A switch-on mechanism to activate maize ribosome-inactivating protein for targeting HIV-infected cells

Maize ribosome-inactivating protein (RIP) is a plant toxin that inactivates eukaryotic ribosomes by depurinating a specific adenine residue at the a-sarcin/ricin loop of 28S rRNA. Maize RIP is first produced as a proenzyme with a 25-amino acid internal inactivation region on the protein surface. During germination, proteolytic removal of this internal inactivation region generates the active heterodimeric maize RIP with full N-glycosidase activity. This naturally occurring switch-on mechanism provides an opportunity for targeting the cytotoxin to pathogen-infected cells. Here, we report the addition of HIV-1 protease recognition sequences to the internal inactivation region and the activation of the maize RIP variants by HIV-1 protease in vitro and in HIV-infected cells. Among the variants generated, two were cleaved efficiently by HIV-1 protease. The HIV-1 protease-activated variants showed enhanced N-glycosidase activity in vivo as compared to their un-activated counterparts. They also possessed potent inhibitory effect on p24 antigen production in human T cells infected by two HIV-1 strains. This switch-on strategy for activating the enzymatic activity of maize RIP in target cells provides a platform for combating pathogens with a specific protease.

APOBEC3G抗HIV一1作用机制研究进展

】APOBEC3G是细胞内新的广谱抗病毒蛋白。它具有胞苷脱氨酶活性，能使病毒负链 DNA产生dC--·dU高发突变，造成正链DNA G---A突变，使得病毒DNA变成无功能或降解。APO— BEC3G具有广泛的生物学功能，可以限制HIV-1等病毒复制，但HIV-1病毒感染因子Vii能拮抗 APOBEC3G抑制病毒活性作用。本文简要综述了APOBEC3G抑制病毒HIV-1作用机制的最新进 展。

Recombinant protein of heptad-repeat HR212, a stable fusion inhibitor with potent anti-HIV action in vitro

HR212, a recombinant protein expressed in Escherichia coli, has been previously reported to inhibit HIV-1 membrane fusion at low nanomolar level. Here we report that HR212 is effective in blocking laboratory strain HIV-1IIIB entry and replication with EC50 values of 3.92±0.62 and 6.59±1.74 nM, respectively, and inhibiting infection by clinic isolate HIV-1KM018 with EC50 values of 44.44±10.20 nM, as well as suppressing HIV-1- induced cytopathic effect with an EC50 value of 3.04±1.20 nM. It also inhibited HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 entry and replication in the μM range. Notably, HR212 was highly effective against T20-resistant strains with EC50 values ranging from 5.09 to 7.75 nM. Unlike T20, HR212 showed stability sufficient to inhibit syncytia formation in a time-of-addition assay, and was insensitive to proteinase K digestion. These results suggest that HR212 has great potential to be further developed as novel HIV-1 fusion inhibitor for treatment of HIV/ AIDS patients, particularly for those infected by T20-resistant variants.

HIV抗原抗体联合检测试剂盒适用于体外病毒感染p24抗原检测

比较Vironostika HIV UniformⅡAg/Ab抗原抗体联合检测试剂盒、Vironostika HIV-1 p24抗原检测试剂盒和自制p24单克隆抗体在实验室检测不同HIV毒株体外细胞感染复制的灵敏度。比较3种检测方法在抗HIV药物筛选研究中的应用。方法：HIV抗原抗体联合检测试剂盒和p24抗原检测试剂盒检测严格按说明书操作。自制p24单克隆抗体检测HIV-1 p24抗原采用Fc抗体捕捉双抗夹心法。结果: 3种检测方法检测病毒谱相同，p24抗原检测试剂盒灵敏度最高，HIV抗原抗体联合检测试剂盒其次，自制p24抗原检测法灵敏度最低。检测抗HIV药物AZT 和 IDV抑制病毒复制的剂量曲线，HIV抗原抗体联合检测试剂盒与自制p24抗原检测法均可呈现很好的“S”型剂量曲线，检测IC50一致。HIV抗原抗体联合检测试剂盒灵敏度比自制p24抗原检测法高20倍。p24抗原检测试剂盒灵敏度高但检测范围窄(5-80pg/mL)，导致剂量曲线不明显。 结论: HIV抗原抗体联合检测试剂盒适用于实验室体外病毒感染复制的p24抗原检测。

中国部分地区未经治疗HIV-1 感染者耐药基因研究

高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的应用，极大的降低了AIDS发病率和死亡 率，延长了HIV感染者的生命。但HIV耐药在很大程度上影响了HAART的疗效， 耐药株的产生成为影响抗病毒治疗效果的主要因素。欧洲、美国的耐药监测技术 规范均推荐在新感染未经抗病毒药物治疗的患者中进行原发耐药检测。我国政府 于2003年底出台了艾滋病治疗的“四免一关怀”政策，陆续在全国范围内开展了大 规模的免费抗病毒治疗，监测我国未经抗病毒药物治疗HIV-1感染者中的耐药情 况可以为制定合理的用药方案和减少耐药毒株出现提供科学依据。 根据世界卫生组织(WHO)的“HIV 耐药监测指南”，无偿献血者中的HIV-1 感染者，可以认定为HIV 新诊断未治疗人群。分析了云南无偿献血者的血浆和 外周血单核细胞(PBMC)，研究云南无偿献血人群的耐药状况。 已有实验室血清学方法识别HIV-1 新近感染和长期感染，用BED-CEIA 方 法，在河南、安徽、山西自愿咨询检测(VCT)人群中检出新近感染人群，进行耐 药基因研究, 对照研究了部分长期感染人群。 样品提取核酸后，巢式聚合酶链反应(nested-PCR)扩增pol 基因区(含蛋白酶 区1～99 氨基酸全长和逆转录酶区1～242 氨基酸)。PCR 产物双脱氧法测序，所 得序列与洛斯阿拉莫斯HIV 核酸序列库(Los Alamos HIV Database)标准株构建系 统进化树分析亚型；用斯坦福大学耐药数据库(Standford HIV Drug Resistance Database)分析耐药。 研究发现，云南省2005～2006 年无偿献血者中，有52 例为HIV-1 阳性，其 中49 例血浆和相应的PBMC 样品病毒基因扩增成功。序列分析表明，HIV 病毒 的亚型分布为CRF08_BC (51.0%), CRF07_BC (24.5%), CRF01_AE (20.4%)和B (4.1%)；所有样品均未发现蛋白酶抑制剂（PI）耐药基因位点主要突变，只在6 例(11.7%)样品中发现7 例次PI 次要耐药位点突变；另外，在9 例(18.4%)样品中发现10 例次核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI) 耐药突变，1 例(2.0%)发生非核苷类 逆转录酶抑制剂(NNRTI) 耐药突变；针对具体药物PI/NRTI/NNRTI 均只有1 例 有潜在的低度耐药，临床仍对药物敏感。PBMC 和血浆的病毒耐药没有显著差异。 从河南、安徽、山西27 个VCT 检测点2006～2007 年采集的10310 例样品 中，通过WB 和BED-CEIA 检测出新近感染人群63 例，分析成功50 例血浆样 品；河南VCT 长期感染样品中随机抽样，分析成功19 例样品。分析成功的69 例VCT 样品中，HIV 病毒株的亚型分布分别为B’ (95.7%)，CRF01_AE(2.9%)和 C(1.4%)。上诉样品均未检出PI 主要耐药相关突变，只在26 例(37.7%)样品中存 在27 例次PI 次要耐药相关突变；3 例(4.3%)样品出现6 例次NRTI 耐药相关突 变，7 例(10.1%)样品出现8 例次NNRTI 耐药相关突变。通过与斯坦福大学耐药 数据库比对，没有发现针对PI 类药物的临床耐药；但有2 例(2.8%)针对NRTI 类 药物耐药，1 例有M184V 突变导致对拉米夫定(3TC)和氟代拉米夫定(FTC)高度 耐药；1 例样品存在T215Y、M41L、L210W 三重突变位点，对阿巴卡韦(ABC)、 去羟肌苷(ddI)和坦那夫韦(TDF)中度耐药，对齐多夫定(AZT)和司他夫定(d4T)高 度耐药；针对NNRTI 类药物，有3 例(4.3%)毒株有耐药，1 例有K103N 突变导 致对奈韦拉平(NVP)、地拉韦啶(DLV)和依菲韦伦(EFV)的高度耐药；1 例有Y188L 突变导致对NVP 和EFV 的高度耐药；1 例存在K101E 和G190A 双重突变，导 致对NVP 的高度耐药，对DLV、EFV 和依曲韦林(ETR)中度耐药。 比较长期感染和新近感染者之间的亚型和耐药，未发现显著差异。 研究结果表明，云南、河南和安徽未经治疗HIV-1 感染者中耐药处于低流行 状态。亚型分布云南无偿献血者以CRF_BC 为主，河南、安徽VCT 人群以B’ 为主。应持续在未经治疗人群中进行耐药监测。

天花粉蛋白诱导HIV-1 慢性感染细胞凋亡及机制研究

天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是一种由247 个氨基酸组成的Ⅰ型核糖 体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein，RIP），从葫芦科植物栝楼 (Trichosanthes Kirilowii)球根中提纯获得。它具有广谱的生物学和药学活性， 包括抗肿瘤、免疫抑制、中期引产以及抗病毒活性。上世纪八十年代末， McGrath 等发现TCS 可以抑制HIV-1 在急性感染的T 淋巴细胞和慢性感染的 巨噬细胞中的复制，从而引起了研究者们极大的兴趣。但迄今为止，其抗HIV-1 的作用机制仍不清楚。 我们实验室对TCS 的免疫毒理作用和抗HIV-1 作用进行了多年的研究， 前期工作显示TCS 对HIV-1 的直接作用并不明显，但对于HIV-1 感染细胞却 具有很强的毒性作用。提示TCS 可能通过作用于宿主细胞来发挥其抗HIV-1 活性。在此基础上，我们从细胞方面着手，对TCS 选择性杀伤HIV-1 感染细 胞的作用及机制进行了探讨。首先，通过MTT 法检测发现，相同条件下，TCS 对于H9/HIV-1IIIB 细胞的毒性远远大于其对正常H9 细胞的毒性。其次，流式 细胞仪检测亚二倍体小峰和琼脂糖凝胶电泳检测片断化DNA 的实验证实了 TCS 对H9/HIV-1IIIB 的细胞杀伤作用是通过诱导细胞凋亡实现的。流式细胞仪 的结果显示TCS 以剂量依赖的方式诱导较多的H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，25μ g/mlTCS 作用24h 时，有8.4%的H9 细胞凋亡，而H9/HIV-1IIIB 细胞的凋亡率 则达到24.5%；随着作用浓度的降低，这种差异也在缩小。阳性对照D-Sorbitol 对两种细胞的凋亡率没有明显差别，约为25%。琼脂糖凝胶电泳的结果进一 步证实了这种推测，相同条件下，TCS 诱导H9/HIV-1IIIB 细胞出现更多的DNA 片断化。 TCS 可以选择性的诱导H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，为了进行更深入的机制研 究，我们建立了另外一株HIV-1 慢性感染细胞系，HIV-1 慢性感染的Jurkat 细胞系（Jurkat/HIV-1ⅢB）来验证TCS的作用。发现相同条件下，TCS可以诱 导同等程度的Jurkat/HIV-1ⅢB和Jurkat 细胞凋亡，25μg/mlTCS作用24h 时， 分别有21.08%的Jurkat 细胞和27.27%的Jurkat/HIV-1IIIB 细胞凋亡。以上的结 果说明HIV-1 感染H9 细胞后增强了感染细胞对TCS 的敏感性，而HIV-1 感 染Jurkat 细胞后并不影响其对TCS 的敏感性。根据细胞凋亡途径中是否依赖 线粒体的参与可以将细胞分成TypeⅠ和TypeⅡ两种类型，H9 细胞采取的是 线粒体非依赖性的TypeⅠ型凋亡途径，而Jurkat 细胞则采取线粒体依赖性的 TypeⅡ型凋亡途径。由于Jurkat 细胞对TCS 诱导的凋亡更加敏感，我们推测 HIV-1 感染H9 细胞后，诱导了细胞凋亡途径由TypeⅠ向TypeⅡ型转变。为 此，我们采用流式细胞仪检测了TCS 对凋亡细胞内的线粒体膜电位及 caspase-8 蛋白酶活性的影响，结果显示，H9/HIV-1IIIB、Jurkat 和Jurkat/HIV-1IIIB 细胞对TCS 诱导的凋亡具有相同程度的敏感性，并且伴随着细胞线粒体膜电 位的耗散和caspase-8 蛋白酶的活化；而相同情况下，TCS 对H9 细胞的影响 则很微弱。由此，进一步证实了我们的推测，即HIV-1 感染H9 细胞后，通过 改变细胞内的某些信号，使H9/HIV-1ⅢB细胞的性状更加倾向于Type Ⅱ型细 胞，从而增强其对于TCS 的敏感性.

二种抗HIV-1 药物筛选模型的建立及β-咔啉类化合物抗HIV 活性研究

艾滋病的流行严重威胁着人类健康和全球经济的发展，在某些国家已经造成 严重的经济问题和社会问题。由于尚无安全有效的艾滋病疫苗问世，药物治疗仍 是目前防治艾滋病的主要途径。二十多种抗HIV 药物的临床使用以及HAART 疗 法的应用，艾滋病患者的死亡率呈一定的下降趋势。然而，目前使用的抗HIV 药物能够抑制患者体内病毒的复制，但不能完全清除病毒。耐药病毒株的出现和 流行更降低了药物治疗的成功率。为此需要不断研究开发作用于新靶点或具有不 同作用机制的药物。 药物筛选是药物开发中的重要环节，其关键在于建立适合的药物筛选方法。 传统药物筛选费时费力，近年来逐渐被高通量药物筛选方法所代替。本研究中， 我们在大肠杆菌中表达并纯化了HIV-1 蛋白酶，获得了纯度和活性较高的蛋白 酶。利用荧光标记的蛋白酶底物在体外检测化合物对蛋白酶活性的影响，建立了 适于高通量筛选蛋白酶抑制剂的体外筛选方法。通过对大量样本的筛选，发现一 些具有蛋白酶抑制活性的化合物和粗提物。本研究还表达纯化了HIV-1 核衣壳蛋 白NCp7。利用锌离子特异性的荧光染料，建立了相应的高通量筛选方法。该方 法能够筛选出通过逐出NCp7 结合的锌离子而抑制该蛋白功能的化合物。这两种 体外筛选方法的建立大大提高了药物筛选的效率，降低了工作强度，为进一步的 研究打下了基础。 在药物开发过程中，常常通过对已知有效的化合物进行结构修饰以提高药物 活性并降低细胞毒性，改善药物疗效。在先前的药物筛选中，我们发现从高等真 菌中提取的β-咔啉类化合物flazin, 具有一定的抗HIV 活性。通过对flazin 的结 构修饰， 我们发现了治疗指数更高的化合物。本研究对其中两个， dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide，进行了更深入的抗HIV 活性研究。 dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 抑制HIV-1IIIB 感染诱导的合胞体形 成的EC50 分别为0.31 μM 和 0.38 μM。 与flazin(EC50 为2.37 μM）相比较， 抗HIV 活性提高了约6-7 倍。这两个化合物对C8166 细胞的半致死浓度(CC50) 分别为27.34μM和118.64μM。Dehydroxymethylflazinamide 的细胞毒性与flazin (CC50 为28.71μM）相似，而flazinamide 的细胞毒性降低了约4 倍左右。与flazin 相比，通过结构修饰，Dehydroxymethylflazinamide 治疗指数从12.1 提高到 88.19，而flazinamide 治疗指数从12.1 提高到312.2。研究还发现，这两个化 合物对临床分离株HIV-1KM018 以及实验株HIV-2ROD、HIV-2CBL-20 也有良好的抑 制效果。 我们对dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 的作用机制也进行了初 步探讨。二者均能有效抑制HIV-1IIIB, HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 病毒的细胞间传 播，而不能抑制HIV-1IIB 慢性感染的H9 细胞中病毒复制，说明该化合物可能主 要作用于病毒生活周期的早期阶段； 进一步的研究表明， dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1IIIB 进入阶段有很强的抑制活性，说明进入 阶段是该化合物的主要作用靶点；而flazinamide 对直接杀病毒、病毒吸附及进 入均没有显著的抑制效果，该化合物的作用机制还需进一步研究。对酶靶点作用 研究表明，两个化合物对HIV-1 逆转录酶仅有微弱抑制活性说明该酶可能不是作 用靶点；dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1 蛋白酶有抑制活性但半效浓度 （EC50）较高,说明该酶可能是化合物的次要靶点。而flazinamide 在体外与重组 的整合酶有较强的结合活性，暗示该化合物可能对整合酶有一定的抑制作用。以 上结果还说明，虽然两个化合物具有类似的结构，但它们可能是通过完全不同的 机制来抑制HIV 的复制.

西夫韦肽和盐肤木提取物体外抗HIV 活性及机制研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成: 西夫韦肽抗HIV 活性机制研究及其 联合用药和耐药性研究，盐肤木提取物及其化合物抗HIV 活性机制研究和精子 顶体反应抑制剂AGB 抗HIV 活性及机制研究。 HIV 侵入抑制剂是抗HIV 药物研发的热点。该类抑制剂靶定在病毒复制周 期早期，为HARRT 疗法提供了更多新的药物组合，且该类抑制剂对临床中已产 生的耐药毒株也有较好的抑制作用。目前FDA 批准上市的侵入抑制剂仅有T-20， 急需开发新一类的HIV-1 侵入抑制剂。西夫韦肽是由36 个氨基酸组成的多肽， 我们对西夫韦肽进行了一系列体外抗HIV 药效学的实验来研究西夫韦肽体外抗 HIV 活性以及作用机制。实验结果表明西夫韦肽对多种HIV 宿主细胞毒性小， 可以有效抑制HIV-1IIIB 诱导的C8166 细胞的病变效应，EC50 值仅为7.8ng/ml ， TI 值大于 384,615;在不同的检测方法中，西夫韦肽均表现出了比T-20 更好的抑 制活性，EC50 值低了13-42 倍。在对HIV-1 临床分离株、耐药株、两株HIV-2 毒株和SIVmac239 的抑制活性研究表明西夫韦肽也可以很好地抑制 HIV-1 临床株 HIV-1KM018 的复制，EC50 值低至4.4ng/ml，对耐药株HIV-174V、HIV-2 和 SIVmac239 的复制也均有较好的抑制作用。 在机制研究中，我们发现西夫韦肽极有效地抑制HIV-1慢性感染H9细胞与 正常C8166细胞间的融合作用，EC50 低至0.4ng/ml，表明西夫韦肽可以以极低的 浓度有效抑制HIV进入宿主细胞。用GST-pull down 实验进一步验证了西夫韦肽 和T-20可以很好地与HR1结合而不能与HR2结合，作用机制就是特异地与gp41的 HR1结合从而抑制了6-Helix的形成，阻断了HIV的融合过程。由于HIV的高变异 性，单一药物治疗容易产生耐药性，最终导致治疗失败。因此在新药开发中进行 药物与作用靶不同的已上市药物体外联合用药和耐药性研究是非常必要的，将对 临床应用有指导意义，我们的实验结果表明西夫韦肽与AZT联合用药体外抗HIV-1作用较单独用药好，不同检测方法联合用药比单独使用西夫韦肽的效果好 8.3-9.4倍；耐药性研究表明其体外诱导耐药性产生的时间与T-20相仿，与T-20有 交叉耐药。 我国传统的中医药是个巨大的宝库，有丰富的临床经验，中医药治疗艾滋病 有着一定的潜力。从我国国情出发，利用中医药的独特性及经济性，开发传统的 具有我国特色的艾滋病治疗天然药物成为AIDS 防治工作的当务之急。盐肤木是 中国的本土植物，在我国民间用作传统医药有着悠久的历史。盐肤木茎提取物尤 其是石油醚提取部分RC-1 具有较好的抗HIV 活性，且作用于病毒复制周期的后 期，从中分离得到的化合物1、2、4、5 和6 都是RC-1 的活性成份；盐肤木茎 提取物乙酸乙酯提取物RC-2 中也有较好的抗HIV 作用，其中的化合物8、9、 10 和13 是抗HIV 的活性成分，且作用机制各不相同，这些有效化合物的抗HIV 机制值得进一步的研究。 杀微生物剂是一种局部用药于阴道或宫颈的药物制剂，由女性自主控制防止 性传播疾病病原体包括HIV 的感染，是近年来的研究热点之一。AGB(4`-乙酰胺 苯基 4-胍基苯甲酸酯)是顶体酶的抑制剂，我们的实验表明AGB 有很好的杀精 子作用，还具有体外抗HIV-1 的作用，作用机制主要是阻断HIV-1 进入细胞。

灯盏花乙素和槐花化合物K3 体外抗HIV-1 活性研究

由于目前抗HIV 药物价格昂贵且有较强的毒副作用，传统药物将成为未来 HIV 治疗的主流药物。许多植物来源的天然化合物体外具有较好的抗HIV 活性， 有些化合物甚至可以作用在病毒复制周期的不同阶段。HIV 侵入抑制剂目前成 为抗HIV 药物研发的热点。HIV 侵入抑制剂靶定在病毒复制周期的结合或融合 位点，对临床中已产生耐药性突变的病毒株也有较好的抑制作用。该类抑制剂 的出现将为HARRT 疗法提供更多新的药物组合。开发新一代的HIV-1 侵入抑制 剂，与逆转录酶或蛋白酶抑制剂联合使用将增加治疗的有效性并减少毒副作用 的产生。 灯盏花乙素（Scutellarin）与槐花化合物K3 均从天然植物资源中提取，且 前者在我国临床上一直有着广泛应用。我们对这两种化合物的抗HIV-1 活性进 行了研究，检测了其对实验室适应病毒株（HIV-1ⅢB）、耐药株（HIV-174V）和临 床分离病毒株（HIV-1KM018）的抑制活性。灯盏花乙素是从植物滇黄芩中分离出 来的具有多种生物活性的黄酮类化合物，该化合物抑制HIV-1ⅢB 诱导C8166 细 胞合胞体形成的EC50 为26μM，选择指数为36。灯盏花乙素对耐药病毒株和临 床分离株也表现出良好的抑制作用。从槐花中提取的硫酸酯类化合物K3 体外研 究证实也有很好的抗HIV-1 活性，它不仅可以抑制HIV-1 致细胞病变效应，也 可以抑制感染细胞中的HIV-1 特异性抗原表达，该化合物的半数有效抑制浓度 EC50 为5～54μM。 灯盏花乙素与槐花化合物K3 的抗HIV-1 机制研究结果表明：两种化合物均 能有效抑制病毒进入细胞。灯盏花乙素在54μM 时抑制45%的病毒粒子进入细 胞，槐花化合物K3 在40μM 时能够有效抑制56％的HIV-1 进入细胞；灯盏花乙 素与槐花化合物K3 也可以抑制C8166 细胞与慢性感染的H9/HIV-1ⅢB 细胞间的融合，灯盏花乙素的EC50 为15μM，而槐花化合物K3 的EC50 为5μM；两种化 合物对体外重组的HIV-1 逆转录酶有微弱的抑制作用，在433μM 时，灯盏花乙 素可以抑制48％的逆转录酶活性，槐花化合物K3 在300μM 时能够抑制80％的 HIV-1 逆转录酶活性；这两种化合物体外对HIV-1 均无直接杀伤作用，也不能抑 制慢性感染细胞中的病毒复制和HIV-1 蛋白酶活性。因此，灯盏花乙素与槐花 化合物K3 的体外抗HIV-1 作用机制主要源于其能够抑制HIV-1 RT 活性和阻止 HIV-1 进入细胞。 灯盏花乙素和槐花化合物K3的有效抗病毒活性和多种作用途径使其成为具 有发展潜力的抗病毒先导化合物。