Epigenetic alterations and constitutive Wnt signaling are early events in the progression from Barrett's esophagus to esophageal adenocarcinoma

SUMMARY Barrett's esophagus (BE) is an acquired condition in which the normal squamous epithelium in the distal esophagus is replaced by a metaplastic columnar epithelium, as a complication of chronic gastroesophageal reflux. The clinical significance of this disease is its associated predisposition to esophageal adenocarcinoma (EAC). EAC is a highly lethal disease. Better understanding of the pathogenesis of columnar metaplasia and its progression to cancer might allow the identification of biomarkers that can be used for early diagnosis, which will improve the patient survival. In this study, an improved protocol for methylation-sensitive single-strand conformation analysis, which is used to analyze promoter methylation, is proposed and a methylation-sensitive dot blot assay is described, which allows a rapid, easy, and sensitive detection of promoter methylation. Both methods were applied to study the methylation pattern of the APC promoter in histologically normal appearing gastric mucosa. The APC promoter showed monoallelic methylation, and because the methylated allele differed between the different gastric cell types, this corresponded to allelic exclusion. The APC methylation pattern was frequently altered in noimal gastric mucosa associated with neoplastic lesions, indicating that changes in the pattern of promoter methylation might precede the development of neoplasia, without accompanying histological manifestations. An epigenetic profile of 10 genes important in EAC was obtained in this study; 5 promoter genes (APC, TIMP3, TERT, CDKN2A and SFRP1) were found to be hypermethylated in the tumors. Furthermore, the promoter of APC, TIMP3 and TERT was frequently methylated in BE samples from EAC patients, but rarely in BE samples that did not progress to EAC. These three biomarkers might therefore be considered as potential predictive markers for increased EAC risk. Analysis of Wnt pathway alterations indicated that WNT2 ligand is overexpressed as early as the low-grade dysplastic stage and downregulation by promoter methylation of the SFRP1 gene occurrs already in the metaplastic lesions. Moreover, loss of APC expression is not the only factor involved in the activation of the Wnt pathway. These results indicate that a variety of biologic, mostly epigenetic events occurs very early in the carcinogenesis of BE. This new information might lead to improved early diagnosis of EAC and thus open the way to a possible application of these biomarkers in the prediction of increased EAC risk progression. RESUME L'oesophage de Barrett est une lésion métaplasique définie par le remplacement de la muqueuse malpighienne du bas oesophage par une muqueuse cylindrique glandulaire, suite à une agression chronique par du reflux gastro-esophagien. La plus importante signification clinique de cette maladie est sa prédisposition au développement d'un adénocarcinome. Le pronostic de l'adénocarcinome sur oesophage de Barrett est sombre. Seule une meilleure compréhension de la pathogenèse de l'épithélium métaplasique et de sa progression néoplasique permettrait l'identification de biomarqueurs pouvant être utilisés pour un diagnostic précoce ; la survie du patient serait ainsi augmentée. Dans cette étude, un protocole amélioré pour l'analyse de la méthylation par conformation simple brin est proposé. De plus, une technique d'analyse par dot blot permettant une détection rapide, facile et sensible de la méthylation d'un promoteur est décrite. Les deux méthodes ont été appliquées à l'étude de la méthylation du promoteur du gène APC dans des muqueuses gastriques histologiquement normales. Le promoteur APC a montré une méthylation monoallélique et, parce que les allèles méthylés différaient entre les différents types de cellules gastriques, celle-ci correspondait à une méthylation allélique exclusive. La méthylation d'APC a été trouvée fréquemment altérée dans la muqueuse gastrique normale associée à des lésions néoplasiques. Ceci indique que des changements dans la méthylation d'un promoteur peuvent précéder le développement d'une tumeur, et cela sans modification histologique. Un profil épigénétique des adénocarcinomes sur oesophage de Barrett a été obtenu dans cette étude. Cinq promoteurs (APC, TIMP3, TERT, CDKN2A et SFRP1) ont été trouvés hyperméthylés dans les tumeurs. Les promoteurs d'APC, TIMP3 et TERT étaient fréquemment méthylés dans l'épithélium métaplasique proche d'un adénocarcinome et rarement dans l'épithélium sans évolution néoplasique. Ces trois biomarkers pourraient par conséquent être considérés comme marqueur prédicatif d'un risque accru de développer une tumeur. L'analyse des altérations de la voie Wnt a montré que WNT2 est surexprimé déjà dans des dysplasies de bas-grade et que la dérégulation de SFRP1 par méthylation de son promoteur intervenait dans les lésions métaplasiques. Une perte d'expression d'APC n'est pas le seul facteur impliqué dans l'activation de cette voie. Ces résultats montrent qu'une grande diversité d'événements biologiques, principalement épigénétiques, surviennent très tôt lors de la carcinogenèse de l'oesophage de Barrett. Ces nouveaux éléments pourraient améliorer le diagnostic précoce et rendre possible l'application de ces biomarqueurs dans la prédiction d'un risque accru de développer un adénocarcinome sur un oesophage de Barrett.

Test-retest repeatability of the pupil light response to blue and red light stimuli in normal human eyes using a novel pupillometer.

In this study, we evaluated the repeatability of pupil responses to colored light stimuli in healthy subjects using a prototype chromatic pupillometer. One eye of 10 healthy subjects was tested twice in the same day using monochromatic light exposure at two selected wavelengths (660 and 470 nm, intensity 300 cd/m(2)) presented continuously for 20 s. Pupil responses were recorded in real-time before, during, and after light exposure. Maximal contraction amplitude and sustained contraction amplitude were calculated. In addition, we quantified the summed pupil response during continuous light stimulation as the total area between a reference line representing baseline pupil size and the line representing actual pupil size over 20 s (area under the curve). There was no significant difference in the repeated measure compared to the first test for any of the pupil response parameters. In conclusion, we have developed a novel prototype of color pupillometer which demonstrates good repeatability in evoking and recording the pupillary response to a bright blue and red light stimulus.

Functions of the human papillomavirus type 16 E4 protein

1. Abstract Cervical cancer is thought to be the consequence of infection by human papillomaviruses (HPV). In the majority of cases, DNA from HPV type 16 (HPV16) is found in malignant cervical lesions. The initial steps leading to transformation of an infected cell are not clearly understood but in most cases, disruption and integration of the episomal viral DNA must take place. As a consequence, the E2 and E4 genes are usually not expressed whereas the E6 and E7 oncogenes are highly expressed. However, in a normal infection in which the viral DNA is maintained as an episome, all viral genes are expressed. The pattern according to which the viral proteins are made, and therefore the life cycle of the virus, is tightly linked to the differentiation process of the host keratinocyte. The study of the viral oncogenes E6 and E7 has revealed crucial functions in the process of malignant transformation such as degradation of the p53 tumor suppressor protein, deregulation of the Retinoblastoma protein pathway and activation of the telomerase ribonucleoprotein. All these steps are necessary for cancerous lesions to develop. However, the loss of the E2 gene product seems to be necessary for sufficient expression of E6 and E7 in order to achieve such effects. In normal infections, the E4 protein is made abundantly in the later stages of the viral life cycle. Though extensive amounts of work have been carried out to define the function of E4, it still remains unclear. In this study, several approaches have been used to try and determine the functions of E4. First, a cell-penetrating fusion protein was designed and produced in order to circumvent the chronic difficulties of expressing E4 in mammalian cells. Unfortunately, this approach was not successful due to precipitation of the purified fusion protein. Second, the observation that E4 accumulates in cells having modified their adhesion properties led to the hypothesis that E4 might be involved in the differentiation process of keratinocytes. Preliminary results suggest that E4 triggers differentiation. Last, as E4 has been reported to collapse the cytokeratin network of keratinocytes, a direct approach using atomic force microscopy has allowed us to test the potential modification of mechanical properties of cells harboring reorganized cytokeratin networks. If so, a potential role for E4 in viral particle release could be hypothesized. 2. Résumé Il a été établi que le cancer du col de l'utérus se développe essentiellement à la suite d'une infection par le virus du papillome humain (HPV). Dans la majorité des cas analysés, de l'ADN du HPV de type 16 (HPV16) est détecté. Les étapes initiales de la transformation d'une cellule infectée sont mal connues mais il semble qu'une rupture du génome viral, normalement épisomal, suivi d'une intégration dans le génome de la cellule hôte soient des étapes nécessaires dans la plupart des cas. Or il semble qu'il y ait une sélection pour les cas où l'expression des oncogènes viraux E6 et E7 soit favorisée alors que l'expression des gènes E2 et E4 est en général impossible. Par contre, dans une infection dite normale où le génome viral n'est pas rompu, il n'y pas développement de cancer et tous les gènes viraux sont exprimés. L'ordre dans lequel les protéines virales sont produites, et donc le cycle de réplication du virus, est intimement lié au processus de différentiation de la cellule hôte. L'étude des protéines oncogènes E6 et E7 a révélé des fonctions clés dans le processus de transformation des cellules infectées telles que la dégradation du suppresseur de tumeur p53, la dérégulation de la voie de signalisation Rb ainsi que l'activation de la télomérase. Toutes ces activités sont nécessaires au développement de lésions cancéreuses. Toutefois, il semble que l'expression du gène E2 doit être empêchée afin que suffisamment des protéines E6 et E7 soient produites. Lorsque le gène E2 est exprimé, et donc lorsque le génome viral n'est pas rompu, les protéines E6 et E7 n'entraînent pas de telles conséquences. Le gène E4, qui se trouve dans la séquence codante de E2, a aussi besoin d'un génome viral intact pour être exprimé. Dans une infection normale, le gène E4 est exprimé abondamment dans les dernières étapes de la réplication du virus. Bien que de nombreuses études aient été menées afin de déterminer la fonction virale à E4, aucun résultat n'apparaît évident. Dans ce travail, plusieurs approches ont été utilisées afin d'adresser cette question. Premièrement, une protéine de fusion TAT-E4 a été produite et purifiée. Cette protéine, pouvant entrer dans les cellules vivantes par diffusion au travers de la membrane plasmique, aurait permis d'éviter ainsi les problèmes chroniques rencontrés lors de l'expression de E4 dans les cellules mammifères. Malheureusement, cette stratégie n'a pas pu être utilisée à cause de la précipitation de la protéine purifiée. Ensuite, l'observation que E4 s'accumule dans les cellules ayant modifié leurs propriétés d'adhésion a suggéré que E4 pourrait être impliqué dans le procédé de différentiation des kératinocytes. Des résultats préliminaires supportent cette possibilité. Enfin, il a été montré que E4 pouvait induire une réorganisation du réseau des cytokératines. Une approche directe utilisant le microscope à force atomique nous a ainsi permis de tester une potentielle modification des propriétés mécaniques de cellules ayant modifié leur réseau de cytokératines en présence de E4. Si tel est le cas, un rôle dans la libération de particules virales peut être proposé pour E4.

Study of the physiological role of RasGAP cleavage

Résume Les caspases sont un groupe de protéases à cystéine qui s?activent lors de l'apoptose. Leur activation induit le clivage de nombreuses cibles intracellulaires, conduisant à l'activation de voies pro-apoptotiques et finalement au démantèlement des cellules. Cependant, des caspases ont été décrites dans de nombreux autres processus indépendants de l'apoptose, notamment dans la physiologie des cellules hématopoïétiques, des cellules musculaires, des cellules de la peau et des neurones. Comment est-ce que les cellules réconcilient-elles ces deux fonctions distinctes? Une partie de la réponse réside dans la nature des substrats qu'elles clivent. Certains substrats, une fois clivées, deviennent anti-apoptotiques. RasGAP est une cible des caspases et contient deux sites spécifiques de clivage par les caspases. Lorsque le niveau d?activité des caspases est faible le clivage de RasGAP produit un fragment N-terminal qui active un signal antiapoptotique, relayé par la voie de Ras/PI3K/Akt. Lorsque le niveau d?activité des caspases est plus élevé le fragment RasGAP N-terminal est à nouveau clivé, perdant de ce fait ses propriétés anti-apoptotiques. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que l'activation de la voie Ras/PI3K/Akt induite par le fragment RasGAP N-terminal dépend de RasGAP lui-même. Par ailleurs, dans le but d?étudier l?importance du clivage de RasGAP dans un contexte physiologique, nous avons développé un modèle animal exprimant une gêne mutée de RasGAP de sorte que la protéine est devenu insensible a l?action de caspases. Les données préliminaires obtenues montrent que le clivage de RasGAP n'est pas indispensable pour le développement et l?homéostasie chez la souris. Finalement, nous avons développé une souris transgénique surexprimant le fragment de RasGAP N-terminal dans les cellules ß du pancréas. Les animaux obtenus ne montrent pas de symptômes dans les conditions basales bien qu?ils soient plus résistants au diabète induit expérimentalement. Ces résultats montrent que la surexpression du fragment N-terminal de RasGAP protége efficacement les cellules ß du pancréas de l?apoptose induite par le stress sans pourtant affecter d?autres paramètres physiologiques des Ilot de Langerhans.<br/><br/>Caspases are a series of proteases that are activated during apoptosis. Their activation causes the cleavage of numerous intracellular targets, which leads to cell dismantling and activation of pro-apoptotic pathways. Caspases have been found to be involved in the physiology of numerous cell types including haematopoietic cells, muscle cells, skin cells and neurons. How cells conciliate these two opposite functions? Part of the answer lies in the nature of the substrates they cleave. Some substrates become anti-apoptotic once cleaved by caspases. RasGAP is a caspase substrate that possesses two conserved caspase-cleavage sites. At low caspase activity, RasGAP is first cleaved and the generated N-terminal fragment activates a potent anti-apoptotic signal, mediated by the Ras/PI3K/Akt pathway. At higher caspase activity, the N-terminal fragment is further cleaved thereby losing its anti-apoptotic properties. In the present study we show that the activation of the Ras/PI3K/Akt pathway mediated by RasGAP N-terminal fragment is dependent on RasGAP itself. Moreover, to study the role of RasGAP cleavage in a physiological model, we have developed a knock-in mouse model expressing a RasGAP mutant that is not cleavable by caspases. Preliminary data shows that RasGAP cleavage is not required for normal development and homeostasis in mice. Finally, we have developed a transgenic mouse model overexpressing RasGAP N-terminal fragment in the ß-cell of the pancreas. In basal conditions, these mice show no difference with their wt counterparts. However, they are protected against experimentally induced diabetes. These results indicate that fragment N can protect ? cells from stress-induced apoptosis without affecting other physiological parameters of the Islets.