Is contextual-potentiated eating dependent on caloric density of food?

One experiment tested whether a specific context could elicit eating in rats as a result of Pavlovian conditioning and whether this effect depended on the caloric density of food. Thirty two deprived rats experienced two contexts. They had access to food in context A, but no food was available in context B. During conditioning, half of the animals received high density caloric food (HD groups) whereas the other half, low density caloric food (LD groups). Then, half of the rats in each type of food group was tested in context A and the other half in context B. The results demonstrated an effect of context conditioning only in HD groups. These findings suggest the relevance of both contextual conditioning and caloric density of food in eating behaviour. Implications for the aetiology of binge eating will be discussed.

A cell spot microarray method for high-throughput biology

High-throughput screening of cellular effects of RNA interference (RNAi) libraries is now being increasingly applied to explore the role of genes in specific cell biological processes and disease states. However, the technology is still limited to specialty laboratories, due to the requirements for robotic infrastructure, access to expensive reagent libraries, expertise in high-throughput screening assay development, standardization, data analysis and applications. In the future, alternative screening platforms will be required to expand functional large-scale experiments to include more RNAi constructs, allow combinatorial loss-of-function analyses (e.g. genegene or gene-drug interaction), gain-of-function screens, multi-parametric phenotypic readouts or comparative analysis of many different cell types. Such comprehensive perturbation of gene networks in cells will require a major increase in the flexibility of the screening platforms, throughput and reduction of costs. As an alternative for the conventional multi-well based high-throughput screening -platforms, here the development of a novel cell spot microarray method for production of high density siRNA reverse transfection arrays is described. The cell spot microarray platform is distinguished from the majority of other transfection cell microarray techniques by the spatially confined array layout that allow highly parallel screening of large-scale RNAi reagent libraries with assays otherwise difficult or not applicable to high-throughput screening. This study depicts the development of the cell spot microarray method along with biological application examples of high-content immunofluorescence and phenotype based cancer cell biological analyses focusing on the regulation of prostate cancer cell growth, maintenance of genomic integrity in breast cancer cells, and functional analysis of integrin protein-protein interactions in situ.

Metabolic syndrome – early cardio-metabolic, vascular and hepatic changes

Background: Metabolic syndrome (MetS) is a combination of several cardio-metabolic risk factors including obesity, hyperglycemia, hypertension and dyslipidemia. MetS has been associated with increased levels of apolipoprotein B (apoB) and low-density lipoprotein oxidation (OxLDL) and with an increased risk of cardiovascular disease and non-alcoholic fatty liver disease. Aims: To establish the relation of apoB and OxLDL with the MetS development and to determine the status of MetS as a risk factor for adverse liver changes and for subclinical atherosclerosis. Subjects and Methods: The present thesis is part of the two large scale population-based, prospective, observational studies. Cardiovascular Risk in Young Finns study was launched in 1980 including 3,596 subjects aged 3-18 years. Thereafter follow-up studies have been conducted regularly. In the latest follow-ups that were performed in 2001 (N=2,283) and 2007 (N=2,204), non-invasive ultrasound studies were introduced to the study protocol to measure subclinical atherosclerosis i.e. carotid intima-media thickness (IMT), carotid artery distensibility (Cdist) and brachial flow-mediated dilatation (FMD). Alanine-aminotransferase (ALT) and gammaglutamyltransferase (GGT) were measured in 2007 to assess liver function. The Bogalusa Heart Study is a long-term epidemiologic study of cardiovascular risk factors launched in 1972 in a biracial community of Bogalusa, Louisiana, USA. Total of 374 youths (aged 9-18 years at baseline in 1984-88) who underwent non-invasive ultrasound studies of the carotid artery as adults, were included in the analyses of the present thesis. Results: The odds ratios (95% confidence intervals) for MetS incidence during a 6-year follow-up by quartiles of apoB were 2.0(1.0-3.8) for the second quartile, 3.1(1.7-5.7) for the third quartile and 4.2(2.3-7.6) for the fourth quartile. OxLDL was not independently associated with incident MetS. Youth (aged 9-18 years) with MetS or with high body mass index were at 2-3 times the risk of having MetS, high IMT, and type 2 diabetes 24-years later as adults. IMT increased 79±7μm (mean±SEM) in subjects with MetS and 42±2μm in subjects without the MetS (P<0.0001) during 6- years. Subjects who lost the MetS diagnosis during 6-year follow-up had reduced IMT progression compared to persistent MetS group (0.036±0.005vs.0.079±0.010 mm, P=0.001) and reduced Cdist change compared to incident MetS group (-0.12±0.05vs.-0.38±0.10 %/mmHg, P=0.03) over 6-year follow-up. MetS predicted elevated ALT (β±SEM=0.380±0.052, P<0.0001 in men and 0.160±0.052, P=0.002 in women) and GGT (β±SEM=0.240±0.058, P<0.0001 in men and 0.262±0.053, P<0.0001 in women) levels after 6-years. Conclusions: These findings suggest that apoB may give additional information on early metabolic disturbances predisposing MetS. MetS may be used to identify individuals at increased risk of developing atherosclerosis and non-alcoholic liver disease. However, recovery from the MetS may have positive effects on liver and vascular properties.

Oxidized LDL and physical fitness in healthy young men: associations with body composition, smoking, metabolic syndrome and androgen status

Background: In the past, oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) has been associated with an unbeneficial lipid profile. This atherogenic lipid profile increases the risk of atherosclerotic cardiovascular diseases. Physical fitness has substantial effect on serum lipoprotein concentration as well as body composition and humoral responses, however interrelationships between ox-LDL and physical fitness have not been widely examined in a nationally representative sample. Aims: This thesis evaluates how cardiorespiratory and muscular fitness associate with ox-LDL lipids and how the other known risk factors of atherosclerosis might alter these associations. Subjects and Methods: The study cohort consisted of 846 healthy young males (mean age 25.1, SD 4.6) who were gathered by voluntary nationwide recruitment. Each participant conducted a series of physical fitness tests (cardiorespiratory and muscular fitness) and answered a detailed questionnaire that included lifestyle habits (i.e. smoking and leisuretime physical activity). Venous blood samples including ox-LDL and serum lipids were also collected. Results: Higher levels of ox-LDL were found in overweight and obese men, however, high cardiorespiratory fitness seemed to protect the overweight from high levels of ox-LDL. Young men who smoked and had poor cardiorespiratory or muscular fitness possessed a higher concentration of ox-LDL lipids when compared to comparable levels of cardiorespiratory or muscular fitness non-smoking young men. Metabolic syndrome was associated with increased levels of ox-LDL and high levels of ox-LDL combined with poor cardiorespiratory and abdominal muscle fitness seems to predict metabolic syndrome in young men. Also, participants with poor cardiorespiratory fitness and low levels of testosterone had higher levels of ox-LDL when compared to participants with high cardiorespiratory fitness / low testosterone as well as those with poor cardiorespiratory fitness / high testosterone. Conclusions: Good cardiorespiratory and muscular fitness protects young men from increased levels of ox-LDL lipids. This association was discovered in young men who were categorized as being overweight, smokers, metabolic syndrome or with low levels of testosterone. Being fit seems to prevent higher levels of ox-LDL, even in young healthy

Plasma clearance and biodistribution of oxidatively modified 99mTc-ß-VLDL in rabbits

The biodistribution and removal from plasma (measured as fractional clearance rate, FCR, per hour) of native and oxidatively modified 99mtechnetium-labeled ß-very low density lipoprotein (99mTc-ß-VLDL) were investigated in hypercholesterolemic (HC) and control (C) three-month old New Zealand rabbits. The intracellular accumulation of ß-VLDL labeled with 99mTc was studied in vitro in THP-1 cells and monocyte-derived macrophages isolated from rabbits. After intravenous injection into C rabbits, copper-oxidized ß-VLDL (99mTc-ox-ß-VLDL) was cleared from the circulation faster (0.362 ± 0.070/h) than native ß-VLDL (99mTc-nat-ß-VLDL, 0.241 ± 0.070/h). In contrast, the FCR of 99mTc-ox-ß-VLDL in HC rabbits was lower (0.100 ± 0.048/h) than that of 99mTc-nat-ß-VLDL (0.163 ± 0.043/h). The hepatic uptake of radiolabeled lipoproteins was lower in HC rabbits (0.114 ± 0.071% injected dose/g tissue for 99mTc-nat-ß-VLDL and 0.116 ± 0.057% injected dose/g tissue for 99mTc-ox-ß-VLDL) than in C rabbits (0.301 ± 0.113% injected dose/g tissue for 99mTc-nat-ß-VLDL and 0.305 ± 0.149% injected dose/g tissue for 99mTc-ox-ß-VLDL). The uptake of 99mTc-nat-ß-VLDL and 99mTc-ox-ß-VLDL by atherosclerotic aorta lesions isolated from HC rabbits (99mTc-nat-ß-VLDL: 0.033 ± 0.012% injected dose/g tissue and 99mTc-ox-ß-VLDL: 0.039 ± 0.017% injected dose/g tissue) was higher in comparison to that of non-atherosclerotic aortas from C rabbits (99mTc-nat-ß-VLDL: 0.023 ± 0.010% injected dose/g tissue and 99mTc-ox-ß-VLDL: 0.019 ± 0.010% injected dose/g tissue). However, 99mTc-nat-ß-VLDL and 99mTc-ox-ß-VLDL were taken up by atherosclerotic lesions at similar rates. In vitro studies showed that both monocyte-derived macrophages isolated from rabbits and THP-1 macrophages significantly internalized more 99mTc-ox-ß-VLDL than 99mTc-nat-ß-VLDL. These results indicate that in cholesterol-fed rabbits 99mTc-ox-ß-VLDL is slowly cleared from plasma and accumulates in atherosclerotic lesions. However, although the extent of in vitro uptake of 99mTc-ox-ß-VLDL by macrophages was high, the in vivo accumulation of this radiolabeled lipoprotein by atherosclerotic lesions did not differ from that of 99mTc-nat-ß-VLDL.

Zymosan phagocytosis by mouse peritoneal macrophages is increased by apoHDL- and not by intact HDL-covered particles

The uptake of lipids and lipoprotein particles by macrophages undergoes phagocytic activation and the formation of foam cells are key events in atherosclerosis. In this study we determined how intact high density lipoproteins (HDL) and apolipoproteins-HDL (removal of the lipid component from HDL, i.e., apoHDL) influence the phagocytosis of zymosan by mouse peritoneal macrophages. Zymosan particles preincubated together with lipoproteins or alone (control) were incubated with the macrophages. Phagocytosis activity was reported as the percent of macrophages that internalized three or more zymosan particles. HDL co-incubated with zymosan did not influence the over-all uptake of zymosan particles compared to apoHDL, which greatly enhanced the ability of the particle to be phagocytized (P<0.001). Part of this effect might be related to a greater binding of apoHDL to the particles compared to that of HDL (P<0.05). We conclude that this can be a useful method to study the ability of lipoproteins, including modified lipoproteins obtained from subjects with genetic forms of hyperlipidemia, to opsonize particles such as red blood cells and thus to investigate the processes that control the formation of foam cells and the mechanisms of atherogenesis.

In vitro cytotoxicity of the LDE: daunorubicin complex in acute myelogenous leukemia blast cells

Acute myelogenous leukemia (AML) blast cells show high-affinity degradation of low-density lipoprotein (LDL), suggesting an increased expression of cellular LDL receptors. LDE is a lipid microemulsion easily synthesized in vitro which is known to mimic the metabolic pathway of LDL. We used LDE as a carrier for daunorubicin and assayed the cytotoxicity of the complex using AML blast cells since RT-PCR analysis showed that AML cells express LDL receptor mRNA. The LDE:daunorubicin complex killed 46.7% of blast cells and 20.2% of normal bone marrow cells (P<0.001; Student t-test). Moreover, this complex destroyed AML blast cells as efficiently as free daunorubicin. Thus, LDE might be a suitable carrier of chemotherapeutic agents targeting these drugs to neoplastic cells and protecting normal tissues.

Estrogen replacement therapy and cardioprotection: mechanisms and controversies

Epidemiological and case-controlled studies suggest that estrogen replacement therapy might be beneficial in terms of primary prevention of coronary heart disease (CHD). This beneficial effect of estrogens was initially considered to be due to the reduction of low density lipoproteins (LDL) and to increases in high density lipoproteins (HDL). Recent studies have shown that estrogens protect against oxidative stress and decrease LDL oxidation. Estrogens have direct effects on the arterial tissue and modulate vascular reactivity through nitric oxide and prostaglandin synthesis. While many of the effects of estrogen on vascular tissue are believed to be mediated by estrogen receptors alpha and ß, there is evidence for `immediate non-genomic' effects. The role of HDL in interacting with 17ß-estradiol including its esterification and transfer of esterified estrogens to LDL is beginning to be elucidated. Despite the suggested positive effects of estrogens, two recent placebo-controlled clinical trials in women with CHD did not detect any beneficial effects on overall coronary events with estrogen therapy. In fact, there was an increase in CHD events in some women. Mutations in thrombogenic genes (factor V Leiden, prothrombin mutation, etc.) in a subset of women may play a role in this unexpected finding. Thus, the cardioprotective effect of estrogens appears to be more complicated than originally thought and requires more research.

Association of CYP7A1 -278A>C polymorphism and the response of plasma triglyceride after dietary intervention in dyslipidemic patients

We investigated the effect of the -278A>C polymorphism in the CYP7A1 gene on the response of plasma lipids to a reduced-fat diet for 6 to 8 weeks in a group of 82 dyslipidemic males with a mean age of 46.0 ± 11.7 years. Individuals who presented at least one high alteration in total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol or triglyceride values were considered to be dyslipidemic. Exclusion criteria were secondary dyslipidemia due to diabetes mellitus, renal, liver, or thyroid disease. None of the subjects were using lipid-lowering medication. Baseline and follow-up lipid concentrations were measured. The genotypes were determined by the digestion of PCR products with the BsaI restriction endonuclease. There were statistically significant reductions in plasma total cholesterol, low-density lipoprotein cholesterol and triglyceride concentrations after dietary intervention. The minor allele C has a frequency of 43%. Carriers of the C allele had significantly lower triglyceride concentrations (P = 0.02) than AA homozygotes. After adjustment of covariates, subjects with the AC and CC genotypes showed a greater reduction in triglyceride concentrations compared to subjects with the AA genotype. Multiple linear regression analyses showed that the AC and CC CYP7A1 genotypes accounted for 5.2 and 6.2% of triglyceride concentration during follow-up and adjusted percent of change of triglyceride concentration, respectively. The present study provides evidence that -278A>C polymorphism in the CYP7A1 gene can modify triglyceride concentrations in response to a reduced fat diet in a dyslipidemic male population. This gene represents a potential locus for a nutrigenetic directed approach.

Use of intravascular ultrasonography for the characterization of coronary artery disease in patients with chronic kidney disease

INTRODUCTION: Chronic kidney disease patients present a very high cardiovascular mortality. Nevertheless, a comparative description of lesion characteristics, using intravascular ultrasound in dialysis patients, has not yet been reported. The objective of the present study was to analyze the plaque morphology through intravascular ultrasound in comparison to their counterparts with normal renal function. METHODS: Patients were screened for coronary artery disease, and the coronary angiography was performed when indicated. Plaque morphology was evaluated by ultrasound, and findings were compared to a group of patients with coronary artery disease, who presented normal renal function, it carefully matched for all Framingham risk factors and lesion location at the coronary artery tree. RESULTS: One hundred and thirty-nine patients from a single center of hemodialysis were screened for the study. Patients with coronary lesions confirmed at the angiography presented lower hemoglobin (10.8 ± 1.5 versus 12.0 ± 19; p < 0.046) levels and higher levels of low-density lipoprotein (110.6 ± 25.8 versus 75.5 ± 43.1; p < 0.004), when compared to the ones without coronary artery disease. The ultrasound revealed greater proximal reference diameter (4.1 ± 0.6 versus 3.7 ± 0.5; p < 0.007), smaller crossed sectional area (4.2±1.6 versus 5.2 ± 1.8; p < 0.02), and the calcification was located in a deeper arterial layer (69 versus 9%; p < 0.004) in patients with chronic kidney disease when compared to the Control Group. CONCLUSION: Lesions of the patients with chronic kidney disease presented a larger proximal diameter and intense calcification in the deeper layer of the vessel, which suggest a greater positive remodeling effect in response to a more aggressive atherosclerotic process in the medial section of the artery.

Mating behaviours of the field cricket (Gryllus integer) at different levels of male density

The reproductive behaviour of the field cricket, Gryllus integer, was systematically observed in indoor arenas to determine the extent of female Choice and male-male competition at different sex ratios representing two male densities (12:6 and 6:6). The costs and benefits to males and females in those two densities were analyzed according to the theory of the evolution o£ leks. Observations were conducted during the dark hours when most calling occurred since hourly rates of courtship song and mating did not fluctuate significantly over a 24 h period. Female mating rates were not significantly different between densities, therefore males at high densities were not advantaged because of increased female tendencies to mate when social stimulation was increased. Mean rates of acoustical signalling (calling and courtin"g) did not differ significantly between densities. Mean rates of fighting by males at the high density were significantly greater than those of males at the low density. Mating benefits associated with callin~courting and fighting were measured. Mating rates did not vary with rates of calling at either density. Calling was not a prerequisite to mating. Courtship song preceded all matings. There was a significant power fit between male mating and courting rates, and male mating and fighting rates at the low, but not at the high, density. Density differences in the benefits associated with increased courting and fighting may relate, in part, to greater economic defensibility and monopoly of females due to reduced male competition at the low density. Dominant males may be preferentially chosen by females or better able to monopolize mating opportunities than subordinate males. Three criteria were used to determine whether dominant males were preferentially chosen by females. The number of matings by males who won fights (within 30 min of mating) was significantly greater than the number of matings by males who were defeated in such fights. Mating rates did not vary significantly with rates of winning at either density. There was a significant power fit between male mating rates and the percentage of fights a male won (irrespective of his fighting-frequency) at the low density. The mean duration a male guarded the female after mating did not vary significantly between densities. There was a significant linear relationship between the duration a spermatophore was retained and the duration a male guarded the female after mating. Courtship song apparently stimulated spermatophore removal. Male guarding involved inter-male aggression and reduced courtship attempts by other males. Males at the high density received no apparent reproductive benefits associated with increased social stimulation. Conclusive evidence for preferential choice of males by females, using the criteria examined here, is lacking. Males at the lower density had fewer competitors and could monopolize females more effectively.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Estrogen withdrawal and liver fat accumulation : contribution of hepatic VLDL-TG production and effect of exercise training

L’accumulation de triglycérides (TG) dans les hépatocytes est caractéristique de la stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA). Cette dernière se produit dans diverses conditions dont le facteur commun est le métabolisme anormal des lipides. Le processus conduisant à l'accumulation des lipides dans le foie n’a pas encore été totalement élucidé. Toutefois, des lipides s'accumulent dans le foie lorsque les mécanismes qui favorisent leur exportation (oxydation et sécrétion) sont insuffisants par rapport aux mécanismes qui favorisent leur importation ou leur biosynthèse. De nos jours il est admis que la carence en œstrogènes est associée au développement de la stéatose hépatique. Bien que les résultats des études récentes révèlent l'implication des hormones ovariennes dans l'accumulation de lipides dans le foie, les mécanismes qui sous-tendent ce phénomène doivent encore être étudiés. En conséquence, les trois études présentées dans cette thèse ont été menées sur des rates ovariectomizées (Ovx), comme modèle animal de femmes post-ménopausées, pour étudier les effets du retrait des œstrogènes sur le métabolisme des lipides dans le foie, en considérant l'entraînement physique comme étant un élément positif pouvant contrecarrer ces effets. Il a été démontré que l'entraînement physique peut réduire l'accumulation de graisses dans le foie chez les rates Ovx. Dans la première étude, nous avons montré que chez les rates Ovx nourries à la diète riche en lipides (HF), les contenus de TG hépatiques étaient élevées (P < 0.01) comparativement aux rates Sham, 5 semaines après la chirurgie. Le changement de la diète HF par la diète standard (SD) chez les rates Sham a diminué l’accumulation de lipides dans le foie. Toutefois, chez les rates Ovx, 8 semaines après le changement de la HF par la SD le niveau de TG dans le foie était maintenu aussi élevé que chez les rates nourries continuellement avec la diète HF. Lorsque les TG hépatiques mesurés à la 13e semaine ont été comparés aux valeurs correspondant au retrait initial de la diète HF effectué à la 5e semaine, les niveaux de TG hépatiques chez les animaux Ovx ont été maintenus, indépendamment du changement du régime alimentaire; tandis que chez les rats Sham le passage à la SD a réduit (P < 0.05) les TG dans le foie. Les mêmes comparaisons avec la concentration des TG plasmatiques ont révélé une relation inverse. Ces résultats suggèrent que la résorption des lipides au foie est contrée par l'absence des œstrogènes. Dans cette continuité, nous avons utilisé une approche physiologique dans notre seconde étude pour investiguer la façon dont la carence en œstrogènes entraîne l’accumulation de graisses dans le foie, en nous focalisant sur la voie de l'exportation des lipides du foie. Les résultats de cette étude ont révélé que le retrait des œstrogènes a entraîné une augmentation (P < 0.01) de l’accumulation de lipides dans le foie en concomitance avec la baisse (P < 0.01) de production de VLDL-TG et une réduction l'ARNm et de la teneur en protéines microsomales de transfert des triglycérides (MTP). Tous ces effets ont été corrigés par la supplémentation en œstrogènes chez les rates Ovx. En outre, l'entraînement physique chez les rates Ovx a entraîné une réduction (P < 0.01) de l’accumulation de lipides dans le foie ainsi qu’une diminution (P < 0.01) de production de VLDL-TG accompagnée de celle de l'expression des gènes MTP et DGAT-2 (diacylglycérol acyltransférase-2). Des études récentes suggèrent que le peptide natriurétique auriculaire (ANP) devrait être au centre des intérêts des recherches sur les métabolismes énergétiques et lipidiques. Le ANP est relâché dans le plasma par les cellules cardiaques lorsque stimulée par l’oxytocine et exerce ses fonctions en se liant à son récepteur, le guanylyl cyclase-A (GC-A). En conséquence, dans la troisième étude, nous avons étudié les effets du blocage du système ocytocine-peptide natriurétique auriculaire (OT-ANP) en utilisant un antagoniste de l’ocytocine (OTA), sur l'expression des gènes guanylyl cyclase-A et certains marqueurs de l’inflammation dans le foie de rates Ovx. Nous avons observé une diminution (P < 0.05) de l’ARNm de la GC-A chez les rates Ovx et Sham sédentaires traitées avec l’OTA, tandis qu’une augmentation (P < 0.05) de l'expression de l’ARNm de la protéine C-réactive (CRP) hépatique a été notée chez ces animaux. L’exercice physique n'a apporté aucun changement sur l'expression hépatique de ces gènes que ce soit chez les rates Ovx ou Sham traitées avec l’OTA. En résumé, pour expliquer l’observation selon laquelle l’accumulation et la résorption de lipides dans le foie dépendent des mécanismes associés à des niveaux d’œstrogènes, nos résultats suggèrent que la diminution de production de VLDL-TG induite par une déficience en œstrogènes, pourrait être un des mecanismes responsables de l’accumulation de lipides dans le foie. L’exercice physique quant à lui diminue l'infiltration de lipides dans le foie ainsi que la production de VLDL-TG indépendamment des niveaux d'œstrogènes. En outre, l'expression des récepteurs de l’ANP a diminué par l'OTA chez les rates Ovx et Sham suggérant une action indirecte de l’ocytocine (OT) au niveau du foie indépendamment de la présence ou non des estrogènes. L’axe ocytocine-peptide natriurétique auriculaire, dans des conditions physiologiques normales, protègerait le foie contre l'inflammation à travers la modulation de l’expression de la GC-A.

Dégradation des membres de la famille du LDLR par la convertase PCSK9 : troisième locus de l'hypercholestérolémie familiale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel.

Contribution différentielle du tissu adipeux mâle et femelle dans l’établissement du diabète de type 2 et des altérations cardiovasculaires : rôle de l’apport lipidique

Au cours des dernières années, il est devenu évident que les sociétés des pays industrialisés sont à haut risque de maladies métaboliques. Une alimentation riche en énergie (lipide/glucide), combinée à une sédentarité accrue, est un facteur environnemental contribuant à l'augmentation de la prévalence de maladies reliées spécifiquement à des troubles endocriniens comme l'obésité et le diabète. Le traitement de ces désordres métaboliques doit donc passer par la connaissance et la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent ces désordres et le développement de traitements ciblés vers les facteurs responsables. Le tissu adipeux est une glande endocrine qui sécrète des substances, regroupées sous le terme d'adipokines, qui contrôlent l'homéostasie énergétique. L'augmentation de la masse adipeuse est responsable du développement de dérégulation hormonale qui mène à des dysfonctions physiologiques et métaboliques. Pour contrecarrer le développement démesuré du tissu adipeux, la signalisation insulinique ainsi que l’apport énergétique, responsables de la différenciation adipocytaire, doivent être inhibés. In vivo, la leptine, adipokine dont la concentration est corrélée à la masse adipeuse, présente des actions pro ou anti-insuliniques dans l’organisme pour réguler ce phénomène. Elle favorise l’effet inhibiteur de l’insuline sur la synthèse hépatique de glucose alors qu’elle s’oppose à son action sur l’expression des enzymes glucokinase et phosphoénol-pyruvate carboxykinase. La leptine influence aussi le taux circulant de triglycérides en diminuant sa concentration plasmatique. D'autre part, l'adiponectine, adipokine insulino- sensibilisante, voit sa sécrétion diminuée avec la prise de poids. La sensibilité à l'insuline est ainsi diminuée au fur et à mesure que le débalancement de ces deux adipokines s'accentue. La résistance à l'insuline s'installe alors pour s'opposer au stockage énergétique et à la prise illimitée de poids et la glycémie augmente. L'augmentation du glucose sanguin stimule la sécrétion d'insuline au niveau des cellules pancréatiques. C'est le diabète caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l'insuline. Le diabète, une des premières causes de mortalité dans le monde, est plus répandu sous sa forme non insulinodépendante (diabète de type 2, DT2) liée à l'obésité. Récemment, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateurs de l'expression d'une panoplie de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique. Parmi eux, les récepteurs des inducteurs de la prolifération des peroxysomes (PPAR, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Les PPAR ont été démontrés comme ayant un rôle central dans le contrôle de la transcription des gènes codants pour des protéines impliquées dans le métabolisme : les adipokines. PPARg, en plus de son implication dans le contrôle de l'homéostasie glucidique et lipidique, est reconnu comme étant un facteur de transcription pivot régulant l'adipogenèse du fait de son expression majeure dans le tissu adipeux. D'autre part, il est bien établi maintenant que l'obésité et le diabète sont des facteurs contribuant au développement du processus inflammatoire vasculaire caractéristique de l’athérosclérose. En effet, les cellules endothéliales et musculaires lisses, principales composantes de la média de l’artère, sont très sensibles aux altérations métaboliques. Une diminution de la sensibilité à l’insuline entraine une réduction de la disponibilité du glucose et l’utilisation des acides gras comme alternatif par ces cellules. Ceci induit l’accumulation des acides gras oxydés dans l’intima et leur filtration dans la média pour former un core lipidique. Bien que l’induction de la dysfonction endothéliale soit impliquée très précocement, certaines études pointent l’accumulation lipidique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et leur dysfonction comme déclencheurs de l’athérosclérose. Ce travail visait donc, dans un premier temps, à développer un modèle d'altérations métaboliques liées à la modulation de l'activité du tissu adipeux via une alimentation riche en lipides. Dans un second temps, cette étude tentait d'évaluer l’impact des adipocytes de souris sur les CML vasculaires et sur la modulation de leurs fonctions dans ce modèle d'altérations métaboliques et DT2 liés à l'alimentation et à l'obésité. Ainsi, par le biais de deux diètes pauvres en cholestérol à profil lipidique différent, nous avons développé un modèle murin présentant divers stades d'altérations du métabolisme allant jusqu'au DT2 en lien avec l'obésité chez les mâles et chez les femelles. D’autre part, des signes de cardiomyopathie ainsi qu’une modulation du taux des adipokines sont reliés à ces mêmes diètes. Parallèlement, l’activité de PPAR!2 est modulée chez les souris sous diètes enrichies en gras. Ensuite, nous avons démontré que les adipocytes, provenant de souris alimentées avec une diète enrichie en gras, modulaient la migration et la prolifération des CML comparativement au groupe contrôle. Ces modulations dépendaient en grande partie de la nature de la diète consommée, mais également du sexe de la souris. Par ailleurs, les altérations fonctionnelles des CML, couplées à des modulations géniques, sont associées aux changements du profil de sécrétion des adipokines mesurées chez les adipocytes. L’ensemble de ces travaux suggère une action directe de la nature de la stimulation du tissu adipeux blanc dans la modulation du profil de sécrétion des adipokines et l'induction du DT2 in vivo. Ces altérations de la physiologie adipocytaire se reflètent in vitro où le tissu adipeux contribue aux altérations physiopathologiques des CML liées au DT2. Ainsi, cette étude est l'une des premières à établir un lien direct entre les modulations adipocytaires et les effets de leurs sécrétions sur la physiologie des CML. Ces observations peuvent être exploitées cliniquement dans un développement futur d’outils thérapeutiques visant à prévenir et à traiter les troubles métaboliques et le DT2, en ciblant le tissu adipeux comme entité métabolique et endocrine.