Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Estudo da cromatina nos sítios de fixação à matriz nuclear no domínio do gene TP53 e das modificações epigenéticas e no modelo de progressão tumoral mamária 21T

Dentre os diversos tipos de câncer agressivos, o câncer de mama é o mais comum em mulheres. Mutações hereditárias e adquiridas, assim como alterações epigenéticas atuam em sinergia na carcinogênese mamária e na progressão tumoral. A proteína P53 é uma supressora de tumor e possui uma atuação fundamental na integridade genômica. Apesar do vasto conhecimento sobre o controle da P53 a nível de proteína, ainda pouco se sabe sobre o controle transcricional do gene TP53. A série 21T, uma série de 4 linhagens celulares originadas da mama da mesma paciente, representando diferentes estágios de progressão tumoral mamária, é um eficiente modelo para investigação das alterações epigenéticas e suas influências na expressão gênica ao longo da progressão do câncer de mama. Nós analisamos a organização do domínio do gene TP53 através da técnica de arranjo de DNA, em diversas linhagens celulares de câncer de mama e linhagens controle, e realizamos uma tentativa de caracterizar estes elementos de DNA nas linhagens controle não-tumorais HB2 e MCF10A e nas tumorais MCF-7, MDA-MB-231, T47D, através dos marcadores epigenéticos de eucromatina, H4Ac, e heterocromatina, H3K9me3. Ainda analisamos a ligação de proteínas à região associada à matriz nuclear (MAR), denominada MAR 2, e a possível ligação da proteína ligante à matriz nuclear (MARBP), PARP-1, através de ensaios de gel shift (EMSA). Detectamos que na linhagem controle epitelial mamária, HB2, o gene TP53 está posicionado num domínio de DNA relativamente pequeno, aproximadamente 50 kb, delimitado por dois sítios de fixação à matriz nuclear. Interessantemente, esta estrutura de domínio se apresentou radicalmente diferente nas linhagens de câncer de mama estudadas, MCF7, T47D, MDA-MB-231 e BT474, nos quais o tamanho do domínio estudado estava aumentado e a transcrição do TP53 diminuída. Os enriquecimentos com os marcadores epigenéticos de cromatina H4Ac e H3K9me3 estão diferentemente distribuídos nas MARs nas linhagens celulares. Surpreendentemente, a MAR 2 apresentou uma ligação altamente específica, o que poderia representar a atuação de fatores transcricionais envolvidos na organização da cromatina. Através de programas de bioinformática, detectamos putativos sítios para interessantes fatores de transcrição, tais como o c/EBP-beta e c-myb, que poderiam atuar em cis regulando a expressão do gene TP53 e outros flanqueadores. Nós propusemos um modelo para a organização da cromatina na região de domínio do gene TP53 com os genes flanqueadores. Através da série 21T, detectamos uma hipometilação global genômica, nas células cancerosas 21NT e 21MT1. Uma importante diminuição da expressão global do marcador H4Ac nas células metastáticas 21MT1, foi detectada em relação às outras linhagens. Os níveis de RNAm das principais enzimas relacionadas as modificações epigenéticas são consistentes com as observadas hipometilação genômica e hipoacetilação. Através de microscopia confocal, verificamos que o marcador H4Ac está localizado, na maior parte na periferia e o marcador H3K9me3, pericêntrico nos núcleos tumorais. Por fim, verificamos que o promotor P1 do gene TP53 apresenta um estado de cromatina aberta, e a expressão do gene TP53 é similar em todas as células da série 21T.

Análise da hemoglobina glicada na expressão de risco cardiovascular e renal em população acompanhada na atenção primária

Indivíduos com hemoglobina glicada (HbA1c) ≥6,5% e níveis normais de glicemia têm maior risco de complicações relacionadas ao diabetes, em médio e longo prazo. Estas evidências foram importantes na recomendação de que HbA1c ≥6,5% fosse aceita como critério diagnóstico de diabetes. Diferenças raciais/ étnicas tem sido encontradas quanto aos níveis de HbA1c. Níveis elevados de HbA1c em indivíduos sem diabetes e com níveis normais de glicemia em jejum tem sido associados a alterações micro e macrovasculares, entre elas alterações da filtração glomerular. Diversos marcadores inflamatórios, em especial a MCP-1 (proteína quimiotática de macrófagos-1), estão envolvidos no mecanismo de lesão glomerular descrito em casos de nefropatia diabética No entanto, a HbA1C ainda não foi amplamente incorporada a rotina de diagnóstico e de acompanhamento na atenção primária brasileira. O objetivo deste estudo foi o de investigar a associação entre a alteração da HbA1c e da glicemia e fatores étnicos/ raciais e de risco cardiovascular e renal em adultos assistidos pelo Programa Médico de Família de Niterói, sem diagnóstico prévio de diabetes. Trata-se de um estudo transversal, onde foram reunidas informações de participantes do Estudo Cardio Metabólico Renal (CAMELIA), colhidas entre os meses de julho de 2006 a dezembro de 2007. Observou-se que o perfil de risco cardiovascular foi mais acentuado em indivíduos com alterações simultâneas da glicemia e da HbA1c. A alteração isolada da glicemia indicou ser condição de maior risco que a alteração isolada da HbA1c. Indivíduos com HbA1c ≥ 6,5% eram em sua maioria mulheres de pele preta e apresentavam maiores níveis de LDL e creatinina sérica. Verificamos associação independente entre a alteração da HbA1c (≥ 5,7 e < 6,5% versus < 5,7%) e diminuição da taxa de filtração glomerular estimada. A HbA1c mostrou ser um marcador subclinico de alterações metabólicas em pacientes nao diabéticos e com glicemia de jejum < 126 mg/dL, em especial na população de mulheres e de indivíduos com a cor da pele preta. Os resultados apontam para a possibilidade de se utilizar a HbA1c como marcador de risco cardiovascular e renal visando propor estratégias de intervenção precoce e assim promover a prevenção de condições de agravos relacionados as alterações do metabolismo da glicose.

Estudo de atributos de virulência e resistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa

P. aeruginosa é um importante agente de infecções relacionadas à assistência em saúde. Habitualmente, o estabelecimento de infecções agudas é precedido pela colonização das mucosas dos pacientes. Não se sabe, porém, se os processos infecciosos são causados pelas próprias cepas bacterianas colonizadoras ou por outras com que os pacientes entrem em contato, dotadas ou não de maior potencial de virulência ou de resistência a antimicrobianos que as tornem mais eficientes como agentes infecciosos. Assim, este estudo teve como objetivos i) investigar a existência de potenciais diferenças entre amostras de P. aeruginosa que causaram apenas colonização e aquelas responsáveis por infecção, isoladas de um mesmo paciente, quanto a seus fenótipos de virulência e de não susceptibilidade a antimicrobiamos; ii) pesquisar a existência de associação entre características dos paciente, incluindo o tipo de evolução clínica, com as demais variáveis estudadas. No estudo foram incluídos 21 pacientes que desenvolveram infecção por P. aeruginosa durante sua internação no Centro de Terapia Intensiva do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, entre abril de 2007 e abril de 2008. De cada paciente foram selecionadas duas amostras bacterianas: a primeira isolada durante o episódio de infecção e a amostra colonizadora obtida imediatamente antes da ocorrência da infecção. As amostras selecionadas foram estudadas quanto a i) expressão de três mecanismos de virulência (citotoxicidade, aderência a células epiteliais respiratórias humanas e capacidade de formação de biofilme); ii) presença de genes codificadores das proteínas efetoras do sistema de secreção do tipo 3 (SST3 - exoS, exoT, exoU e exoY); iii) perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, iv) perfil de fragmentação do DNA cromossômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). As amostras bacterianas obtidas de infecções agudas foram significativamente mais citotóxicas que aquelas obtidas de colonização. Embora sem diferença estatística, a citotoxicidade das amostras que causaram infecção em pacientes que evoluíram para óbito foi superior à citotoxicidade das amostras de pacientes que sobreviveram. O gene que codifica a toxina ExoU foi detectado em 16 amostras (38%), sendo nove de colonização e sete de infecção. Não houve diferença significativa entre as amostras de colonização e infecção quanto à aderência, produção de biofilme, expressão dos genes do SST3 e não-susceptibilidade às diferentes classes de antimicrobianos. Também não foi encontrada associação entre a não-susceptibilidade à quinolona, ou a outras classes de antimicrobianos, e a presença do gene exoU. As 42 amostras de P. aeruginosa estudadas foram incluídas em 20 genótipos. Em 10 deles foi detectado o gene exoU. Amostras de um mesmo genótipo foram uniformes quanto à expressão dos genes do SST3 e a não-susceptibilidade aos antimicrobianos, mas não quanto às outras variáveis estudadas. Em apenas sete pacientes (33,3%), as amostras de colonização e de infecção pertenciam ao mesmo genótipo. Assim, nesse estudo, o estabelecimento do processo infeccioso resultou não da perda do equilíbrio estabelecido entre os mecanismos de agressão das amostras colonizadoras e os de defesa do hospedeiro e sim da introdução de nova cepa bacteriana no organismo hospedeiro, cepa esta dotada de maior potencial citotóxico.

Efeito do tratamento com o extrato hidro-alcoólico do açaí (Euterpe oleracea Mart.) sobre as alterações cardiovasculares em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)

A hipertensão é uma das mais importantes causas de morte prematura no mundo. Estudos sobre a Euterpe oleracea Mart. (açaí), uma planta típica do Brasil e rica em polifenóis, têm mostrado grande potencial terapêutico contra a hipertensão, uma vez que seus benefícios podem ser associados às ações antioxidante, vasodilatadora e anti-hipertensiva. O rato espontaneamente hipertenso (SHR) é um modelo experimental utilizado para o estudo da hipertensão essencial. Neste estudo, investigamos o efeito do tratamento crônico do extrato hidroalcoólico do caroço de açaí (ASE) sobre a hipertensão de SHR. Animais SHR e Wistar receberam tratamento com ASE (200 mg/Kg/dia) na água de beber, ou veículo, desde 21 dias até 4 meses de idade e tiveram a pressão arterial sistólica (PAS) aferida por pletismografia de cauda. Os efeitos vasodilatadores da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foram estudados em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido e pré-contraído com norepinefrina. A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), os níveis de malondialdeído (MDA), a carbonilação de proteínas e os níveis de nitrito foram avaliados em plasma, LAM, coração e rim por espectrofotometria. A expressão das proteínas SOD e eNOS foram avaliadas por western blot em LAM e as alterações vasculares pela espessura da túnica média em aorta. A PAS foi maior (p<0.05) nos animais SHR, e reduzida pelo tratamento com ASE. O efeito vasodilatador reduzido da ACh em SHR foi recuperado pelo ASE e o da NG não foi diferente entre os grupos. Não houve diferença nos níveis de glicose e insulina em SHR comparados aos controles. Entretanto, a insulina se apresentou reduzida no grupo SHR+ASE. O nível de renina foi maior nos SHR e normalizado pelo ASE (p<0.05). Os níveis de MDA não foram diferentes entre SHR e controles, entretanto o tratamento com ASE reduziu esses níveis em rim de SHR (p<0.05). Os níveis de carbonilação de proteínas foram maiores em amostras de rim e coração de SHR e o ASE reduziu o dano sobre proteínas (p<0.05), não tendo diferença em plasma e LAM. A atividade da SOD foi menor em amostras de rim nos animais SHR e aumentada pelo tratamento com ASE (p<0.05). Entretanto, a atividade aumentada da SOD em coração e LAM dos SHR, foi reduzida pelo tratamento com ASE, não havendo diferença em amostras de plasma. Não houve diferença na atividade da GPx em amostras de LAM e coração dos diferentes grupos, porém sua atividade foi aumentada em rim dos SHR, e o tratamento com ASE normalizou essa atividade. Em plasma, a atividade da GPx foi reduzida em SHR e aumentada pelo tratamento (p<0.05). A atividade da enzima CAT foi reduzida em plasma e rim de SHR e o ASE aumentou sua atividade. Não houve diferença em amostras de LAM, entretanto em amostras de coração o tratamento aumentou a atividade da CAT em SHR (p<0.05). Em amostras de plasma, coração e rim, não houve diferença nos níveis de nitrito entre os diferentes grupos, porém em amostras de LAM foram menores em SHR e SHR+ASE (p<0.05). A expressão das proteínas eNOS e SOD apresentaram-se aumentadas em SHR (p<0.05) sem alteração com o tratamento. Os SHR apresentaram um aumento na espessura da camada média da aorta que foi reduzido (p<0.05) pelo ASE. Este estudo demonstrou que o tratamento crônico com ASE em SHR reduziu a hipertensão, preveniu a disfunção endotelial e o remodelamento vascular. O aumento da defesa antioxidante e redução do dano oxidativo devem contribuir para os efeitos benéficos de ASE. Portanto, sugerimos que o ASE pode ser uma ferramenta importante para o tratamento das alterações cardiovasculares associadas à hipertensão essencial.

Bioenergética mitocondrial do coração na obesidade induzida por dieta ocidental em camundongos Swiss

A obesidade, doença resultante do acúmulo excessivo de gordura corporal, é importante fator de risco para diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e doenças cardiovasculares, doenças de alta prevalência em todo o mundo. O processo de transição nutricional decorrente da globalização contribuiu para o crescente número de indivíduos com obesidade, principalmente pela modificação nos hábitos alimentares da população, com ampla inclusão de produtos industrializados ricos em gordura saturada, sal e açúcar, denominada dieta ocidental. Os mecanismos pelos quais a obesidade induzida por dieta leva ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares ainda não estão completamente esclarecidos na literatura, porém sabe-se que a obesidade leva ao comprometimento da função cardíaca e do metabolismo energético, aumentando a morbidade e mortalidade. Em grande parte dos estudos relacionados à obesidade, o metabolismo energético celular comprometido associa-se à disfunção mitocondrial. Neste contexto, torna-se importante avaliar a função mitocondrial na obesidade, visto que as mitocôndrias são organelas com funções-chave no metabolismo energético. No presente estudo, avaliamos inicialmente o efeito obesogênico da dieta ocidental em camundongos Swiss por 16 semanas a partir do desmame. Para tal, analisamos a ingestão alimentar, evolução da massa corporal, Índice de Lee, peso das gorduras epididimal e retroperitoneal, peso e morfologia do fígado, relação entre o peso do fígado/massa corporal, peso do ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal, glicemia de jejum e teste intraperitoneal de tolerância à glicose. Avaliamos também o consumo de oxigênio das fibras cardíacas através da respirometria de alta resolução. Além disso, o conteúdo das proteínas envolvidas no metabolismo energético: Carnitina Palmitoil Transferase 1 (CPT1), proteína desacopladora 2 (UCP2), Transportadores de glicose 1 e 4 (GLUT1 e GLUT4), proteína quinase ativada por AMP (AMPK), proteína quinase ativada por AMP fosforilada (pAMPK), receptor de insulina β (IRβ) e substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) foi determinado por western blotting. Nossos resultados confirmaram o caráter obesogênico da dieta ocidental, visto que os camundongos submetidos a esta dieta (GO), apresentaram-se hiperfágicos (P<0,001) e obesos (72,031,82, P<0,001), com aumento progressivo no ganho de massa corporal. Além do aumento significativo dos parâmetros: Índice de Lee (362,902,44, P<0,001), gorduras epididimal e retroperitonial (3,310,15 e 1,610,11, P<0,001), relação entre o peso do fígado/massa corporal (0,060,003, P<0,001) e peso de ventrículo esquerdo (VE)/massa corporal (0,080,002, P<0,01), hiperglicemia de jejum (192,1014,75, P<0,01), intolerância à glicose (P<0,05, P<0,01) e deposição ectópica de gordura no fígado. A respirometria de alta resolução evidenciou disfunção mitocondrial cardíaca no grupo GO, com reduzida capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos (P<0,001) e aumento do desacoplamento entre a fosforilação oxidativa e a síntese de ATP (P<0,001). Os resultados de western blotting evidenciaram aumento nos conteúdos de CPT1 (1,160,08, P<0,05) e UCP2 (1,080,06, P<0,05) e redução no conteúdo de IRS-1 (0,600,08, P<0,05). Não houve diferença significativa nos conteúdos de GLUT1, GLUT4, AMPK, pAMPK, pAMPK/AMPK e IRβ. Em conclusão, o consumo da dieta ocidental resultou no desenvolvimento de obesidade com disfunção mitocondrial associada a alterações no metabolismo energético.

Estudo do metabolismo mitocondrial e da resposta anti-apoptótica de células endoteliais humanas durante a evolução da infecção por taquizoítos de Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação.

Características morfológicas de vermes adultos machos e fêmeas de Schistosoma mansoni recuperados de camundongos desnutridos e deficientes em óxido nítrico

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral.

Relação entre a via de sinalização da leptina e a progressão de carcinomas papilíferos de tireoide em crianças e adolescentes

O câncer de tireoide é a neoplasia maligna mais comum de glândula endócrina e tem sua incidência aumentada em vários países, inclusive o Brasil, nos últimos anos. Em crianças e adolescentes, o câncer de tireoide é raro, correspondendo a cerca de 2% dos casos, sendo o carcinoma papilífero o tipo histológico mais frequente. O prognóstico de crianças e adolescentes com câncer de tireoide é excelente, com taxas de sobrevida superiores a 95%. Contudo, quando diagnosticada, essa parcela da população apresenta características clínico-patológicas de doença avançada, como invasão de cápsula e extensão extratireoidiana, além de metástase linfonodal. A leptina é um hormônio produzido principalmente pelo tecido adiposo, participando da regulação da ingestão de alimentos e do gasto energético e tem sido associada a fator prognóstico de alguns tumores, como hematológicos, pancreático, câncer de mama e tireoide. Há relatos deste hormônio atuar como fator angiogênico e mitogênico. O objetivo deste estudo é avaliar a associação entre o carcinoma papilífero de tireoide em crianças e adolescentes e proteínas da via de sinalização da leptina, através de imunofluorescência para ObR (receptor de leptina), pJAK2 e pSTAT3, relacionando com dados que apontam para o prognóstico da doença. Foram incluídos no estudo 52 pacientes, sendo a expressão e o padrão de marcação avaliados por consenso entre dois patologistas. O perfil de marcação foi puntiforme e multifocal para o tecido não neoplásico adjacente como para o tecido tumoral. Foram atribuídos scores para a imunomarcação (1-10% e >10%) e analisadas possíveis associações entre ObR, pJAK2 e pSTAT3 com variáveis demográficas qualitativas ou características clínico-patológicas. Todos os casos apresentaram marcação relevante (>10%) no tecido não-neoplásico para as 3 proteínas, enquanto no tecido neoplásico, houve marcação em 53% dos casos para ObR, 47% para pJAK2 e 71% para pSTAT3. ObR foi 6,2 vezes mais frequente em pacientes sem metástase linfonodal. O tamanho do tumor foi inversamente relacionado com marcação relevante para pJAK2 e pSTAT3. Nossos achados mostram que ObR está relacionado a menos metástase linfonodal e pJAK-pSTAT3 com tamanho tumoral reduzido, sugerindo que a via de sinalização da leptina em câncer de tireoide de crianças e adolescentes pode contribuir para prevenir o aumento da tumorigênese.

Análise dos processos recentes de fragmentação e recomposição dos remanescentes florestais do estado do Rio de Janeiro

Ao longo de quase cinco anos de trabalho, foi desenvolvido o Índice de Qualidade dos Municípios - Verde, pela Fundação CIDE. O trabalho buscou retratar as características da fragmentação florestal fluminense. Como um elemento para apoiar a gestão ambiental do território, o projeto identificou corredores ecológicos prioritários para a interligação de fragmentos florestais. A grande contribuição do trabalho, do ponto de vista conceitual, foi reorientar o debate acerca da fragmentação florestal no Estado do Rio de Janeiro. O projeto IQM - Verde apresentou, exaustivamente, lugares onde ocorreram perdas e ganhos de estoques de vegetação com porte arbóreo, num recorte por municípios, bacias hidrográficas e Unidades de Conservação. Existem importantes questões que foram levantadas e ainda aguardam maiores e melhores respostas. Uma delas é tentar explicar, a partir da ecologia de paisagens, quais são os mecanismos que facilitam ou dificultam o processo natural de sucessão florestal. A situação da sucessão florestal é completamente diferente de uma região para outra do Estado. No Noroeste do Estado existem indícios claros de retração e fragmentação dos remanescentes enquanto na região Serrana do Sul Fluminense aparecem sinais claros de recuperação e recomposição florestal. Novos conceitos de gestão ambiental procuram minimizar os efeitos decorrentes da fragmentação e do isolamento espacial das espécies. O aumento da conectividade através de corredores ecológicos entre unidades de conservação e até mesmo entre os fragmentos mais bem conservados é apontado por muitos pesquisadores como uma das formas mais eficazes de promover a manutenção dos remanescentes florestais - a longo prazo - e até mesmo promover a recuperação funcional de determinadas unidades ecológicas atualmente ilhadas. A atual geração de pesquisadores e gestores públicos está diante do problema do controle dos processos que desencadeiam a fragmentação florestal. Portanto, é urgente a necessidade de entender todas as consequências associadas ao processo de fragmentação florestal e, ao mesmo tempo, descobrir os efeitos inibidores deste complexo fenômeno que possui raízes físicas, naturais e sociais. O objetivo central da tese é, a partir de elementos da História das Mentalidades e da Teoria da Decisão, construir cenários de pressão antrópica sobre os remanescentes florestais e propor um programa possível de intervenção econômica, jurídica e política, denominado no presente estudo como bolsa floresta, capaz de aliviar o atual processo de fragmentação florestal.

Enterococcus faecalis: fatores de virulência relacionados aos processos de natureza endodôntica

O objetivo principal deste estudo foi investigar a interação de 24 cepas de E. faecalis isoladas de infecções endodônticas primárias às proteínas de matriz dentinária, como também a moléculas de matriz presentes em lesões de endocardites. A análise desta interação foi feita através de técnica enzimática, com confirmação pela técnica de fluorescência. Além disto, foi realizada a confirmação do isolamento da espécie E. faecalis, através da técnica de PCR para o gene 16SrRNA e a análise da presença de genes de virulência da referida espécie microbiana para aderência às supostas proteínas de matriz incluindo às de ligação ao colágeno (ace, gelE, esp, agg e efaA). O maior padrão de interação das cepas ocorreu com a fibronectina (83,4%), seguido pelo fibrinogênio (62,5%) e colágeno humano tipo I (52%). Curiosamente, a aderência observada para o colágeno do tipo I, foi de pequena magnitude, quando comparado com a amostra padrão da ATCC 29212. As cepas ATCC 29212, A1, A43 e A68 interagiram com todas as proteínas de matriz utilizadas neste estudo. Um percentual expressivo das cepas testadas apresentou amplificação para efaA (86,9%) e para ace (73,9%). Paralelamente, todas as cepas apresentaram amplificação para gelE e foram negativas para os genes agg e esp. Adicionalmente, não houve correlação entre a detecção dos genes de virulência e a interação às proteínas de matriz, evidenciando que, mesmo com a detecção dos genes nas amostras, se faz necessário avaliar a expressão gênica por qPCR.

Análise da Eficiência de Nitrificação em Reatores Biológicos de Leito Móvel (MBBR) em escala de bancada utilizando efluente de Refinaria de Petróleo.

As atividades industriais petroquímicas, incluindo as refinarias de petróleo, são grandes consumidoras de água e, consequentemente, grandes geradoras de efluentes industriais contendo uma infinidade de contaminantes. No caso das refinarias de petróleo brasileiras, o nitrogênio amoniacal tem se tornado um componente crítico a ser tratado, o que tem sido feito através de processos de tratamento biológicos que utilizam a nitrificação como base. Neste trabalho, foi avaliada a operação de um reator de leito móvel (MBBR), em escala de bancada, utilizando suportes de polietileno com área específica de 820 m2.m-3, para tratar um efluente proveniente de uma refinaria brasileira com alta concentração de nitrogênio amoniacal. O efluente bruto apresentou demanda química de oxigênio entre 100 e 300 mg.L-1, teores de nitrogênio amoniacal entre 60 e 90 mg.L-1 e condutividade elétrica entre 1 e 2 mS.cm-1. Mesmo com variações da qualidade da alimentação da planta ao longo do estudo, como o aumento das concentrações de contaminantes, incluindo inibidores da nitrificação típicos dos efluentes de refinaria, a planta atendeu à Resolução CONAMA 430/2011 (BRASIL, 2011), que limita a concentração de descarte em 20 mg.L-1 para o contaminante nitrogênio amoniacal, em 93% das medições. Para o caso de uma fictícia legislação mais restritiva, que exigisse limite de 5 mg.L-1 desse contaminante, houve sucesso no tratamento em 83% do tempo, com eficiência média de nitrificação de 93,1%, evidenciando que há uma possibilidade real de utilização do processo MBBR em refinarias brasileiras.

Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.

Modulação redox da homeostase de células musculares lisas através de estimuladores do sistema NADPH oxidase

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos países ocidentais. Dentre essas doenças, a aterosclerose é que mais se destaca, sendo caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas vasculares (CMLV). O efeito patológico das CMLV em resposta a diferentes estímulos pode acarretar em disfunções nestas células. É notável que a aterosclerose ocorra principalmente em vasos sinuosos onde ocorre um forte turbilhonamento do fluxo sanguíneo, que pode acarretar em hemólise e, consequentemente, acúmulo de heme livre. Além disso, no processo de aterogênese as moléculas de adesão, principalmente integrinas, são de crucial importância durante a resposta de CMLV. Nesse trabalho nosso objetivo inicial foi avaliar o efeito do heme livre nas funções de CMLV, bem como os mecanismos moleculares por trás desses efeitos. Em uma segunda parte, investigamos o envolvimento da integrina α1ß1 no efeito da Angiotensina II (Ang II) em CMLV. Nós observamos que o heme livre é capaz de induzir a proliferação e migração de CMLV via espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes da NADPHoxidase (NADPHox). Adicionalmente vimos que o heme ativa vias de sinalização redox-sensíveis relacionadas à proliferação celular, como MAPKinases e o fator de transcrição NFκB. Também observamos que há uma ligação entre a NADPHox e o sistema heme oxigenase (HO), uma vez que o heme induz a expressão de HO-1 e o pré-tratamento das CMLV com inibidores de HO levam ao aumento tanto o efeito proliferação quanto a indução de ERO promovidas pelo heme. Além disso, vimos que o efeito contra-regulatório promovido pela HO ocorre devido as metabolites do heme: biliverdina, bilirrubina e monóxido de carbono. Por último, quando bloqueamos tanto a NADPHox quanto o sistema HO o heme não teve efeito algum na proliferação de CMLV. Em um segundo estudo, observamos que o efeito da Ang II sobre a migração de CMLV foi inibido quando as células foram pré-tratadas com o ligante da integrina α1ß1, a desintegrina Obtustatina. A seguir observamos que o efeito da Ang II na ativação de FAK e na colocalização actina-ILK é dependente da integrina α1ß1, que possivelmente ativa PKCα, uma vez que vimos que a produção de ERO induzida por Ang II foi inibida pela Obtustatina. Vimos que a indução da expressão de ILK por Ang II em CMLV é dependente da integrina α1ß1 e também observamos que a Obtustatina inibibiu o desacoplamento de ILK da FAK, uma vez que a Obtustatina bloqueou a fosforilação de FAK induzida por Ang II (processo crucial para o desacoplamento da ILK). Nós também observamos que a Ang II induz, via integrina α1ß1, a fosforilação de AKT e a diminuição da expressão de p21, provavelmente via ILK. Corroborando estes dados, nós mostramos que o pré-tratamento com Obtustatina induziu um estacionamento na fase G0 e diminuição da proliferação de CMLV tratadas com Ang II. Portanto, mostramos nesse trabalho que o heme livre induz a ativação de CML via NADPHox, que é elegantemente contra-regulado pelo sistema HO. Além disso, sugerimos que a integrina α1ß1 pode ser um importante alvo molecular para o desenvolvimento de intervenções mais efetivas para a aterosclerose.

Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.