天花粉蛋白诱导HIV-1 慢性感染细胞凋亡及机制研究

天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是一种由247 个氨基酸组成的Ⅰ型核糖 体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein，RIP），从葫芦科植物栝楼 (Trichosanthes Kirilowii)球根中提纯获得。它具有广谱的生物学和药学活性， 包括抗肿瘤、免疫抑制、中期引产以及抗病毒活性。上世纪八十年代末， McGrath 等发现TCS 可以抑制HIV-1 在急性感染的T 淋巴细胞和慢性感染的 巨噬细胞中的复制，从而引起了研究者们极大的兴趣。但迄今为止，其抗HIV-1 的作用机制仍不清楚。 我们实验室对TCS 的免疫毒理作用和抗HIV-1 作用进行了多年的研究， 前期工作显示TCS 对HIV-1 的直接作用并不明显，但对于HIV-1 感染细胞却 具有很强的毒性作用。提示TCS 可能通过作用于宿主细胞来发挥其抗HIV-1 活性。在此基础上，我们从细胞方面着手，对TCS 选择性杀伤HIV-1 感染细 胞的作用及机制进行了探讨。首先，通过MTT 法检测发现，相同条件下，TCS 对于H9/HIV-1IIIB 细胞的毒性远远大于其对正常H9 细胞的毒性。其次，流式 细胞仪检测亚二倍体小峰和琼脂糖凝胶电泳检测片断化DNA 的实验证实了 TCS 对H9/HIV-1IIIB 的细胞杀伤作用是通过诱导细胞凋亡实现的。流式细胞仪 的结果显示TCS 以剂量依赖的方式诱导较多的H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，25μ g/mlTCS 作用24h 时，有8.4%的H9 细胞凋亡，而H9/HIV-1IIIB 细胞的凋亡率 则达到24.5%；随着作用浓度的降低，这种差异也在缩小。阳性对照D-Sorbitol 对两种细胞的凋亡率没有明显差别，约为25%。琼脂糖凝胶电泳的结果进一 步证实了这种推测，相同条件下，TCS 诱导H9/HIV-1IIIB 细胞出现更多的DNA 片断化。 TCS 可以选择性的诱导H9/HIV-1IIIB 细胞凋亡，为了进行更深入的机制研 究，我们建立了另外一株HIV-1 慢性感染细胞系，HIV-1 慢性感染的Jurkat 细胞系（Jurkat/HIV-1ⅢB）来验证TCS的作用。发现相同条件下，TCS可以诱 导同等程度的Jurkat/HIV-1ⅢB和Jurkat 细胞凋亡，25μg/mlTCS作用24h 时， 分别有21.08%的Jurkat 细胞和27.27%的Jurkat/HIV-1IIIB 细胞凋亡。以上的结 果说明HIV-1 感染H9 细胞后增强了感染细胞对TCS 的敏感性，而HIV-1 感 染Jurkat 细胞后并不影响其对TCS 的敏感性。根据细胞凋亡途径中是否依赖 线粒体的参与可以将细胞分成TypeⅠ和TypeⅡ两种类型，H9 细胞采取的是 线粒体非依赖性的TypeⅠ型凋亡途径，而Jurkat 细胞则采取线粒体依赖性的 TypeⅡ型凋亡途径。由于Jurkat 细胞对TCS 诱导的凋亡更加敏感，我们推测 HIV-1 感染H9 细胞后，诱导了细胞凋亡途径由TypeⅠ向TypeⅡ型转变。为 此，我们采用流式细胞仪检测了TCS 对凋亡细胞内的线粒体膜电位及 caspase-8 蛋白酶活性的影响，结果显示，H9/HIV-1IIIB、Jurkat 和Jurkat/HIV-1IIIB 细胞对TCS 诱导的凋亡具有相同程度的敏感性，并且伴随着细胞线粒体膜电 位的耗散和caspase-8 蛋白酶的活化；而相同情况下，TCS 对H9 细胞的影响 则很微弱。由此，进一步证实了我们的推测，即HIV-1 感染H9 细胞后，通过 改变细胞内的某些信号，使H9/HIV-1ⅢB细胞的性状更加倾向于Type Ⅱ型细 胞，从而增强其对于TCS 的敏感性.