Dalle feste di nozze alle orchestre di stato: Maria Lătărețu e l'invenzione della muzică populară

Le musiche “popolaresche” urbane, in genere trascurate nella letteratura etnomusicologica, sono state quasi completamente ignorate nel caso della Romania. Il presente studio si propone di colmare almeno in parte questa lacuna, indagando questo fenomeno musicale nella Bucarest degli anni Trenta e Quaranta del Novecento. Le musiche esaminate sono tuttavia inserite entro una cornice storica più ampia, che data a partire dalla fine del XVIII secolo, e messe in relazione con alcune produzioni di origine rurale che con queste hanno uno stretto rapporto. Il caso di Maria Lătărețu (1911-1972) si è rivelato particolarmente fecondo in questo senso, dal momento che la cantante apparteneva ad entrambi i versanti musicali, rurale e urbano, e nepadroneggiava con disinvoltura i rispettivi repertori. Dopo il suo trasferimento nella capitale, negli anni Trenta, è diventata una delle figure di maggior spicco di quel fenomeno noto come muzică populară (creazione musicale eminentemente urbana e borghese con radici però nel mondo delle musiche rurali). L’analisi del repertorio (o, per meglio dire, dei due repertori) della Lătărețu, anche nel confronto con repertori limitrofi, ha permesso di comprendere più da vicino alcuni dei meccanismi musicali alla base di questa creazione. Un genere musicale che non nasce dal nulla nel dopo-guerra, ma piuttosto continua una tradizione di musica urbana, caratterizzata in senso locale, ma influenzata dal modello della canzone europea occidentale, che data almeno dagli inizi del Novecento. Attraverso procedimenti in parte già collaudati da compositori colti che sin dal XIX secolo, in Romania come altrove, si erano cimentati con la creazione di melodie in stile popolare o nell’armonizzazione di musiche di provenienza contadina, le melodie rurali nel bagaglio della cantante venivano trasformate in qualcosa di inedito. Una trasformazione che, come viene dimostrato efficacemente nell’ultimo capitolo, non investe solo il livello superficiale, ma coinvolge in modo profondo la sintassi musicale.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual’s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Selektiv deblockierbare Diamino-D-Galactose-Scaffolds für die kombinatorische Synthese potentieller RNA-Liganden

Die Aufklärung der Schlüsselrolle der RNA in zahlreichen biologischen Prozessen, die sich aus ihren selektiven Wechselwirkungen mit anderen RNA-Molekülen, Proteinen, Peptiden bzw. Antibiotika ergibt, ist für die Wirkstoffforschung von großer Bedeutung. Die Aminoglycoside und Antibiotika, die durch eine Hemmung der Proteinbiosynthese schon seit längerem bekannt sind, dienen als Leitstrukuren für die Synthese von weiteren Wirkstoffen. Die meisten Aminoglycosid-Antibiotika beinhalten Aminozucker, die mit dem rn2-Desoxystreptamin-Gerüst verbunden sind. Die stereochemische Vielfalt der Substitutionsstellen für Amino- und Hydroxylgruppen in diesem Gerüst und deren beschränkte konformative Flexibilität bieten vielseitige Möglichkeiten, um potenzielle RNA-Liganden so zu gestalten, dass es zu einer spezifischen Erkennung von RNA-Strukturen kommen kann. Ein wichtiger Vertreter dieser Antibiotika, Neomycin B, von dessen Struktur die Entwicklung des Diaminogalactose-Templates abgeleitet wurde, wurde in dieser Arbeit als Leitstruktur gewählt. Die Synthese von Diaminogalactose-Scaffolds wurde zunächst in Lösung durchgeführt. Anschließend wurden die Bausteine 2 und 4 an einen polymeren Träger gebunden.rnNach Prüfung der orthogonalen Stabilität der Schutzgruppen wurde mit den Scaffolds 2 und 4 eine Bibliothek von 65 Verbindungen hergestellt. Mit 42 dieser Verbindungen wurden anschließend Zellassays im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) durchgeführt, um ihre Cytotoxizität zu prüfen. Für einzelne Verbindungen konnten die optimalen Konzentrationen bestimmt werden, bei denen zukünftige Tests für die Tat/TAR Wechselwirkung ohne störende cytotoxische Effekte durchgeführt werden können.rn

Dal repertorio al database: il progetto Monete al femminile. L'iconografia monetale dell'Augusta nella prima età imperiale

Il presente lavoro si pone l'obiettivo di fornire una rilettura filologica delle fonti numismatiche sui membri femminili della domus imperiale romana da Livia a Matidia Maggiore, supportata da una schedatura informatizzata del documento monetale. La compilazione è stata condotta tramite lo spoglio dei repertori di maggiore consultazione (RIC, BMCRE, BNCMER, HCC) e ha posto l'attenzione sia sugli elementi iconografici che su quelli epigrafici che vanno a comporre l'aspetto estrinseco della moneta. La scelta di tali elementi nelle emissioni imperiali è l'espressione di un vero e proprio linguaggio dotato di una logica comunicativa ben precisa e finalizzata a garantire la comprensibilità del messaggio. La sua decodifica consente di individuare possibili linee di definizione del ruolo pubblico e politico delle Auguste nel quadro dell'ideologia imperiale. A veicolare questo significato contribuiscono ugualmente gli elementi iconografici, con valore connotativo rispetto al soggetto raffigurato, e quelli epigrafici, con valore esplicativo ai fini della comprensione del dato visivo. La moneta rappresenta dunque un documento complesso, che necessita di una specifica metodologia di indagine volta a interpretarne tutti gli elementi.

Identifizierung und Charakterisierung T-zellerkannter tumorassoziierter Antigene im Melanommodell D41

In der vorliegenden Arbeit wurden Zielstrukturen autologer, tumorreaktiver CD8+ T-Zellen im Modell des Melanompatienten D41 charakterisiert, der im metastasierten Stadium nach Vakzinierung mit autologen dendritischen Zellen und bestrahlten Tumorzellen eine dauerhafte komplette Remission erreichte (O´Rourke et al., Melanoma Res. 17:316, 2007). Aus kryokonservierten Blutlymphozyten verschiedener Zeitpunkte wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen (D41-MEL) in unabhängigen gemischten Lymphozyten-/Tumorzell-Kulturen (MLTCs) tumorreaktive CD8+ T-Zellen angereichert. Als Erstes wurde überprüft, ob sie gegen bekannte Melanomantigene in Assoziation mit den HLA-Klasse I-Allelen des Patienten gerichtet waren. Dabei zeigten sich Reaktivitäten gegen das melanosomale Differenzierungsantigen Melan-A mit HLA-A*0201 und darüber hinaus gegen die Cancer/Testis-Antigene (CTA) MAGE-A3 und MAGE-A6 mit HLA-A*0101, sowie NY-ESO-1, MAGE-A4 und MAGE-A10 mit HLA-A*0201. In einem zweiten Schritt wurde mit T-Zell-Klonen aus D41-MLTC 2, die keines dieser Antigene erkannten, eine cDNA-Expressionsbank von D41-MEL gescreent. Dies führte zur Klonierung einer für TSPY 1 (testis-specific protein Y-encoded 1) kodierenden cDNA mit einem der T-Zell-Klone. Er erkannte mit hoher Affinität die synthetischen TSPY 1-Peptide LLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 66-73) und LLLDDIMAEV (Aminosäurepositionen 65-73) in Assoziation mit HLA-A*0201. Serologische Immunantworten gegen das als CTA einzustufende TSPY 1 sind bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals eine T-Zell-Antwort gegen TSPY 1 nachgewiesen. TSPY 1 trägt mutmaßlich zu Entstehung des Gonadoblastoms bei, seine Expression wurde jedoch z.B. auch in Seminomen, Leberzellkarzinomen und Melanomen nachgewiesen. Die Expression von TSPY 1 in der Zelllinie D41-MEL-Zellen war sehr heterogen. Einzelne Klone der Linie exprimierten TSPY 1 auf stabil hohem, andere Klone auf ebenso stabil intermediärem bzw. nicht detektierbarem Niveau. Die Expression und die Erkennung durch TSPY 1-reaktive T-Zell-Klone wurde durch die demethylierende Substanz 5-Aza-2´-deoxycytidine gesteigert. Dies spricht für eine Promotor-Hypermethylierung als Ursache fehlender bzw. niedriger Expression, wie dies für verschiedene CTA zutrifft. Die im Blut des Patienten D41 detektierbare antitumorale T-Zell-Reaktivität war bereits vor der Vakzinierung mit Tumorzellen nachweisbar und hatte sich somit spontan entwickelt. Ihre Individualität war vorgegeben durch das Antigenexpressionsmuster der D41-Tumorzellen, sowie durch den HLA-Phänotyp und mutmaßlich auch das T-Zellrepertoire des Patienten. Die detaillierte Analyse komplexer antitumoraler T-Zellantworten legt den Grundstein für eine Immuntherapie, die sich auf das tatsächliche Potential des individuellen T-Zellsystems stützen kann.

Intercultural Performance and Dialogue. From Richard Schechner Performance Studies Onwards

Attraverso un excursus storico, teorico e metodologico, questa tesi di dottorato analizza la nascita, gli sviluppi e l’attuale dimensione costitutivo-identitaria dei Performance Studies, un ambito di ricerca accademica che, nato negli Stati Uniti alla fine degli anni Settanta, ha sempre palesato una natura restia nei confronti di qualunque tentativo definitorio. Se i Performance Studies concepiscono la performance sia come oggetto d’analisi sia come lente metodologica, e se, come evidenziato da Richard Schechner, praticamente tutto può essere “elevato a performance” e quindi indagato secondo le categorie analitiche di questa disciplina, ecco allora che, con uno slittamento transitivo e “meta-metodologico”, questa ricerca dottorale ha scelto come proprio oggetto di studio i Performance Studies stessi, osservandoli “as performance” e avvalendosi degli strumenti metodologici suggeriti dal suo stesso oggetto d’analisi. Questo lavoro indaga come l’oggetto di studio dei Performance Studies sia, seguendo la teoria schechneriana, il “behaved behavior”, e dunque come di conseguenza, il repertorio, prima ancora che l’archivio, possa essere considerato il fedele custode delle “pratiche incorporate”. Soffermandosi su esempi di “reenactment” performativo come quelli messi in atto da Marina Abramović e Clifford Owens, così come sui tentativi condotti dalla sezione dell’Intangible Cultural Heritage dell’UNESCO, suggerisce validi esempi di “archiviazione” della performance. L’elaborato prende poi in esame casi che esemplificano la proficua identificazione tra “studiare performance” e “fare performance”, sottolinea il ruolo cruciale e imprenscindibile determinato dal lavoro di ricerca sul campo inteso come “osservazione partecipante”, ed evidenzia il costante coinvolgimento sociale e politico assunto dai Performance Studies. Questa dissertazione affronta e supporta l’efficacia dei Performance Studies nel proporsi come uno strumento innovativo in grado di analizzare un mondo sempre più performativo nelle sue dinamiche. La loro natura tanto interdisciplinare quanto interculturale sembra farne una lente adeguata attraverso cui promuovere livelli diversi di performance dialogica tra culture localmente distinte ma globalmente assimilabili.

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn

Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Ragnar Östberg. Genius loci e memorie urbane. Stockholms Stadshuset-Nämndhuset e villa Geber

La ricerca si propone di analizzare una di quelle stagioni architettoniche controverse e lontane dalle internazionali strade maestre del nascente Neues Bauen: il romanticismo-nazionale svedese riletto attraverso l’esperienza del suo massimo esponente, Ragnar Östberg (1866-1945). L’obiettivo della tesi non è solamente quello di una revisione della critica storiografica, facendo così luce su una di quelle personalità considerate marginali, quanto quello di ricavare dalla lettura comparata di due tra i suoi progetti, fino ad ora mai indagati, quegli elementi che fanno dell’architettura un “fatto urbano” in cui la collettività può riconoscersi e parallelamente un fatto di rappresentazione della stessa. L’arcipelago di Stoccolma e quel processo di “renovatio urbis” a cui fu sottoposta proprio agli albori del XX secolo furono gli scenari in cui presero vita i due progetti: il complesso formato dallo Stockholms Stadshuset e la vicina parte mai realizzata del Nämndhuset, e villa Geber. Condensano due dimensioni che la città immersa nel paesaggio contiene: la natura urbana dell’edificio municipale e quella domestica della villa urbana isolata. La ricerca intesse un itinerario di disvelamento attraverso una matrice duale di lettura: “genius loci” e memorie urbane. I capitoli cercano di dimostrare come i due casi-studio siano espressione di quella pendolarità di ricerca tra lo spirito del luogo e le rimembranze delle forme urbane della tradizione. Questa analisi ci conduce in un viaggio alla ricerca dell’atlante delle “memorie urbane”, raccolte nei viaggi e nella formazione, comprendendo così il mondo analogico di riferimenti culturali con altre architetture europee della tradizione. I due progetti sorgono in opposte aree di espansione di Stoccolma e, pur nella loro diversità di scala, sono chiara espressione di appropriatezza al luogo e di strutture formali analoghe. Stockholm Stadshuset-Nämndhuset e villa Geber esprimono il metodo di Östberg, dove i riferimenti raccolti dall’imagination passive sono tramutati ed assemblati grazie alla imagination active.

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsfähigkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb für verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose schützt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-ΔM36 (ΔM36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ΔM36 für alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erhöht. Zusätzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ΔM36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ΔM36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellulären Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Phänotyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verstärkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires führt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-Mäusen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund lässt auf ein erhöhtes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ΔM36 oder M45-BamX infolge einer verstärkten Induktion des programmierten Zelltods schließen.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit fördern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsfähigkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zusätzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo ermöglicht.

Analyse der T-Zellkreuzreaktivität bei Birkenpollenallergikern mit assoziierter Nahrungsmittelallergie

Eine Pollenallergie geht häufig mit einer sekundären Nahrungsmittelallergie einher, die durch die Kreuzreaktivität zwischen dem Pollen- und dem Nahrungsmittelallergen verursacht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Kohorte von 20 Allergikern mit einer Typ I-Allergie gegen Birkenpollen und einer assoziierten Nahrungsmittelallergie gegen Haselnüsse und/oder Karotten in Bezug auf eine allergenspezifische IgE-Antwort, T-Zellantwort und vor allen Dingen hinsichtlich der T-Zellkreuzreaktivität zwischen den rekombinanten Allergenen Bet v 1, Cor a 1 und Dau c 1 charakterisiert. Verwendet wurde hierzu ein Zellkultursystem mit primären CD4+ T-Zellen ohne die Zugabe von exogenem IL-2 oder wiederholten Stimulationen. Zur Analyse der T-Zellkreuzreaktivität kamen zwei unterschiedliche Analyseverfahren zum Einsatz: zum einen der bewährte 3H-Thymidinassay und zum anderen eine neue durchflusszytometrische Methode, die auf der Verwendung von zwei unterschiedlichen Proliferationsfarbstoffen basiert.rnBei der Charakterisierung der T-Zellantwort konnte festgestellt werden, dass eine robuste Th2-Antwort vorliegt, die stark von dem Zytokin IL-5 dominiert wird, begleitet von einer signifikanten Produktion von IL-9 und IL-13, allerdings ohne die Beteiligung von IL-4.rnDes Weiteren konnte zum ersten Mal mit Hilfe eines dosisabhängigen Inhibitions-ELISA eine B-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 gezeigt werden, wobei das Cor a 1-reaktive IgE prädominant ist und eine Subpopulation des Bet v 1-reaktiven IgE darstellt.rnMittels 3H-Thymidinassay konnte eine T-Zellkreuzreaktivität zwischen Bet v 1, Cor a 1 und in einem geringeren Maße zu Dau c 1 bei primären T-Zellen von Allergikern gezeigt werden. Ebenso konnte die Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Cor a 1 durch die neue durchflusszytometrische Methode bewiesen werden. Zusätzlich ist es mit Hilfe dieser neuen Methode nun möglich, zwischen den einzelnen T-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, die sowohl nach primärer und sekundärer oder ausschließlich nach sekundärer Stimulation proliferieren. Es konnte festgestellt werden, dass die kreuzreaktiven T-Zellen aus der T-Zellsubpopulation hervorgehen, die bereits nach der primären Stimulations stark proliferiert haben. Somit kann also innerhalb des T-Zellrepertoires der allergischen Spender eine Prädominanz der kreuzreaktiven T-Zellsubpopulationen festgestellt werden. Eine monospezifische T-Zellsubpopulation konnte unter Verwendung der neuen Methode nicht detektiert werden.rnDas Ausmaß von Qualität und Quantität einer Kreuzreaktivität kann nun visualisiert werden, was dazu beitragen kann, das Protokoll einer SIT zu verbessern und optimal an den individuellen Patienten anzupassen, um möglicherweise eine größere Chance auf eine erfolgreiche Therapie in Aussicht zu stellen.

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn

Drug hypersensitivity reactions involving skin

Immune reactions to drugs can cause a variety of diseases involving the skin, liver, kidney, lungs, and other organs. Beside immediate, IgE-mediated reactions of varying degrees (urticaria to anaphylactic shock), many drug hypersensitivity reactions appear delayed, namely hours to days after starting drug treatment, showing a variety of clinical manifestations from solely skin involvement to fulminant systemic diseases which may be fatal. Immunohistochemical and functional studies of drug-specific T cells in patients with delayed reactions confirmed a predominant role for T cells in the onset and maintenance of immune-mediated delayed drug hypersensitivity reactions (type IV reactions). In these reactions, drug-specific CD4+ and CD8+ T cells are stimulated by drugs through their T cell receptors (TCR). Drugs can stimulate T cells in two ways: they can act as haptens and bind covalently to larger protein structures (hapten-carrier model), inducing a specific immune response. In addition, they may accidentally bind in a labile, noncovalent way to a particular TCR of the whole TCR repertoire and possibly also major histocompatibility complex (MHC)-molecules - similar to their pharmacologic action. This seems to be sufficient to reactivate certain, probably in vivo preactivated T cells, if an additional interaction of the drug-stimulated TCR with MHC molecules occurs. The mechanism was named pharmacological interaction of a drug with (immune) receptor and thus termed the p-i concept. This new concept may explain the frequent skin symptoms in drug hypersensitivity to oral or parenteral drugs. Furthermore, the various clinical manifestations of T cell-mediated drug hypersensitivity may be explained by distinct T cell functions leading to different clinical phenotypes. These data allowed a subclassification of the delayed hypersensitivity reactions (type IV) into T cell reactions which, by releasing certain cytokines and chemokines, preferentially activate and recruit monocytes (type IVa), eosinophils (type IVb), or neutrophils (type IVd).

Why do we yawn?

Yawning is a phylogenetically old behaviour that can be observed in most vertebrate species from foetal stages to old age. The origin and function of this conspicuous phenomenon have been subject to speculations for centuries. Here, we review the experimental evidence for each of these hypotheses. It is found that theories ascribing a physiological role to yawning (such as the respiratory, arousal, or thermoregulation hypotheses) lack evidence. Conversely, the notion that yawning has a communicative function involved in the transmission of drowsiness, boredom, or mild psychological stress receives increasing support from research in different fields. In humans and some other mammals, yawning is part of the action repertoire of advanced empathic and social skills.

Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses

The lower intestine of adult mammals is densely colonized with nonpathogenic (commensal) microbes. Gut bacteria induce protective immune responses, which ensure host-microbial mutualism. The continuous presence of commensal intestinal bacteria has made it difficult to study mucosal immune dynamics. Here, we report a reversible germ-free colonization system in mice that is independent of diet or antibiotic manipulation. A slow (more than 14 days) onset of a long-lived (half-life over 16 weeks), highly specific anticommensal immunoglobulin A (IgA) response in germ-free mice was observed. Ongoing commensal exposure in colonized mice rapidly abrogated this response. Sequential doses lacked a classical prime-boost effect seen in systemic vaccination, but specific IgA induction occurred as a stepwise response to current bacterial exposure, such that the antibody repertoire matched the existing commensal content.