Isolation and characterization of proteins that bind to yeast origins of DNA replication

Yeast chromosomes contain sequences called ARSs which function as origins of replication in vitro and in vivo. We have carried out a systematic deletion analysis of ARS1, allowing us to define three functionally distinct domains, designated A, B, and C. Domain A is a sequence of 11 to 19bp, containing the core consensus element that is required for replication. The core consensus sequence, A/TTTTATPuTTTA/T, is conserved at all ARSs sequenced to date. A fragment containing only element A and 8 flanking nucleotides enables autonomous replication of centromeric plasmids. These plasmids replicate very inefficiently, suggesting that flanking sequences must be important for ARS function. Domain B also provides important sequences needed for efficient replication. Deletion of domain B drastically increases the doubling times of transformants and reduces plasmid stability. Domain B contains a potential consensus sequence conserved at some ARSs which overlaps a region of bent DNA. Mutational analysis suggests this bent DNA may be important for ARS function. Deletion of domain C has only a slight effect on replication of plasmids carrying those deletions.

We have identified a protein called ARS binding factor I (ABF-I) that binds to the HMR-E ARS and ARS1. We have purified this protein to homogeneity using conventional and oligonucleotide affinity chromatography. The protein has an apparent molecular weight of 135kDa and is present at about 700 molecules per diploid cell, based on the yield of purified protein and in situ antibody staining. DNaseI footprinting reveals that ABF-I binds sequence-specifically to an approximately 24bp sequence that overlaps element Bat ARSl. This same protein binds to and protects a similar size region at the HMR-E ARS.

We also find evidence for another ARS binding protein, ABF-III, based on DN asei footprint analysis and gel retardation assays. The protein protects approximately 22bp adjacent to the ABF-I site. There appears to be no interaction between ABF-I and ABF-III despite the proximity of their binding sites.

To address the function of ABF-I in DNA replication, we have cloned the ABF-I gene using rabbit polyclonal anti-sera and murine monoclonal antibodies against ABF-I to screen a λgt11 expression library. Four EcoRI restriction fragments were isolated which encoded proteins that were recognized by both polyclonal and monoclonal antibodies. A gene disruption can now be constructed to determine the in vivo function of ABF-I.

Studies toward the total synthesis of ritterazine B : the investigation of alkynylation reactions for use in the synthesis of the western fragment

The ritterazine and cephalostatin natural products have biological activities and structures that are interesting to synthetic organic chemists. These products have been found to exhibit significant cytotoxicity against P388 murine leukemia cells, and therefore have the potential to be used as anticancer drugs. The ritterazines and cephalostatins are steroidal dimers joined by a central pyrazine ring. Given that the steroid halves are unsymmetrical and highly oxygenated, there are several challenges in synthesizing these compounds in an organic laboratory.

Ritterazine B is the most potent derivative in the ritterazine family. Its biological activity is comparable to drugs that are being used to treat cancer today. For this reason, and the fact that there are no reported syntheses of ritterazine B to date, our lab set out to synthesize this natural product.

Herein, efforts toward the synthesis of the western fragment of ritterazine B are described. Two different routes are explored to access a common intermediate. An alkyne conjugate addition reaction was initially investigated due to the success of this key reaction in the synthesis of the eastern fragment. However, it has been found that a propargylation reaction has greater reactivity and yields, and has the potential to reduce the step count of the synthesis of the western fragment of ritterazine B.

Wide Field-of-view Microscopes and Endoscopes for Time-lapse Imaging and High-throughput Screening

Wide field-of-view (FOV) microscopy is of high importance to biological research and clinical diagnosis where a high-throughput screening of samples is needed. This thesis presents the development of several novel wide FOV imaging technologies and demonstrates their capabilities in longitudinal imaging of living organisms, on the scale of viral plaques to live cells and tissues.

The ePetri Dish is a wide FOV on-chip bright-field microscope. Here we applied an ePetri platform for plaque analysis of murine norovirus 1 (MNV-1). The ePetri offers the ability to dynamically track plaques at the individual cell death event level over a wide FOV of 6 mm × 4 mm at 30 min intervals. A density-based clustering algorithm is used to analyze the spatial-temporal distribution of cell death events to identify plaques at their earliest stages. We also demonstrate the capabilities of the ePetri in viral titer count and dynamically monitoring plaque formation, growth, and the influence of antiviral drugs.

We developed another wide FOV imaging technique, the Talbot microscope, for the fluorescence imaging of live cells. The Talbot microscope takes advantage of the Talbot effect and can generate a focal spot array to scan the fluorescence samples directly on-chip. It has a resolution of 1.2 μm and a FOV of ~13 mm². We further upgraded the Talbot microscope for the long-term time-lapse fluorescence imaging of live cell cultures, and analyzed the cells’ dynamic response to an anticancer drug.

We present two wide FOV endoscopes for tissue imaging, named the AnCam and the PanCam. The AnCam is based on the contact image sensor (CIS) technology, and can scan the whole anal canal within 10 seconds with a resolution of 89 μm, a maximum FOV of 100 mm × 120 mm, and a depth-of-field (DOF) of 0.65 mm. We also demonstrate the performance of the AnCam in whole anal canal imaging in both animal models and real patients. In addition to this, the PanCam is based on a smartphone platform integrated with a panoramic annular lens (PAL), and can capture a FOV of 18 mm × 120 mm in a single shot with a resolution of 100─140 μm. In this work we demonstrate the PanCam’s performance in imaging a stained tissue sample.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Atividade pró-trombótica da toxina ExoU de Pseudomonas aeruginosa detectada em modelos experimentais in vivo e in vitro

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes.

Efeito da 1,10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis

Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis

Estudos dos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios da própolis sobre as células RAW 264.7 e na resposta inflamatória pulmonar aguda causada pela exposição à fumaça de cigarro em camundongos

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) causa a redução da capacidade respiratória e seu desenvolvimento é associado à fumaça de cigarro. O cigarro possui mais de 4800 substâncias tóxicas e causa a morte de seis milhões de pessoas por ano no mundo. Estudos buscam meios de reverter os males causados pela fumaça de cigarro. A própolis (P) é um produto produzido por abelhas que possui várias propriedades. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antioxidantes da P em macrófagos murinos e na inflamação pulmonar aguda induzida pela fumaça de cigarro (CS) em camundongos. A análise dos compostos fitoquímicos do extrato alcóolico da P (EAP) foi feita por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). Células da linhagem RAW 264.7 foram tratadas em diversas concentrações de P durante 24 horas. Após tratamento, as seguintes análises foram realizadas: polifenóis totais; viabilidade celular (MTT); potencial redutor (DPPH); espécies reativas de oxigênio totais (ROS) e de malondialdeído (MDA). Trinta camundongos C57BL/6 foram divididos em 3 grupos (n=10/grupo): Controle+P, CS e CS+P. Ambos os grupos CS foram expostos a 6 cigarros/dia durante 5 dias. O grupo CS foi tratado com veículo. O pulmão e o lavado broncoalveolar (BAL) foram coletados para análise histológica e contagem diferencial de células. As análises para mieloperoxidase (MPO), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), MDA, nitrito e western blotting para TNF-alfa foram realizadas. A análise fitoquímica do EAP mostrou a presença dos ácidos hidrocinâmicos e coumárico, a artepilina C e a drupanina. Foi observado o aumento concentração-dependente dos níveis de polifenóis totais (p<0,001), do MTT (p<0,001) e do DPPH (p<0,001), e o inverso com o MDA (p<0,001). Os níveis de ROS diminuem nas concentrações de 15,6 e 31,2 mg/mL (p<0,05, ambos). A histologia pulmonar do grupo Controle+P foi similar ao do CS+P e foi observado um influxo de macrófagos e neutrófilos no grupo CS (p<0,01 e p<0,001, respectivamente). Os níveis de MPO foram aumentados no grupo CS (526,534,72 mU/mg ptn, p<0,01), mas houve uma redução no grupo CS+P (385,127,64 mU/mg ptn, p<0,05) comparável ao Controle+P (13412,99 mU/mg ptn, p<0,001), o mesmo aconteceu com as enzimas antioxidantes: SOD (Controle+P: 523,529,6 U/mg ptn; CS: 523,529,6 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 246,815,69 U/mg ptn, p<0,001); CAT (Controle+P: 37,383,39 U/mg ptn; CS: 92,686,24 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 59,844,55 U/mg ptn, p<0,05); GPx (Controle+P: 2,230,17 (M/min/mg ptn) x 10-1; CS: 4,510,31 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,001; CS+P: 2,640,19 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,05). O inverso ocorreu com a relação GSH/GSSG (Controle+P: 1,0880,17; CS: 0,7360,07, p<0,05; CS+P: 1,2580,10, p<0,05). Os níveis de MDA (Controle+P: 0,2660,05 nMol/mg ptn; CS: 0,940,076 nMol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 0,4980,06 nMol/mg ptn, p<0,01) e de nitrito (Controle+P: 50,014,19 Mol/mg ptn; CS: 108,77,73 Mol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 58,843,42 nMol/mg ptn, p<0,01) estavam aumentados no CS que em outros grupos. A expressão de TNF-α foi observada no grupo CS. O tratamento da P apresentou ação anti-inflamatória e antioxidante em macrófagos e em camundongos expostos à fumaça de cigarro, possivelmente pela ação dos polifenóis presentes nela

Atividade do flavonóide quercetina em Leishmania braziliensis usando hamster como modelo de infecção

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral.

Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antiasmático da 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandina J2 em modelos murinos de asma

A asma é um distúrbio crônico pulmonar caracterizado por inflamação, obstrução e remodelamento brônquico, levando a sintomas como sibilo, tosse e falta de ar. A terapia antiasmática consiste em corticosteroides inalados e agonistas β2 de curta ou longa duração. O tratamento é limitado por efeitos colaterais e refratariedade de alguns pacientes, justificando a necessidade de novas terapias. Estudos demonstram que a 15-deoxy-delta- 12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2), um ligante endógeno de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos do tipo gama (PPAR-γ), é capaz de reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias, o que pode resultar em benefícios no tratamento de doenças com esse perfil. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anti-inflamatório e antiasmático da 15d-PGJ2 em modelos experimentais de asma. Camundongos A/J machos foram sensibilizados nos dias 0 e 7 através de injeção subcutânea (s.c.), contendo ovoalbumina (OVA) e Al(OH)3, e desafiados com 4 instilações intranasais (i.n.) de OVA em intervalos semanais. O tratamento com 15d-PGJ2 (30 e 100 g/Kg, s.c.) foi realizado 30 min antes dos desafios a partir da terceira provocação antigênica. Em outro modelo, camundongos A/J foram desafiados intranasalmente com extrato de ácaro 3 vezes por semana durante 3 semanas. As administrações de 15d-PGJ2 (30, 70 e 100 g/Kg, s.c. e 0,65; 1,5 e 2,3 g/animal, i.n.) foram realizadas a partir da 3 semana, 30 min antes dos desafios. As análises ocorreram 24 h após o último desafio. Nossos resultados mostraram que, em camundongos previamente sensibilizados e desafiados com OVA, a administração de 15d-PGJ2 limitou significativamente o influxo peribrônquico de eosinófilos e neutrófilos, bem como a produção de muco por células caliciformes e fibrose sub-epitelial, além da hiperreatividade das vias aéreas e produção de IL-5. A redução do epitélio brônquico e das citocinas IL-13 e TNF-α foram observadas somente na maior dose administrada. No modelo HDM a inflamação e o remodelamento foram atenuados em todas as doses administradas do composto, enquanto que a hiperresponssividade brônquica foi inibida apenas nas doses de 70 e 100 μg/Kg (via sistêmica) e na dose intermediária dada topicamente (1,5 μg/animal, i.n.). Os níveis de citocinas foram atenuados pelo tratamento subcutâneo, porém somente os níveis de IL-17, eotaxina-1 e TNF-α foram inibidos com a dose intranasal de 0,65 g/animal. O aumento da expressão de NF-κB, induzido por provocação com HDM também foi reduzido significativamente pela administração de 15d-PGJ2. Em conjunto, nossos dados indicam que o tratamento com 15d-PGJ2 inibe alterações cruciais associadas à patogênese da asma, em modelos experimentais distintos da doença, demonstrando possuir grande potencial para controlar e reverter inflamação, hiperreatividade e remodelamento pulmonar desencadeados por provocação alérgica.

Estudo in vitro de derivados sintéticos da Isoniazida e da Pirazinamida sobre Leishmania (Viannia) braziliensis

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania spp que afetam 98 países. No Brasil, no ano de 2013, foram relatados 3.253 casos de leishmaniose visceral e 18.226 casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. O tratamento de primeira escolha continua sendo realizado com antimoniais pentavalentes, e em casos de insucessos os fármacos de segunda escolha são a pentamidina e a anfotericina B. Tais medicamentos causam intensos efeitos adversos e ultimamente têm surgido cepas resistentes aos mesmos. Em áreas endêmicas têm sido cada vez mais comum o surgimento da co-infecção Leishmania com Mycobacterium tuberculosis. O tratamento para a tuberculose com pirazinamida (PZA) e isoniazida (INZ), controla a leishmaniose. Esses dados sugerem atividade anti-leishmania da PZA e da INZ. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro da INZ e da PZA e seus compostos derivados (série G e série R, respectivamente) sobre Leishmania (Viannia) braziliensis. As moléculas foram testadas em monocamadas de macrófagos peritoneais de camunongos infectados com L. (V) braziliensis durante 48h. Todas as moléculas testadas inibiram o índice de infecção de forma dose dependente em comparação aos controles. As moléculas da série R foram mais ativas do que a PZA, porém o resultado foi significativo somente para a R02 (p < 0,005). Apenas a molécula R05 (76,64M) foi relativamente tóxica para macrófagos. Os compostos mais ativos foram R02, G01 e G02, cujos índices de seletividade foram 14,31, 19 e 30, respectivamente. A dosagem de nitrito foi feita em sobrenadantes de monocamadas de macrófagos peritoniais infectados e tratados com as substâncias nas concentrações 10 e 100M. A G01 e a G02 estimularam a produção de NO2 nas duas concentrações, entretanto o resultado foi estatisticamente significativo para a G02 em 100M (p < 0,0001), a G05 só estimulou óxido nítrico na maior concentração. Todos os compostos da série R estimularam NO2, contudo, o resultado foi estatisticamente significativo para a R03 e R05 a 100M (p < 0,001). Adicionalmente, foi realizado uma análise preditiva in sílico de parâmetros farmacocinéticos das moléculas mais ativas in vitro, utilizando o software admetSAR. Os dados obtidos mostraram que de forma semelhante às suas moléculas originais a G01, G02 e R02 apresentaram alta capacidade de serem absorvidas pelo trato gastrointestinal, baixo potencial hepatotoxico e carcinogênico. Juntos, esses dados demonstram que essas moléculas são seletivamente tóxicas para o parasito com potencial para serem testadas pela via oral em estudos em modelo experimental de infecção.

Efeito do Sistema de Secreção do Tipo VI de Pseudomonas aeruginosa em modelo murino de pneumonia aguda

O Sistema de Secreção do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinário de secreção descrito em bactérias Gram-negativas, é amplamente distribuído entre as diversas espécies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreção é capaz de injetar efetores proteicos em células alvo, eucarióticas e procarióticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretório participa ativamente do estabelecimento de infecções, contribuindo para a sobrevivência das bactérias no interior de fagócitos. O genoma da cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa apresenta três loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porém, pouco se sabe sobre a participação do SST6 na patogênese de infecções por P. aeruginosa. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infecção pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactérias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Após 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leucócitos totais e polimorfonucleares e para a quantificação, por ELISA, da quimiocina para neutrófilos, KC, e das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmões, fígados, baços e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminação sistêmica das bactérias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, in vitro, em neutrófilos humanos, pela marcação com iodeto de propídeo (PI) e anexina-V seguida da análise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativação dos três SST6 reduziu significativamente a concentração de neutrófilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10⁷ Unidades Formadoras de Colônias de P. aeruginosa. Nesta dose, foi observado que as medianas do número de bactérias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutações no SST6 não afetaram a disseminação sistêmica da bactéria. A pesquisa da secreção de citocinas pró-inflamatórias mostrou que, embora tenha sido observada uma redução nas medianas das concentrações de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relação aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferença não foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC não contribuiu para a elucidação dos mecanismos envolvidos na redução da concentração de neutrófilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possível efeito do SST6 na morte de neutrófilos humanos. Os resultados mostraram que não houve diferenças significativas quando as diferentes amostras de células infectadas foram comparedas entre si. Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrófilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais são necessários para determinar o papel deste mecanismo de secreção na patogênese de P. aeruginosa.

Avaliação da eficácia de uma nova formulação de anfotericina B poliagregada em diferentes esquemas terapêuticos no tratamento da esporotricose experimental causada por Sporothrix brasiliensis

A esporotricose é uma micose subcutânea, crônica, causada por espécies termo-dimórficas do complexo Sporothrix schenckii. Esta micose apresenta diferentes manifestações clínicas sendo mais comum a forma linfocutânea. Casos graves causados por Sporothrix brasiliensis têm sido descritos recentemente, exigindo um tratamento prolongado com antifúngicos de alta toxicidade como a anfotericina B-desoxicolato ou suas versões menos tóxicas, mas de alto custo. Neste trabalho visamos testar in vitro e in vivo a eficácia de uma nova formulação intravenosa de anfotericina B poliagregada (P-AmB) e testar in vivo sua versão semi-sólida (AmB tópica), comparando-a com o itraconazol (ITC) e a anfotericina B-desoxicolato (D-AmB). Ensaios de susceptibilidade in vitro com S. brasiliensis mostraram que esta espécie é suscetível aos antifúngicos testados. Para os testes de eficácia in vivo foram estabelecidos um modelo de esporotricose disseminada e outro de esporotricose subcutânea, causados por S. brasiliensis. No modelo de esporotricose disseminada camundongos BALB/c foram inoculados intravenosamente com leveduras de S. brasiliensis e, 72 h pós-infecção, tratados sob diferentes regimes terapêuticos: i) uma monoterapia de ITC, D-AmB ou P-AmB; ii) uma combinação terapêutica entre D-AmB e ITC ou P-AmB e ITC; iii) um regime de pulso com D-AmB ou P-AmB. A sobrevivência (n= nove) e a carga fúngica em órgãos internos (n= três, no mínimo) foram avaliadas, sendo observado que o regime de pulso com D-AmB ou P-AmB foi o mais efetivo em prolongar a sobrevivência dos animais e reduzir a carga fúngica nos órgãos, seguido pela combinação terapêutica, porém o tratamento com D-AmB e ITC foi a combinação mais efetiva. A monoterapia com ITC e P-AmB e D-AmB foram menos eficazes, sendo corroborados pelas análises histopatológicas. Ensaios de toxicidade in vivo com as diferentes drogas revelaram que ITC e D-AmB induziram a uma toxicidade hepática e renal nos animais, respectivamente, mas P-AmB não induziu a nenhuma toxicidade. Nos ensaios de citoxicidade in vitro foi observado que ITC foi a menos citotóxica e hemolítica e a mais seletiva das drogas testadas, seguida por P-AmB, que foi menos citotóxica e mais seletiva que D-AmB. No modelo de esporotricose subcutânea camundongos da mesma linhagem foram inoculados por via subcutânea com conídios de S. schenckii e de S. brasiliensis (n=9/ grupo). Os animais infectados com S. brasiliensis apresentaram regressão das lesões primárias e disseminação. Usando o modelo de esporotricose subcutânea murina causada por S. brasiliensis testamos peliminarmente a formulação tópica de AmB poliagregada, que reduziu a extensão das lesões de animais infectados. Este é o primeiro trabalho a avaliar diferentes regimes de tratamento da esporotricose disseminada murina causada por S. brasiliensis utilizando ITC, D-AmB e uma nova formulação menos tóxica de anfotericina B poliagregada. O estudo revelou que o regime de pulso foi o mais eficaz para as formulações intravenosas de AmB. Nosso estudo também estabeleceu pioneiramente um modelo de esporotricose subcutânea induzido por S. brasiliensis, que se revelou uma ferramenta útil para comparar a virulência das espécies do complexo S. schenckii e para testar a eficácia de antifúngicos contra essas novas espécies.

Accelerated evolution of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide precursor gene during human origin

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is a neuropeptide abundantly expressed in the central nervous system and involved in regulating neurogenesis and neuronal signal transduction. The amino acid sequence of PACAP is extremely conserved across vertebrate species, indicating a strong functional constraint during the course of evolution. However, through comparative sequence analysis, we demonstrated that the PACAP precursor gene underwent an accelerated evolution in the human lineage since the divergence from chimpanzees, and the amino acid substitution rate in humans is at least seven times faster than that in other mammal species resulting from strong Darwinian positive selection. Eleven human-specific amino acid changes were identified in the PACAP precursors, which are conserved from murine to African apes. Protein structural analysis suggested that a putative novel Deuropeptide might have originated during human evolution and functioned in the human brain. Our data suggested that the PACAP precursor gene underwent adaptive changes during human origin and may have contributed to the formation of human cognition.

Genetic evidence of a strong functional constraint of neurotrypsin during primate evolution

Neurotrypsin is one of the extra-cellular serine proteases that are predominantly expressed in the brain and involved in neuronal development and function. Mutations in humans are associated with autosomal recessive non-syndromic mental retardation (MR). We studied the molecular evolution of neurotrypsin by sequencing the coding region of neurotrypsin in 11 representative non-human primate species covering great apes, lesser apes, Old World monkeys and New World monkeys. Our results demonstrated a strong functional constraint of neurotrypsin that was caused by strong purifying selection during primate evolution, an implication of an essential functional role of neurotrypsin in primate cognition. Further analysis indicated that the purifying selection was in fact acting on the SRCR domains of neurotrypsin, which mediate the binding activity of neurotrypsin to cell surface or extracellular proteins. In addition, by comparing primates with three other mammalian orders, we demonstrated that the absence of the first copy of the SRCR domain (exon 2 and 3) in mouse and rat was due to the deletion of this segment in the murine lineage. Copyright (C) 2005 S. Karger AG, Basel.