayed with a great detail, which was not yet described in such detail in previous microvascular studies. The arterial radiating arterioles originate in the flank of the spiral modiolar artery in number of ten to twelve in each loop, and they vascularize through their branches the inner wall cochlear sensorineural structures located in the modiolus as the spiral ganglion and structures near the organ of Corti. Their caliber is above 20 μm on the basal turn and in the second loop it decreases to values between 12 and 20 μm, decreasing progressively to the apex of the cochlea.They arise near the modiolus or on their way in the spiral lamina forming vascular loops, and divide without presenting vascular constrictions in their divisions, originating new vascular loops of lower caliber. Internal ratiating arterioles originate as collateral branches several groups of smaller caliber arterioles, which vascularize distinct regions of the inner wall of the cochlea namely, the arterioles of the spiral ganglion, the internal spiral network, the arterioles of origin of the glomeruli of Schwalbe and the arterioles of the basilar membrane. The glomeruli of Schwalbe play an important functional role as relay-stations, in hemodynamic terms, to control the cochlear microvasculature. External radiating arterioles have their origin in the spiral modiolar artery, they are directed towards the outer wall of the cochlea and run through the roof of the scala vestibuli. Above the insertion of Reissner’s membrane on the external wall the external radiating arterioles originate the spiral ligament arterioles, which vascularize the spiral ligament, they divide into several arteriolar branches of smaller caliber, along the convexity of the outer edge of the spiral ligament. The connective tissue of the spiral ligament forms a mesh with supporting function of the highly specialized epithelium, where pericytes were identifiable. Next to its base there is the microvascular network of stria vascularis. The adstriated vascular network which is divided into a capillary network, the capillary network of stria vascularis. The stria vascularis, the only vascularized epithelium of the human body, plays an important role, forming an haemato-labyrintine barrier to assure labyrinthine endocochlear potential and transport of ions, essential for the mechanism of transduction of external hair cells. The cochlear basal turn has a special feature on its external wall, the region of the windows, the round windows giving access to scala tympani and the oval window thatleads into scala vestibuli, and so it is metabolic demanding. For their role in cochlear tonotopy the sensorineural structures and those of the external wall of the cochlea, are particularly vulnerable to hypoxia. Although the complementarity of all the techniques was important for three- -dimensional reconstruction of the microvasculature of the cochlea, the scanning electron microscopy technique, especially when we used the system Semafore was fundamental to perform precise morphometric mesures regarding all vascular structures.Regarding the capillaries of the inner and outer wall of the cochlea networks this technique allowed their characterization in morphometric terms. To conclude the capillaries of the inner wall and of the external wall of the cochlea have similar size. So although located at different cochlear regions, with a different functional role, in cochlear physiology these networks consist of capillaries of similar caliber. It seems to translate a cochlear blood flow control mechanism that is so important in the inner wall as in and the external wall of the cochlea to provide for in inner ear homeosthasia.

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A máquina elétrica de relutância comutada (MERC) é, inerentemente, um conversor eletromecânico de velocidade variável, facilmente controlado através dos instantes de excitação e desexcitação do circuito magnético partilhado pelas fases. A sua robustez e simplicidade construtiva (só enrolamentos concentrados no estator), flexibilidade de controlo, bom rendimento numa gama alargada de velocidades, a sua fiabilidade e tolerância a defeitos fazem desta máquina uma opção válida para sistemas de conversão de energia caraterizados por baixas velocidades. A tendência crescente de instalar turbinas eólicas em offshore, para além dos desafios económicos e tecnológicos que levanta, torna a fiabilidade e a tolerância a defeitos, requisitos de vital importância. Neste contexto, a potencial aplicação da MERC a geradores eólicos sem recurso a caixa de velocidades, já que esta penaliza o custo, o volume e a fiabilidade do sistema, serviu de motivação a este trabalho. Nesta dissertação apresentam-se, numa perspetiva comparativa, diferentes paradigmas construtivos da MERC para o funcionamento gerador em regime de baixas velocidades, caraterístico dos aproveitamentos de energias renováveis. Para o efeito, formularam-se leis de escala apropriadas a análises dimensionais de topologias diferenciadas pelas caraterísticas dos circuitos elétrico e magnético e do seu posicionamento relativo. Estes modelos de escala permitiram introduzir constrangimentos físicos e dos materiais que condicionam o projeto da máquina, como a saturação magnética e limites de temperatura. Das análises dimensionais e validação com elementos finitos, elegeu-se uma estrutura magnética modular com caminhos de fluxo curtos que foi comparada com um protótipo de MERC regular, previsto para equipar um gerador eólico. Quando comparadas as duas topologias, assumindo dimensões idênticas, a modular apresentou um significativo ganho de potência específica mantendo bons níveis de rendimento. Pretende-se assim alargar a discussão do projeto das MERC, geralmente confinado a topologias regulares, a um contexto mais abrangente que inclua novos paradigmas construtivos.

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RESUMO: O cancro do pulmão (LC), uma das principais causas de mortalidade relacionada com cancro em Portugal, pode levar à formação de metástases hematogénicas. A adesão das células tumorais ao endotélio é considerada um dos passos fundamentais envolvidos na metástase. Em células sanguíneas, esta adesão é mediada por ligandos de E-selectina (E-SL), glicoproteínas ou glicolípidos decorados principalmente com sialyl-Lewis x (sLex) e sialyl-Lewis a (sLea). Tem sido descrito a expressão destes antigénios em LC, contudo o seu papel funcional em permitir a adesão das células de LC ao endotélio é ainda pouco compreendido. Foram analisadas amostras emparelhadas normais e tumorais de pacientes com cancro de pulmão de não-pequenas células (NSCLC) e três linhas celulares de LC. Immunoblotting assays com anti-sLex/sLea e molécula quimérica de E-selectina demonstraram que tecidos tumorais de LC sobreexpressam significativamente E-SL e resultados de citometria de fluxo demonstraram uma expressão elevada de E-SL nas linhas celulares. Para compreender o mecanismo da sobreexpressão de E-SL em tecidos tumorais e linhas celulares de LC, foi analisada a expressão de genes envolvidos na biossíntese de E-SL, nomeadamente FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 e GALNT3. Observou-se a sobreexpressão das fucosiltransferases FUT3, FUT6 e FUT7 em tecidos tumorais de LC e FUT3 em linhas celulares de LC, sendo que neste último, esta expressão é correlacionada com um aumento da adesão das células de LC às selectinas endoteliais. Foi observado que uma baixa expressão de FUT4 em tecidos tumorais está associada com estadios menos avançados de NSCLC. Foram analisadas ainda proteínas decoradas com sLex/sLea, tendo-se identificado como E-SL o antigénio carcinoembrionário em NSCLC. Em resumo, esta tese contribuiu para uma melhor compreensão das alterações glicosídicas e moléculas que podem influenciar a progressão tumoral do LC, podendo permitir identificar futuramente novos biomarcadores de diagnóstico/prognóstico e potenciais alvos terapêuticos para o NSCLC.--------------------------ABSTRACT: Lung cancer (LC), one of the major causes of mortality related to cancer in Portugal, may lead to hematogenous metastasis. Adhesion of cancer cells to endothelium is considered one of the crucial steps involved in metastasis. In blood cells, this adhesion is initiated by endothelial selectin ligands (E-SL) that are glycoproteins or glycolipids decorated mostly with sialyl-Lewis x (sLex) and sialyl-Lewis a (sLea). While LC has been described as expressing these sialyl Lewis antigens, its functional role in allowing LC adhesion to endothelium is still poorly understood. We analyzed paired tumor and normal tissues samples from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients and three LC cell lines. Immunoblotting assays with anti-sLex/sLea and E-selectin chimera demonstrated that LC tumor tissues significantly overexpress E-SL and flow cytometry results indicated that E-SL are also abundantly expressed in LC cell lines. To understand the mechanism behind the overexpression of E-SL in LC tissues and cell lines, we analyzed the expression of genes involved in its biosynthesis, namely FUT3, FUT4, FUT6, FUT7, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, β4GALT1, GCNT1 and GALNT3. It was observed the overexpression of fucosyltransferases FUT3, FUT6 and FUT7 in LC tumor tissues and FUT3 in LC cell lines, being this last one correlated with an increased reactivity of the LC cells to endothelial selectins. It was described that low expression of FUT4 in tumor tissues is correlated with early stages of NSCLC. We also analyzed scaffolds proteins of sLex/sLea and it was identified the carcinoembryonic antigen as an E-SL in NSCLC. In summary, this thesis contributed to a better understanding of the glycosidic changes and molecules that can influence tumor progression of LC, allowing identifying in the future new diagnosis/prognosis biomarkers and potential therapeutic targets for NSCLC.

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RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

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O Praziquantel (PZQ) é o fármaco de primeira linha no tratamento da schistosomose, com alta taxa de cura e sem efeitos secundários significativos. Têm sido reportados cada vez mais casos de resistência ou de aumento de tolerância a este fármaco, aumentando as preocupações de emergência de estirpes resistentes ao PZQ. O Verapamil, um bloqueador de canais de cálcio, inibe o fluxo de fármaco activo e tem sido descrito como um bom inibidor das glicoproteínas-P (P-gp), sendo, por isso, utilizado em diversos estudos de fármaco-resistência. No laboratório de Helmintologia da Unidade de Ensino e Investigação em Parasitologia Médica do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, foi seleccionada uma linha de S. mansoni, resistente a 800 mg/Kg de PZQ, após pressão de fármaco constante e crescente ao longo de vários ciclos. Para confirmar a existência de diferenças polimórficas entre a estirpes sensível e resistente de S. mansoni, extraiu-se o DNA de parasitas adultos de ambas as estirpes de S. mansoni e analisou-se por Random Amplified Polymorphic DNAPolymerase Chain Reaction (RAPD-PCR). As diferenças polimórficas entre a estirpe sensível e a resistente foram observadas e calculou-se o coeficiente de similaridade (Dice’s coefficient). Após confirmar a existência de polimorfismos entre as duas estirpes, a atividade das bombas de efluxo foi avaliada em ambas as estirpes. A avaliação foi realizada num ensaio de acumulação usando o composto Brometo de Etídio na presença e ausência de Verapamil. O papel das bombas de efluxo na resistência ao PZQ, foi ainda investigado comparando a resposta dos parasitas da estirpe sensível e resistente ao fármaco na ausência e na presença de diferentes doses de Verapamil, em cultura in vitro. Os resultados obtidos foram reforçados comparando os níveis e expressão do gene SmMDR2 em ambas as estirpes isogénicas por Real-Time PCR (qPCR). A estirpe resistente de S. mansoni, necessitou de concentrações mais elevadas de inibidor quando comparada com a estirpe sensível para obter níveis significativos de fluorescência de Brometo de Etídio. A cultura in vitro mostrou uma dose letal de PZQ mais elevada na estirpe resistente do que na estirpe sensível na ausência de Verapamil. Na presença de Verapamil houve uma redução na dose letal de PZQ nos machos de ambas as estirpes, sendo esta redução mais acentuada nos machos da estirpe resistente. As fêmeas não mostraram alterações significativas na dose letal de PZQ na presença e ausência e inibidor. Os resultados foram reforçados pela observação dos níveis do gene SmMDR2, onde os machos da estirpe resistente mostraram ter os maiores níveis de expressão e pelo aumento de expressão nos machos de ambas as estirpes após exposição ao PZQ. As fêmeas de ambas as estirpes não tiveram diferenças significativas na expressão do gene após exposição ao PZQ e as fêmeas da estirpe resistente tiveram mostraram ter os níveis de expressão do gene SmMDR2 mais baixos entre os machos e fêmeas de ambas as estirpes. Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os machos da estirpe resistente têm maior atividade de bombas de efluxo do que os machos da estirpe sensível e que as bombas P-gp estão envolvidas na resposta e no aumento de tolerância dos machos de S. mansoni ao PZQ.