Diabetes e Gravidez. Experiência da Consulta de Medicina Materno-Fetal do Serviço de Obstetricia e Ginecologia do Hospital de Dona Estefânia

Os autores realizaram um estudo retrospectivo das 87 grávidas vigiadas na Consulta de Diabetes do Hospital de Dona Estefânia com diabetes pré-gestacional tipo 1 e 2 e diabetes gestacional, durante um período de 2 anos. Analisararn a idade das grávidas, raça, paridade, tipo de diabetes, patologia associ ada, antecedentes familiares de diabetes, idade gestacional em que foi feito o diagnóstico de diabetes, insulinoterapia, evolução da gravidez, idade gestacional na altura do parto, características do parto e dos recém-nascidos e controlo no pós parto. A maioria das grávidas inscritas na consulta tinha idade superior a 30 anos (76%). A diabetes gestacional foi o tipo de diabetes mais frequente na consulta, tendo ocorrido sobretudo no 3° trirnestre. A hipertensão arterial crónica foi a patologia associada dominante, complicando-se em cinco casos de pré-eclâmpsia.Para além da pré-eclâmpsia, outra das complicacções mais frequentes foi a infecçãoo urinária. A cesariana foi o tipo de parto mais frequente. As suas principais indicações foram a cesariana electiva, a pré-eclâmpsia agravada e a distoócia. A macrossomia fetal só ocorreu em 5 dos 60 partos, refletindo um bom controlo metabólico.

Sistemas bacterianos no estudo da bioactivação do antirectroviral nevirapina

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Investigações sôbre inibidores para o vírus da poliomielite, presentes em soros de bovinos

Inibidores contra as amostras de poliovírus do tipo 1, Mahoney e CHAT, foram estudados no sistema de gel de hidróxido de alumínio. O inibidor comportou-se como uma macroglobulina do tipo 19 S (IgM), através filtração em gel (Sephadex G-200), partição em DEAE-Celulose e sedimentação por ultra-centrifugação em gradiente de sacarose. O inibidor foi ainda destruído através o tratamento com 2-Mercapto-Etanol. O inibidor une-se à superfície do vírus na ausência de células. O complexo formado pelo vírus e o inibidor pode ser precipitado por um sôro preparado contra a globulina bovina; o mesmo complexo dissocia-se em idêntico valor de pH ao do complexo vírus-anticorpo 19 S. A chamada infecciosidade residual (cêrca de 10%) que permanece após a neutralização de poliovírus com sôro bovino representa uma dissociação parcial do inibidor da partícula de vírus, quando em presença das células em cultura. Foram obtidas amostras de vírus resistentes à ação específica de soros bovinos. Estas amostras permanecem sensíveis à ação de outros soros bovinos ativos, bem como à ação de anticorpos 7 S e 19 S. Através experiências de adsorção de atividade inibidora, foi possível mostrar a existência de inibidores monoespecíficos, com diferentes especificidades contra as amostras CHAT e Mahoney, respectivamente.

Obesidade: Casuística de uma Consulta de Endocrinologia Pediátrica, como Base de uma Proposta de Intervenção Terapêutica

A obesidade tem vindo a tornar-se um problema cada vez mais prevalente nas crianças e nos jovens dos países economicamente desafogados, sendo, na sua maioria, o resultado de erros alimentares e de uma vida sedentária. O objectivo deste trabalho é avaliar as características das crianças e dos jovens enviados pela primeira vez à Consulta de Endocrinologia do Hospital de Dona Estefânia (HDE) no ano de 1999 por obesidade, no que diz respeito às causas e consequências da mesma, e aos resultados do seguimento. Durante o ano referido foram avaliados 107 crianças e adolescentes em consulta de primeira vez por obesidade, constituindo 36 % dos motivos de primeira consulta. O índice de massa corporal (IMC) era superior a 30 em 26 % dos doentes. Cerca de metade apresentavam antecedentes familiares de obesidade e ou diabetes mellitus tipo 2. Treze por cento apresentavam alterações ortopédicas provocadas ou agravadas pela obesidade e 9 % tinham valores de tensão arterial superiores ao P95 para o sexo e idade. Verificaram-se também alterações da tolerância à glicose, hiperinsulinismo, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia. Cinquenta e um por cento dos indivíduos tiveram apenas duas consultas, e a redução de peso na segunda consulta obteve-se em 62 % dos casos. Com base em trabalhos recentes, propõe-se um protocolo de abordagem destes doentes que permita uma selecção, de forma a identificar patologias que requeiram tratamento adequado.

Pesquisa sobre a ocorrência de histeria monocytogenes em fezes humanas

Foi pesquisada em 107 amostras de fezes procedentes de indivíduos com distúrbios intestinais a presença de Listeria monocytogenes. Como processo de enriquecimento, as fezes foram semeadas em caldo triptose fosfatado e mantidas a 4ºC durante 1 mês. Ao findar este prazo, foram os espécimes semeados em quatro meios seletivos: 1) Agar triptosado com 5 mcg/ml de Polimixina; 2) Agar triptosado com 50 cmg/ml de ácido nalidixico; 3) Meio de Ralovich e cols (Agar com 5% de soro normal de cavalo, acrescido de 50 mcg/ml de ácido nalidixico e 50 mcg/ml de tripaflavina (Bayer); 4) Uma modificação do meio de Ralovich (Agar triptosado, contendo 40 mcg/ml de ácido nalidixico, 50 mcg/ml de acetato de tálio, 25 mcg/ml de tripaflavina e 0,3% de extrato de levedura). Para reconhecimento das colônias suspeitas nos diferentes meios, fez-se uso da técnica de Henry. A identificação primária se baseou na observação da motilidade e nas características morfotintoriais, senão a seguir, confirmada através das provas bioquímicas e sorológicas. Três amostras de Listeria monocytogenes foram isoladas, caracterizando- se duas no sorotipo 4b e uma no tipo 1/2a.

A diabetes: principais parâmetros para o controlo da diabetes

RESUMO: A Diabetes Mellitus é uma doença metabólica crónica, com deficiência a nível do metabolismo dos hidratos de carbono, lípidos e proteínas, resultante de deficiências na secreção ou ação da insulina, ou de ambas, que quando não tratada antecipadamente e de modo conveniente, pode ter consequências muito graves. Dado a incidência a nível mundial da Diabetes Mellitus, torna-se de elevada importância avaliar toda a sua envolvência e estudar bem quais os critérios a ter em consideração. Este trabalho propõe-se estudar para além dos parâmetros bioquímicos relacionados com a doença - Glicose e Hemoglobina Glicada A1c (HbA1c), analisar os resultados dos últimos cinco anos (2008-2012) dos ensaios interlaboratoriais do PNAEQ, do Departamento de Epidemiologia, do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Foram também analisadas as metodologias utilizadas e as variações interlaboratoriais, de forma a entender qual ou quais são os parâmetros mais adequados para o seu diagnóstico e controlo. Este estudo utilizou a população de laboratórios portugueses, públicos e privados, de Portugal Continental e Ilhas, um laboratório de Angola e outro de Macau que se inscreveram no PNAEQ nestes cinco anos, sendo a amostra composta pelo n.º de participações. No programa de Química Clinica foram distribuídas 38 amostras e no programa de HbA1c foram distribuídas 22 amostras. Para a glicose, o nível de desempenho nos ensaios é na globalidade das amostras de Excelente, no entanto verifica-se que sempre que a concentração da amostra é de nível patológico, que a maioria dos ensaios o desempenho foi inferior – Bom. O método de eleição e com CV% mais baixos foi o método da hexoquinase. Para a HbA1c, o nível de desempenho nos ensaios é na globalidade das amostras de Excelente. O método de eleição e com CV% mais baixos foi o método de HPLC. O CV% para a glicose ronda desde 2010 a 2012, os 3% e para a HbA1c foi de aproximadamente 4,0% em 2012. A HbA1c tem mostrado ser uma ferramenta muito útil, importante e robusta na monitorização da Diabetes, sendo hoje em dia quase sempre requisitada em análises de rotina a diabéticos de modo a prevenir complicações que possam vir a acorrer. No futuro poderá ser um importante, senão o parâmetro de futuro, para o diagnóstico da Diabetes, no entanto, mesmo já tendo sido muito trabalhada a sua padronização, ainda existem questões por responder como quais são na realidade todos os seus interferentes, qual a verdadeira relação da HbA1c com a glicose média estimada, em todas as populações e com estudos epidemiológicos. Também a própria educação do diabético e clínico deve ser aprimorada, pelo que neste momento as PTGO e os doseamentos de glicose em jejum devem ser utilizados e encontrando-se a Norma da DGS N.º 033/2011 de acordo com as necessidades e com o estado da arte deste parâmetro. A implementação da glicose média estimada será uma mais-valia na monitorização dos diabéticos pelo que deverá ser uma das prioridades a ter em conta no futuro desta padronização, uniformizando a decisão clinica baseada nela e minimizando a dificuldade de interpretação de resultados de laboratório para laboratório. --------------ABSTRACT: Diabetes Mellitus is a chronic metabolic disease, with a deficit in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, resulting from deficiencies in insulin secretion or action, or both, which if, when not early treated in a proper way, may result in very serious consequences. Given the worldwide incidence of diabetes mellitus, it is highly important to evaluate all its background and study specifically all the criteria to take into consideration. The aim of this thesis is to study and evaluate beyond the biochemical parameters related to the disease - Glucose and Glycated Haemoglobin A1c (HbA1c), analyze the results of the last five years (2008-2012) of the PNAEQ interlaboratorial tests, in the Department of Epidemiology of National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge. It is also intended to analyze the methodologies used and the interlaboratorial variations, in order to understand the most suitable parameters for the diagnosis and control. This study was based in a population of Portuguese laboratories, public and private, of Portugal mainland and islands, a laboratory of Angola and other from Macau, who enrolled in PNAEQ in these five years, and the sample was composed by the n. º of holdings. In the Clinical Chemistry Program there were distributed 38 samples and in the program HbA1c were distributed 22 samples. For glucose, the level of performance in the total nº of the samples was Excellent; however, it was found that when the concentration level of the sample was pathological, in most of the tests the performance was Good. The most preferred method with the lowest CV% is the hexokinase method. For the HbA1c, as a whole, the samples’ tests were Excellent, at the level of performance. The method of election with the lower CV% was the HPLC. The CV% for glucose was around 3%, from 2010 to 2012 and the HbA1c was approximately 4.0% in 2012. The HbA1c method has demonstrated to be a very useful tool, important and robust for monitoring diabetes, being nowadays, almost always required in routine analysis to prevent future complications. In the future it may be an important parameter, if not the most important, for the diagnosis of diabetes. However, despite it has already been standardized, there are still some questions that need to be answered, such as, which are in fact all their interferences, which is the true connection of HbA1c, when compared with the estimated average glucose, in all populations and epidemiological studies. Moreover, the education of the patient and the doctor concerning diabetes should be improved. Nowadays, the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and fasting glucose determinations should be used and, the needs and the state of the art of this parameter, should be in accordance with the Standard DGS N. º 033/2011. The Implementation of the estimated average glucose will be an added value in monitoring diabetics and, therefore, should be a priority to consider in its future standardization and clinical decision based on it, will be uniform and the difficulty of interpreting results from laboratory to laboratory will be minimal.

Frequência de lesões sugestivas de toxoplasmose ocular em uma população rural do Estado do Rio de Janeiro

Para determinar a prevalência da toxoplasmose ocular na população em geral do bairro de Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ, foi realizado um estudo seccional no qual 1.071 indivíduos foram submetidos a testes sorológicos (IgG e IgM anti-Toxoplasma) e a exame físico e oftalmológico. O diagnóstico da toxoplasmose ocular presumida foi baseado em critérios clínicos, sorológicos e aspecto da lesão retinocoroidiana. As lesões foram classificadas em três tipos morfológicos: 1. Limites marcados com halo de hiperpigmentação e área de atrofia coriorretiniana central. 2. Halo hipopigmentado e área central hiperpigmentada e 3. Hiperpigmentadas ou hipopigmentadas. A prevalência de lesões cicatrizadas compatíveis com toxoplasmose ocular foi de 3,8% na população em geral e 5,8% entre os indivíduos com sorologia positiva para Toxoplasma gondii (65,9% dos indivíduos analisados), com predominância de: lesões do tipo 1 (41,5%), sexo feminino (68,3%), periféricas (58,5%) e menores que 3 diâmetros de disco (87,8%).

Fisiopatologia da microcirculação coronária e perfusão do miorcárdio : ecocardiografia de contraste do miocárdio e doppler transtorácico

RESUMO: Este trabalho tentou contribuir para a caracterização da fisiopatologia da microcirculação coronária em diferentes formas de patologia com o auxílio da ecocardiografia transtorácica. Com a aplicação da ecocardiografia Doppler transtorácica foi efectuado o estudo da reserva coronária da artéria descendente anterior e com a ecocardiografia de contraste do miocárdio foram analisados parâmetros de perfusão do miocárdio como a velocidade da microcirculação coronária, o volume de sangue miocárdico e a reserva de fluxo miocárdico. Estas técnicas foram utilizadas em diferentes situações fisiopatológicas com particular interesse na hipertrofia ventricular esquerda de diferentes etiologias como a hipertensão arterial, estenose aórtica e cardiomiopatia hipertrófica. Também na diabetes mellitus tipo 2 e na doença coronária aterosclerótica, estudámos as alterações da microcirculação coronária. Com a mesma técnica de ecocardiografia de contraste do miocárdio foi analisada a perfusão do miocárdio num modelo experimental animal sujeito a uma dieta aterogénica. Além das conclusões específicas em relação a cada um dos trabalhos efectuados há a referir como conclusões gerais a sua fácil aplicabilidade e exequibilidade em âmbito clínico, a sua reprodutibilidade e precisão. Quando comparadas com técnicas consideradas de referência mostraram resultados com significativa correlação estatística. Em todos os doentes e nos grupos controle foi possível comprovar e quantificar o gradiente de perfusão transmural em repouso e durante a acção de stress vasodilatador, relevando a importância da perfusão sub-endocárdica na função do ventrículo esquerdo. O estudo da microcirculação coronária no grupo de doentes com hipertrofia ventricular esquerda revelou que no grupo com hipertensão arterial existe disfunção da microcirculação coronária ainda antes de se observar aumento de massa do ventrículo esquerdo, e que esta disfunção é diferente em função da geometria ventricular. Nos doentes com estenose aórtica foi demonstrado que além da disfunção da microcirculação coronária, explicada pelo fenómeno de hipertrofia, existe outro componente extrínseco que depois de corrigido através de cirurgia de substituição valvular, conduziu a uma parcial normalização dos valores de reserva coronária. Na cardiomiopatia hipertrófica observou-se uma grande heterogeneidade de perfusão transmural e foi documentado, em imagens de ecocardiografia de contraste do miocárdio e após análise paramétrica, a ausência de perfusão do miocárdio na região sub-endocárdica durante o stress vasodilatador de reserva coronária diminuídos em fases precoces de evolução da doença. Foi demonstrado que a reserva coronária na DM2 em fases mais avançadas estava significativamente diminuída. Descrevemos também em doentes com DM2 e sem doença coronária angiográfica a existência de disfunção da microcirculação coronária. Durante o stress vasodilatador, observámos e documentámos neste grupo de doentes, a existência de defeitos de perfusão transitórios ou de diminuição da velocidade da microcirculação coronária. No grupo de doentes com doença coronária confirmámos o interesse da avaliação da reserva coronária após intervenção percutânea na definição de prognóstico pós EAM, em termos de recuperação funcional do ventrículo esquerdo. Em doentes com BCRE e de difícil estratificação de risco, foi possível calcular o valor de reserva coronária e estratificar o risco de doença coronária. Num modelo experimental animal demonstrámos a exequibilidade da técnica de ECM, e verificámos que nessas condições experimentais, uma sobrecarga aterogénica na dieta, ao fim de 6 semanas, comprometia severamente a reserva coronária. Estes resultados foram parcialmente reversíveis quando à dieta foi adicionada uma estatina. Estas técnicas pela sua não invasibilidade, fácil acesso, repetibilidade e inocuidade perspectivam-se de grande utilidade na caracterização de doentes com disfunção da microcirculação coronária, nas diferentes áreas de diagnóstico, terapêutica e prevenção. A possibilidade de adaptar a técnica em modelos experimentais animais também nos parece poder vir a ter grande utilidade em investigação.----------------ABSTRACT: This work is intended to be a contribution to the study of coronary microcirculation applying new echocardiographic techniques as transthoracic Doppler echocardiography of coronary arteries and myocardial contrast echocardiography. Coronary flow reserve may be assessed by transthoracic Doppler echocardiography, and important functional microcirculation parameters as microcirculation flow velocity, myocardial blood volume and myocardial flow reserve may be evaluated through myocardial contrast echocardiography. Microcirculation was analysed in different pathophysiological settings. We addressed situations with increased left ventricular mass as systemic arterial hypertension, aortic stenosis and hypertrophic cardiomyopathy. Also coronary microcirculation was studied in type 2 Diabetes and in different clinical forms of atherosclerotic coronary artery disease. Specific and detailed conclusions were withdrawn from each experimental work. In the overall it was concluded that these two techniques were important tools to easily assess specific pathophysiological information about coronary microcirculation at bed side which would be difficult to get through other techniques. When compared with gold standard techniques, similar sensibility and specificity was found. Because of their better temporal and spatial resolution it was possible to analyse the importance of transmural perfusion gradients, both in basal and during vasodilatation, and their relation to ischemia, and mechanical wall kinetics, as wall thickening and motion. Coronary microcirculation dysfunction was found in systemic arterial hypertension early evolution stages, also related to different left ventricular geometric patterns. Different etiopathogenical explanations for aortic stenosis coronary microcirculation dysfunction were analysed and compared after aortic valve replacement. Transmural myocardial perfusion heterogeneity pattern was observed in hypertrophic cardiomyopathy which was aggravated during adenosine challenge. Coronary microcirculation dysfunction was diagnosed in type 2 diabetes both with coronary artery disease and with normal angiographic coronary arteries. Dynamic transitory subendocardial perfusion defects with adenosine vasodilatation were visualized in these patients.In patients with left branch block, transthoracic Doppler echocardiography was able to suggest a coronary reserve cut-off value for risk stratification. Also it was possible with this technique to calculate coronary flow reserve and predict restenosis after PTCA Again, in an experimental animal model, applying myocardial contrast echocardiography technique it was possible to study the consequences of an atherogenic diet and statins action on the coronary microcirculation function. Because these techniques are easily performed at bed side, are harmless, use no ionizing radiation and because of their repeatability, reproducibility and accuracythey are promissory tools to assess coronary microcirculation. Both in clinic and research areas these techniques will probably have a role in clinical diagnosis, prevention and therapeutically decision.

Involvement of C4 allotypes in the pathogenesis of human diseases

The complement system is an important humoral defense mechanism that plays a relevant role against microbial agents, inflammatory response control, and immunocomplex clearance. Classical complement pathway activation is antibody-dependent. The C4 component participates in the initial step of activation, and C4 expression is determined by 2 pairs of allotypes: C4A and C4B. Deficiencies in C4 allotypes have been associated with several diseases. The aim of the present review is evaluate the reported data in the literature regarding specific C4A and C4B deficiencies and characterize their clinical relevance. We searched the MEDLINE and LILACS databases. Papers referring to total C4 deficiency without allotype evaluation and case reports of primary C4 deficiency were not included. Deficiencies in C4 allotypes have been associated with Mycobacterium leprae infection, erythema nodosum, systemic sclerosis with anti-topoisomerase I antibodies, intermediate congenital adrenal hyperplasia with DR5 genotype, diabetes mellitus type 1 with DR3,4 genotype, and diabetes mellitus with antibodies against islet cells. C4 allotype deficiency is also related to C4B deficiency and autoimmune-associated diseases, such as systemic lupus erythematosus, or diseases with an autoimmune component, such as autism. Some reports associate C4A with thyroiditis after delivery as well as limited and systemic sclerosis without anti-topoisomerase I antibodies. However, the studies with C4A and C4B have been concentrated in isolated populations, and some of the studies could not be reproduced by other authors.

New insights on nevirapine use: A mechanistic perspective of its toxic events

Introdução: A nevirapina (NVP) é um fármaco amplamente utilizado para o tratamento da infecção pelo vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (VIH-1), no entanto, a sua utilização na terapêutica crónica tem sido associada à toxicidade hepática e cutânea. O sexo feminino é um factor de risco para o desenvolvimento destes eventos tóxicos, mas as razões para essa diferença entre o sexo feminino e masculino não estão completamente esclarecidas. Diferenças na biotransformação da NVP e na formação de metabolitos tóxicos podem ser as causas subjacentes. O presente trabalho teve como objectivo explorar as diferenças entre homens e mulheres na biotransformação da NVP, como um potencial factor de toxicidade induzida por este fármaco anti-retroviral. Materiais e Métodos: Todos os indivíduos incluídos no presente estudo eram adultos com infecção por VIH-1 confirmada, tratados com 400 mg de NVP uma vez ao dia, durante pelo menos 1 mês. Foram colhidas amostras de sangue e os níveis de NVP e dos metabolitos de fase I foram determinados por cromatografia líquida de alta performance. Os dados antropométricos e clínicos e os perfis de metabolitos foram avaliados de forma a averiguar possíveis diferenças relacionadas com o sexo dos indivíduos. Resultados: Foram incluídos 52 doentes (63% do sexo masculino). O peso corporal foi inferior nas mulheres (p = 0.028) e o sexo feminino foi associado a maiores níveis de fosfatase alcalina (p = 0.036) e lactato desidrogenase (p = 0.037). Os níveis plasmáticos de NVP (p = 0.030) e 3-hidroxi-NVP (p = 0.035), assim como as proporções de 12-hidroxi-NVP (p = 0.037) e 3-hidroxi-NVP (p = 0.001) foram maiores nas mulheres, quando ajustados pelo peso corporal dos indivíduos. Discussão: Existem diferenças na biotransformação da NVP entre homens e mulheres, particularmente na formação de 12-hidroxi-NVP e 3-hidroxi-NVP. Estes resultados apontam para uma formação de metabolitos reactivos, que é dependente do sexo e que pode contribuir para o perfil de dimorfismo sexual associado às reacções tóxicas induzidas pela NVP.

The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Clinical decisions in breast cancer, a heterogenous disease

RESUMO: Introdução: Tratamento do carcinoma da mama Este trabalho inicia-se com a história do tratamento do carcinoma da mama, desde os primeiros documentos que descrevem doentes com carcinoma da mama até 1950. Desde 1950 até 2000 o diagnóstico, risco e as modalidades terapêuticas usadas no tratamento das doentes são mais detalhadas com ênfase nas terapêuticas locais, regionais e sistémicas. Parte 1:Quem tratar com terapêutica sistémica adjuvante Capítulo 1: A classificação TNM não está morta no carcinoma da mama Tem sido dito que a classificação TNM não é adequada para usar como ferramenta de prognóstico e decisão terapêutica no carcinoma da mama, especialmente em doentes com carcinoma detectado através de rastreio, que tem geralmente menores dimensões. A razão desta classificação não ser adequada prendese com o facto de não estarem incluidos parâmetros biológicos na classificação TNM atual. Pusemos a hipótese de que numa população com alta percentagem de carcinoma da mama não detectado em exames de rastreio, com uma mediana de idade baixa e com alta percentagem de estadios II e III, o estadiamento clássico, pela classificação TNM, é mais descriminatório que as características biológicas na determinação do prognóstico. Para isto analisámos uma população de doentes com carcinoma da mama tratados consecutivamente na mesma instituição, durante 10 anos. Caracterizámos os fatores de prognóstico do estadiamento clássico incluídos na classificação TNM e as variantes biológicas, presentemente não incluídas na classificação TNM. Quantificámos a capacidade de cada um dos factores de prognóstico para para prever a sobrevivência. A população é de 1699 doentes com carcinoma da mama que foram tratádos com terapêutica sistémica adjuvante. Individualmente, cada um dos fatores de prognostico, clássicos ou biológicos, diferem significativamente entre doentes que sobrevivem e que não sobrevivem. Explicitamente, como previsto, doentes com tumores maiores, envolvimento dos gânglios axilares, estadios TNM mais avançados, que não expressam recetor de esrogéneo, com amplificação do gene Her2, triplos negativos ou de menor diferenciação têm menor sobrevida. Na análise multivariada, só os fatores de prognostico da classificação TNM, o grau histológico e a amplificação do gene Her2, esta última com menos significância estatistica são preditores independentes de sobrevivência. Capítulo 2: Em busca de novos factores de prognostico: Poder preditivo e mecanismo das alterações de centrossomas em carcinoma da mama Compilámos inúmeros grupos de experiências de genómica feitas em tumores primários de doentes com carcinoma da mama para as quais existe informação prognóstica. Estas experiências são feitas com o objectivo de descobrir novos factores de prognóstico. Reanalisámos os dados, repetindo a mesma pergunta: Quais são os genes com expressão diferencial estatisticamente significativa entre doentes que recaíram e doentes que não recaíram. Identificámos 65 genes nestas condições e o MKI67, o gene que codifica a proteina Ki67, estava nesse grupo. Identificámos vários genes que se sabe estarem envolvidos no processo de agregação de centrossomas. O gene que considerámos mais promissor foi a kinesina KiFC1, que já tinha sido identificada como regulador da agregação de centrossomas. Anomalias cetrossomais numéricas e estruturais têm sido observadas em neoplasias. Há dados correlacionando anolmalias centrossomais estruturais e e numéricas com o grau de malignidade e os eventos precoces da carcinogénese. Mas estas anomalias centrossomais têm um peso para a célula que deve adapatar-se ou entrará em apoptose. Os nossos resultados sugerem que existe um mecanismo adaptativo, a agregação de centrossomas, com impacto prognóstico negativo. O nosso objetivo foi quantificar o valor prognóstico das anomalias centrossomais no carcinoma da mama. Para isto usámos material de doentes dos quais sabemos a história natural. Avaliámos os genes de agregação de centrossomas, KIFC1 e TACC3, nas amostras tumorais arquivadas em parafina: primeiro com PCR (polymerase chain reaction) quantitativa e depois com imunohistoquímica (IHQ). Apenas a proteína KIFC1 foi discriminatória em IHQ, não se tendo conseguido otimizar o anticorpo da TACC3. Os níveis proteicos de KIFC1 correlacionam-se com mau prognóstico. Nas doentes que recaíram observámos, no tumor primário, maior abundância desta proteína com localização nuclear. Em seguida, demonstrámos que a agregação de centrossomas é um fenómeno que ocorre in vivo. Identificámos centrossomas agregados em amostras de tumores primários de doentes que recaíram. Tecnicamente usámos microscopia de fluorescência e IHQ contra proteínas centrossomais que avaliámos nos tumores primários arquivados em blocos de parafina. Observámos agregação de centrossomas num pequeno número de doentes que recaíram, não validámos, ainda, este fenótipo celular em larga escala. Parte 2: Como tratar com terapêutica sistémica os vários subtipos de carcinoma da mama Capítulo 3: Quantas doenças estão englobadas na definição carcinoma da mama triplo negativo? (revisão) O carcinoma da mama triplo negativo é um tumor que não expressa três proteínas: recetor de estrogénio, recetor de progesterona e o recetor do fator de crescimento epidermico tipo 2 (Her2). As doentes com estes tumores não são ainda tratadas com terapêutica dirigida, possivelmente porque esta definição negativa não tem ajudado. Sabemos apenas as alterações genéticas que estes tumores não têm, não as que eles têm. Talvez por esta razão, estes tumores são o subtipo mais agressivo de carcinoma da mama. No entanto, na prática clínica observamos que estas doentes não têm sempre mau prognóstico, além de que dados de histopatologia e epidemiologia sugerem que esta definição negativa não está a capturar um único subtipo de carcinoma da mama, mas vários. Avaliámos criticamente esta evidência, clínica, histopatológica, epidemiológica e molecular. Há evidência de heterogeneidade, mas não é claro quantos subtipos estão englobados nesta definição de carcinoma da mama triplo negativo. A resposta a esta pergunta, e a identificação do fundamento molecular desta heterogeneidade vai ajudar a melhor definir o prognóstico e eventualmente a definir novos alvos terapêuticos nesta população difícil. Capítulo 4: Terapêuica sistémica em carcinoma da mama triplo negativo (revisão) A quimioterapia é a única terapêutica sistémica disponível para as doentes com carcinoma da mama triplo negativo, ao contrário dos outros dois subtipo de carcinoma da mama que têm com a terapêutica antiestrogénica e anti Her2, importantes benefícios. Apesar de terem surgido várias opções terapêuticas para estes doentes nennhuma terapêutica dirigida foi validada pelos ensaios clínicos conduzidos, possivelmente porque a biologia deste carcinoma ainda não foi elucidada. Muitos ensaios demonstram que os tumores triplos negativos beneficiam com quimioterapia e que as mais altas taxas de resposta patológica completa à terapêutica neoadjuvante são observadas precisamente nestes tumors. A resposta patológica completa correlaciona-se com a sobrevivência. Estamos a estudar regimes adjuvantes específicos para doentes com estes tumors, mas, neste momento, regimes de terceira geração com taxanos e antraciclinas são os mais promissores. O papel de subgrupos de fármacos específicos, como os sais de platina, mantémse mal definido. Quanto às antraciclinas e taxanos, estes grupos não mostraram beneficio específico em carcinoma da mama triplo negativo quando comparado com os outros subtipos. Os próprios carcinomas da mama triplos negativos são heterogéneos e carcinomas da mama basais triplos negativos com elevada taxa de proliferação e carcinomas da mama triplos negativos surgidos em doentes com mutação germinal BRCA1 poderão ser mais sensíveis a sais de platino e menos sensíveis a taxanos. Como a definição molecular ainda não foi explicada a busca de terapêutica dirigida vai continuar. Capítulo 5: Ensaio randomizado de fase II do anticorpo monoclonal contra o recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 combinado com cisplatino versus cisplatino em monoterapia em doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado O recetor do fator de crescimento epidérmico tipo 1 está sobre expresso nos tumores das doentes com carcinoma da mama triplo negativo metastizado, um subtipo agressivo de carcinoma da mama. Este ensaio investigou a combinação de cetuximab e cisplatino versus cisplatino isolado em doentes deste tipo. Doentes em primeira ou segunda linha de terapêutica para doença metastizada foram randomizadas, num sistema de 2 para 1, para receber até 6 ciclos da combinação de cisplatino e cetuximab ou cisplatino isolado. Às doentes randomizadas para o braço de monoterapia podiamos, após progressão, acrescentar cetuximab ou tratá-las com cetuximab isolado. O objetivo primário foi a taxa de resposta global. Os objetivos secundários foram a sobrevivência livre de doença, a sobrevivência global e o perfil de segurança dos fármacos. A população em análise foram 115 doentes tratadas com a combinação e 58 doentes tratadas com cisplatino em monoterapia, 31 destas em quem se documentou progressão passaram a ser tratadas com um regime que incluía cetuximab, isolado ou em combinação. A taxa de resposta global foi de 20% no braço da combinaçao e de 10% no braço da monoterapia (odds ratio, 2.13). A sobrevivência livre de doença foi de 3.7 meses no braço da combinação e de 1.5 meses no braço em monoterapia (hazard ratio, 0.67). A sobrevivência global foi de 12.9 meses no braço da combinação versus 9.4 meses no braço de cisplatino. Conclui-se que, apesar de não ter sido alcançado o objectivo primário, acrescentar cetuximab, duplica a resposta e prolonga tanto a sobrevivência livre de doença como a sobrevivência global. Capítulo 6: Bloquear a angiogénese para tratar o carcinoma da mama (revisão) A angiogénese é uma característica que define a neoplasia, porque tumores com mais de 1mm precisam de formar novos vasos para poderem crescer. Desde que se descobriram as moléculas que orquestram esta transformação, que se têm procurado desenvolver e testar fármacos que interfiram com este processo. No carcinoma da mama o bevacizumab foi o primeiro fármaco aprovado pela FDA em primeira linha para tratar doença metastática. Depois foram estudados um grupo de inibidores de tirosina cinase associados aos recetores transmembranares envolvidos na angiogénese como o VEGFR, PDGFR, KIT, RET, BRAF e Flt3: sunitinib, sorafenib, pazopanib e axitinib Neste capítulo, analisaram-se e resumiram-se os dados dos ensaios clínicos das drogas anti-angiogénicas no tratamaneto do carcinoma da mama. Os ensaios de fase III do bevacizumab em carcinoma da mama mostraram uma redução na progressão de doença de 22 a 52% e aumento da sobrevivência livre de doença de 1.2 a 5.5 meses mas nunca foi demonstrado prolongamento de sobrevivência. Os ensaios de fase III em carcinoma da mama adjuvante com bevacizumab são dois e foram ambos negativos. O ensaio de fase III com o inibidor da tirosina cinase, sunitinib foi negativo, enquanto que os ensaios de fase II com os inibidores da tirosina cinase sorafenib e pazopanib melhoraram alguns indicadores de resposta e sobrevivência. A endostatina foi testada no contexto neoadjuvante com antraciclinas e melhorou a taxa de resposta, mas, mais ensaios são necessários para estabelecer este fármaco. A maioria dos ensaios clínicos dos agentes antiangiogénicos em carcinoma da mama reportaram aumento da taxa de resposta e de sobrevivência livre de doença mas nunca aumento da sobrevivência global quando comparado com quimioterapia isolada o que levou ao cepticismo a que assistimos atualmente em relação ao bloqueio da angiogénese. Ensaios clínicos selecionados em doentes específicas com objetivos translacionais relacionados com material biológico colhido, preferefencialmente em diferentes intervalos da terapêutica, serão cruciais para o bloqueio da angiogénese sobreviver como estratégia terapêutica em carcinoma da mama. Capítulo 7: A resposta à hipoxia medeia a resistência primária ao sunitinib em carcinoma da mama localmente avançado O sunitinib é um fármaco antiangiogénico que nunca foi avaliado isolado em doentes com carcinoma da mama não tratadas. O nosso objetivo foi caracaterizar a atividade do sunitinib isolado e em combinação com o docetaxel em carcinoma da mama não tratado, localmente avançado ou operável, mas de dimensão superior a 2 cm, para compreender os mecanismos de resposta. Doze doentes foram tratadas com duas semanas iniciais de sunitinib seguido de quatro ciclos de combinação de sunitinib e docetaxel. A resposta, a reistência e a toxicidade foram avaliadas de acordo com parametros clínicos, ressonância magnética nuclear, tomografia de emissão de positrões, histopatologia e perfis de expressão genómica. Detetámos resistência primária ao sunitinib na janela inicial de duas semanas, evidenciada em quatro doentes que não responderam. À data da cirurgia, cinco doentes tinham tumor viável na mama e axila, quatro tinahm tumor viável na mama e três foram retiradas do ensaio. Não houve respostas patológicas completas. A comparação dos perfis de expressão genómica entre os respondedores e os não respondedores, aos quinze dias iniciais, permitiu-nos identificar sobre expressão de VEGF e outras vias angiogénicas nos não respondedores. Especificamente, em tumores resistentes ao sunitinib isolado detectámos uma resposta transcricional à hipoxia caracterizada por sobre expressão de vários dos genes alvo do HIF1α. Neste ensaio de sunitinib isolado em doentes não tratadas com carcinoma da mama localmente avançado, encontrámos evidência molecular de resistência primária ao sunitinib possivelmente mediada por sobre expressão de genes que respondem à hipoxia. Parte 3: Quando parar a terapêutica sistémica às doentes com carcinoma da mama Capítulo 8: Agressividade terapêutica ns últimos três meses de vida num estudo retrospetivo dum centro único Incluímos todos os adultos que morreram com tumores sólidos na instituição em 2003 e foram tratados com quimioterapia para tratar neoplaias metastizadas. Colhemos dados detalhados relacionados com quimioterapia e toxicidade nos últimos três meses de vida a partir do processo clínico. Trezentas e dezanove doentes foram incluídos, a mediana de idade foi 61 anos. A mediana de sobrevivência de doença metastática foi de 11 meses. 66% (211) dos doentes foram tratados com QT nos últimos 3 meses de vida, 37% foram tratados com QT no úlimo mês de vida e 21% nas últimas duas semanas. Nos doentes que foram tratados com QT nos últimos três meses de vida, 50% começaram um novo regime terapêutico neste período e 14% começaram um novo regime no último mês. Identificámos como determinantes de tratamento com QT no fim de vida a idade jovem, o carcinoma da mama, do ovário e do pâncreas. Concluímos que administrámos QT no fim de vida frequentemente e iniciámos novos regimes terapêuticos no último mês de vida em 14% dos casos. Precisamos de aprofundar este trabalho para compreender se esta atitude agressiva resulta em melhor paliação de sintomas e qualidade de vida no fim de vida dos doentes com neoplasias disseminadas. Capítulo 9: O tratamento do carcinoma da mama no fim de vida está a mudar? Quisémos caracterizar a modificação da tendência no uso de QT e de estratégias paliativas no fim de vida das doentes com carcinoma da mama em diferentes instituições e em intervalos de tempo diferentes. Para isto selecionámos doentes que morreram de carcinoma da mama durante 6 anos, entre 2007 e 2012, num hospital geral e comparámos com as doentes que morreram de carcinoma da mama em 2003 num centro oncológico. Avaliámos um total de 232 doentes. O grupo mais recente tem 114 doentes e o grupo anterior tem 118 doentes. Usámos estatística descritiva para caracterizar QT no fim de vida e o uso de estratégias paliativas. Ambas as coortes são comparáveis em termos das características do carcinoma da mama. Observámos aumento do uso de estatégias paliativas: consulta da dor, consulta de cuidados paliativos e radioterapia paliativa no cuidado das doentes com carcinoma da mama metastizado. Evidenciámos aumento do número de mortes em serviços de cuidados paliativos. No entanto, a QT paliativa continua a ser prolongada até aos últimos meses de vida, embora tenhamos mostrado uma diminuição desta prática. Outros indicadores de agressividade como a admissão hospitalar também mostraram diminuição. Confirmámos a nossa hipótese de que há maior integração da medicina paliativa multidisciplinar e menos agressividade na terapêutica sistémica das doentes com carcinoma da mama nos últimos meses de vida. Chapter 10: Porque é que os nossos doentes são tratados com quimioterapia até ao fim da vida? (editorial) Este capítulo começa por dar o exmeplo duma jovem de 22 anos que viveu três meses após começar QT paliatva. Este caso epitomiza a futilidade terapêutica e é usado como ponto de partida para explorar as razões pelas quais administramos QT no fim de vida aos doentes quando é inútil, tóxica, logisticamente complexa e cara. Será que estamos a prescrever QT até tarde demais? Os oncologistas fazem previsões excessivamente otimistas e têm uma atitude pró terapêutica excessiva e são criticados por outros intervenientes nas instituições de saúde por isto. Crescentemente doentes, familiares, associações de doentes, definidores de políticas de saúde, jornalistas e a sociedade em geral afloram este tema mas tornam-se inconsistentes quando se trata dum doente próximo em que se modifica o discurso para que se façam terapêuticas sitémicas agressivas. Há uma crescente cultura de preservação da qualidade de vida, paliação, abordagem sintomática, referenciação a unidades de cuidados paliativos e outros temas do fim de vida dos doentes oncológicos terminais. Infelizmente, este tema tem ganhado momentum não porque os oncologistas estejam a refletir criticamente sobre a sua prática, mas porque os custos dos cuidados de saúde são crescentes e incomportáveis. Seja qual fôr o motivo, as razões que levam os oncologistas a administrar QT no fim de vida devem ser criticamente elucidadas. Mas há poucos dados para nos guiar nesta fase delicada da vida dos doentes e os que existem são por vezes irreconciliáveis, é uma revisão destes dados que foi feita neste capítulo. Conclusão: A abordagem do carcinoma da mama no futuro? Na conclusão, tenta-se olhar para o futuro e prever como será a tomada a cargo dum doente com carcioma da mama amanhã. Faz-se uma avaliação das várias àreas desde prevenção, rastreio, suscetibilidade genética e comportamental e terapêutica. Na terapêutica separa-se a terapêutica locoregional, sistémica adjuvante e da doença metastizada. Nos três últimos parágrafos a história duma mulher com um carcinoma localmente avançado que sobre expressa o recetor Her2, serve como ilustração de como devemos estar preparados para incorporar evolução, heterogeneidade e dinamismo no cuidado de doentes com carcinoma da mama. -------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Introduction: Breast cancer care in the past This work starts with an overview of the treatment of breast cancer (BC). From the first reports of patients ill with BC until 1950. From 1950 until 2000, there is a more detailed account on how BC patients were treated with emphasis on the different modalities, local, regional and systemic treatments and their evolution. Part 1: Who to treat with adjuvant systemic therapy? Chapter 1: TNM is not dead in breast cancer It has been said that the current TNM staging system might not be suitable for predicting breast cancer (BC) outcomes and for making therapeutic decisions, especially for patients with screen detected BC which is smaller. The reason for this is also due to the non inclusion of tumor biology parameters in the current TNM system. We hypothesize that in a population where there is still a large abundance of non screen detected BC, with a low median age of incidence and abundance of high TNM staged lesions, biology is still second to classical staging in predicting prognosis. We analyzed a population of consecutive BC patients from a single institution during ten years. We characterized current established prognostic factors, classical staging variables included in the current TNM staging system and biological variables, currently not included in the TNM system. We quantified the capacity of individual prognostic factors to predict survival. We analyzed a population of 1699 consecutive BC patients. We found that individually both the TNM system prognostic factors and the biological prognostic factors are differing among BC survivors and dead patients in a statistically significant distribution. Explicitly, patients with larger tumors, positive nodes, higher stage lesions, ER negative, HER2 positive, TN or lower differentiation tumors show decreased survival. In the multivariate analysis we can conclude that in a population such as ours classical TNM staging variables, irrespective of tumor biological features, are still the most powerful outcome predictors. Chapter 2: Defining breast cancer prognosis: The predictive power and mechanism of centrosome alterations in breast cancer We performed a systematic analysis of the literature and compiled an extensive data set of gene expression data originated in primary tumours of BC patients with prognostic information. We analysed this data seeking for genes consistently up or down regulated in poor prognosis BC, i.e. that relapsed after initial treatment. In the course this bioinformatics analysis our lab identified 65 genes statistically significant across multiple datasets that can discriminate between relapsed and non-relapsed BC patients. Among the identified genes, we have detected genes such as MKI67, a marker of mitotic activity which is routinely used in the clinic. Unexpectedly, we also discovered several genes found to be involved in centrosome clustering, The most prominent of these is the kinesin KIFC1, also called HSET, and previously identified as regulator of centrosome clustering. Centrosome abnormalities (numerical, structural) have been observed in cancer. Indeed, compelling data has shown that cells from many cancers have multiple and abnormal centrosomes, that are either correlated with tumour malignancy or considered an early tumorigenesis event. However, extra centrosomes come at a cost and cells must be able to handle such abnormalities or otherwise die. Thus our results suggested a new mechanism of breast cancer progression with negative prognostic value. We aimed at quantifying the predictive power of centrosome clustering in BC clinical setting and at detecting this process in BC patient material. We validated the centrosome clustering genes KIFC1 and TACC3 in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) BC patient material, using quantitative real-time PCR (RT-qPCR) technology. Our results indicate that the tested KIFC1 has a clear IHC signal (1) and that the protein expression patterns and levels correlate with prognosis, with relapsing patients having increased expression and nuclear localisation of this kinesin (2). Next we were able to show that centrosome clustering does occur in vivo. We identified centrosome amplification and clustering in breast cancer samples, and we established a fluorescence microscopy-based IHC approach by staining FFPE samples with centrosomal markers. Using this approach we have observed centrosome amplification and clustering in a small set of poor prognosis samples. By expanding the number of samples in which we have characterised the number of centrosomes, we were able to confirm our preliminary observation that centrosomes are clustered in relapsed BC. Part 2: How to treat breast cancer subtypes? Chapter 3: How many diseases is triple negative breast cancer? (review) Triple negative breast cancer is a subtype of breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor and the epidermal growth factor receptor type 2 (Her2). These tumors are not yet treated with targeted therapies probably because no positive markers have been described to reliably classify them - they are described for what they are not. Perhaps for this reason, they are among the most aggressive of breast carcinomas, albeit with very heterogenous clinical behavior. The clinical observation that these patients do not carry a uniformly dismal prognosis, coupled with data coming from pathology and epidemiology, suggests that this negative definition is not capturing a single clinical entity, but several. We critically evaluate this evidence in this paper, reviewing clinical and epidemiological data, as well as molecular data. There is evidence for heterogeneity, but it is not clear how many diseases are grouped into triple negative breast cancer. Answering this question, and identifying the molecular basis of heterogeneity will help define prognosis and, eventually, the identification of new targeted therapies. Chapter 4: Systemic treatment for triple negative breast cancer (review) Chemotherapy remains the backbone of treatment for triple negative breast cancer (TNBC). Despite the appearance of new targeted and biologic agents there has been no targeted therapy validated for TNBC, possibly because the biology of TNBC has not been conclusively elucidated. Many studies have shown that TNBC derive significant benefit of chemotherapy in the neoadjuvant, adjuvant and metastatic treatment, possibly more benefit than other BC subtypes. Neoadjuvant chemotherapy studies have repeatedly shown higher response rates in TNBC than non-TNBC. Pathologic complete response has been shown to predict improved long term outcomes in BC. Although specific adjuvant regimens for TNBC are under study, third generation chemotherapy regimens utilizing dose dense or metronomic polychemotherapy are among the most effective tools presently available. The role of specific chemotherapy agents, namely platinum salts, in the treatment of TNBC remains undefined. Taxanes and anthracyclines are active in TNBC and remain important agents, but have not shown specific benefit over non-TNBC. TNBC is itself a heterogeneous group in which subgroups like basal like BC defined by higher proliferation and including those TNBC arising in BRCA1 mutation carriers may be more sensitive to platinum agents and relatively less sensitive to taxanes. The molecular characterization of TNBC is lacking and therefore the search for targeted therapy is still ongoing. Chapter 5: Randomized phase II study of the anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody cetuximab with cisplatin versus cisplatin alone in patients with metastatic triple-negative breast cancer Epidermal growth factor receptor is overexpressed in metastatic triple-negative breast cancers, an aggressive subtype of breast cancer. Our randomized phase II study investigated cisplatin with or without cetuximab in this setting. Patients who had received no more than one previous chemotherapy regimen were randomly assigned on a 2:1 schedule to receive no more than six cycles of cisplatin plus cetuximab or cisplatin alone. Patients receiving cisplatin alone could switch to cisplatin plus cetuximab or cetuximab alone on disease progression. The primary end point was overall response rate (ORR). Secondary end points studied included progressionfree survival (PFS), overall survival (OS), and safety profiles. The full analysis set comprised 115 patients receiving cisplatin plus cetuximab and 58 receiving cisplatin alone; 31 patients whose disease progressed on cisplatin alone switched to cetuximab-containing therapy. The ORR was 20% with cisplatin plus cetuximab and 10% with cisplatin alone (odds ratio, 2.13). Cisplatin plus cetuximab resulted in longer PFS compared with cisplatin alone (median, 3.7 v 1.5 months; hazard ratio, 0.67. Corresponding median OS was 12.9 versus 9.4 months. While the primary study end point was not met, adding cetuximab to cisplatin doubled the ORR and appeared to prolong PFS and OS, warranting further investigation in mTNBC. Chapter 6: Blocking angiogenesis to treat breast cancer (review) Angiogenesis is a hallmark of cancer because tumors larger than 1mm need new vessels to sustain their growth. Since the discovery of the molecular players of this process and some inhibitors, that angiogenesis became a promising therapeutic target. Bevacizumab was the first molecular-targeted antiangiogenic therapy approved by the FDA and is used as first-line therapy in metastatic breast cancer. A second class of approved inhibitors (sunitinib, sorafenib, pazopanib and axitinib) include oral small-molecule tyrosine kinase inhibitors that target vascular endothelial growth factor receptors, platelet-derived growth factor receptors, and other kinases including KIT, Ret, BRAF and Flt-3, but none of these have gained approval to treat breast cancer. This review analyzes and summarizes data from clinical trials of anti-angiogenic agents in the treatment of BC. Phase III trials of bevacizumab in advanced BC have demonstrated a reduction in disease progression (22–52%), increased response rates and improvements in progression-free survival of 1.2 to 5.5 months, but no improvements in OS. Bevacizumab phase III trials in early BC have both been negative. Bevacizumab combined with chemotherapy is associated with more adverse events. Phase III trials of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib were negative, while randomized phase II trials of sorafenib and pazopanib have improved some outcomes. Endostatin has been tested in neoadjuvant clinical trials in combination with anthracyclinebased chemotherapy in treatment-naive patients and has increased the clinical response rate, but more trials are needed to establish this drug. Most trials of anti-angiogenic agents in BC have reported improved RR and PFS but no increase in OS compared to chemotherapy alone, leading to skepticism towards blocking angiogenesis. Selected trials in selected BC populations with translational endpoints related to harvested tumor tissue and other biological material samples, preferentially at several timepoints, will be crucial if antiangiogenesis is to survive as a strategy to treat BC. Chapter 7: Does hypoxic response mediate primary resistance to sunitinib in untreated locally advanced breast cancer? The antiangiogenic drug sunitinib has never been evaluated as single agent in untreated BC patients. We aimed to characterize the activity of sunitinib, alone and with docetaxel, in untreated locally advanced or operable BC, and, to uncover the mechanisms of response. Twelve patients were treated with an upfront window of sunitinib followed by four cycles of sunitinib plus docetaxel. Response, resistance and toxicity were evaluated according to standard clinical parameters, magnetic resonance imaging, positron emission tomography, pathology characterization and gene expression profiling. We detected primary resistance to sunitinib upfront window in untreated BC, as evidenced by four non-responding patients. At surgery, five patients had viable disease in the breast and axilla, four had viable tumor cells in the breast alone and three were taken off study due to unacceptable toxicity and thus not evaluated. Early functional imaging was useful in predicting response. There were no pathologic complete responses (pCR). Comparison of gene expression profiling tumor data between early responders and non-responders allowed us to identify upregulation of VEGF and angiogenic pathways in non responders. Specifically, in tumors resistant to the single-agent sunitinib we detected a transcriptional response to hypoxia characterized by over-expression of several HIF1α target genes. In this report of single-agent sunitinib treatment of untreated localized BC patients, we found molecular evidence of primary resistance to sunitinib likely mediated by up-regulation of hypoxia responsive genes. Part 3: When to stop systemic treatment of breast cancer patients? Chapter 8: The aggressiveness of cancer care in the last three months of life: a retrospective single centre analysis. All adult patients with solid tumors who died in our hospital in 2003 and received chemotherapy for advanced cancer, were included. Detailed data concerning chemotherapy and toxicity, in the last three months of life, were collected from patientsʼ clinical charts. A total of 319 patients were included. Median age was 61 years. Median time from diagnosis of metastatic disease to death was 11 months. The proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life was 66% (n=211), in the last month 37% and in the last two weeks 21%. Among patients who received chemotherapy in the last three months of life, 50% started a new chemotherapy regimen in this period and 14% in the last month. There was an increased probability of receiving chemotherapy in the last three months of life in younger patients and in patients with breast, ovarian and pancreatic carcinomas. There was a large proportion of patients who received chemotherapy in the last three months of life, including initiation of a new regimen within the last 30 days. Thus, further study is needed to evaluate if such aggressive attitude results in better palliation of symptoms at the end of life. Chapter 9: Is breast cancer treatment in the end of life changing? We aimed to characterize the shifting trends in use of anti-cancer chemotherapy and palliative care approaches in the end of life of BC patients in different institutions and times. For this, we selected women that died of BC during six years, from 2007 to 2012, and were treated in a central acute care general hospital and compared it with the BC patients that died in 2003 and were treated in a large cancer center. We analyzed a total of 232 patients: the more recent group has 114 women and the older cohort has 118. We used descriptive statistics to characterize CT in the EoL and use of palliative care resources. Both populations were similar in terms of BC characteristics. We observed more palliative care resources, pain clinic, palliative care teams and palliative radiotherapy, involved in the care of MBC patients and a shift towards more deaths at hospices. Systemic anti cancer treatments continue to be prolonged until very late in patients’ lives, notwithstanding, we could show a decrease in the use of such treatments. Other indicators of aggressiveness, namely hospital admissions, also show a decrease. We confirmed our hypothesis that there is more integration of multidisciplinary palliative care and less aggressiveness in the treatment of metastatic cancer patients, specifically, use of palliative anti-cancer treatment and hospital admissions. Nonetheless, we use systemic therapy until too late with underutilization of palliative medicine. Chapter 10: Why do our patients get chemotherapy until the end of life? (editorial) The editorial starts with a clinical case of a 21 year old patient that lives three months after starting palliative chemotherapy for the first time, a case that illustrates therapeutic futility at the end of life. Why are we not ceasing chemotherapy when it is useless, toxic, logistically complex and expensive? Are we prescribing chemotherapy until too late in solid tumor patientsʼ lives? Medical oncologists have overly optimistic predictions and, excessive, treatment-prone attitude and they are criticized by other health care providers for this. Increasingly, patients, their families, advocacy groups, policy makers, journalists and society at large dwell on this topic, which is a perplexing conundrum, because sometimes they are the ones demanding not to stop aggressive systemic anticancer treatments, when it comes to their loved ones. There is a growing culture of awareness toward preserving quality of life, palliative care, symptom-directed care, hospice referral and end of life issues regarding terminal cancer patients. Sadly, this issue is gaining momentum, not because oncologists are questioning their practice but because health care costs are soaring. Whatever the motive, the reasons for administering chemotherapy at the end of life should be known. There are few and conflicting scientific data to guide treatments in this delicate setting and we review this evidence in this paper. Conclusion: What is the future of breast cancer care? This work ends with a view into the future of BC care. Looking into the different areas from prevention, screening, hereditary BC, local, regional and systemic treatments of adjuvant and metastatic patients. The last three paragraphs are a final comment where the story of a patient with Her2 positive locally advanced breast cancer is used as paradigm of evolution, heterogeneity and dynamism in the management of BC.

Biochemical and physical surface functionalization of polycaprolactone as a key mediator of osteogenic differentiation and vascularized tissue morphogenesis

Tese de Doutoramento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células Estaminais.

Diferença de letalidade hospitalar do infarto agudo do miocárdio entre homens e mulheres submetidos a angioplastia primária

OBJETIVO: Comparar a letalidade hospitalar (LH) de homens e mulheres submetidos a angioplastia transluminal coronária primária (ATCP) como estratégia de reperfusão no infarto agudo do miocárdio (IAM). MÉTODOS: Estudo de coorte retrospectivo baseado em informações de prontuários médicos de pacientes hospitalizados devido a IAM em hospital de referência para doença coronária, utilizando preferencialmente a ATCP como técnica de reperfusão miocárdica precoce. Foram incluídos 83 pacientes, 35 (42%) mulheres e 48 (58%) homens, que preencheram critérios para reperfusão miocárdica precoce. RESULTADOS: A média de idade das mulheres foi superior a dos homens (66±10 vs 58±11 anos; p<0,001). As mulheres também apresentaram uma maior freqüência de diabetes mellitus (37,1% vs 6,4%; p<0,001). Apesar destas diferenças na idade e na freqüência de diabetes mellitus, os percentuais de pacientes em que a ATCP foi considerada sucesso foram similares entre homens (83,3%) e mulheres (82,3%). A LH foi também bastante semelhante entre homens e mulheres; 14,6% vs 14,3%, respectivamente. CONCLUSÃO: A possibilidade de que o excesso de risco de morrer entre as mulheres com IAM em relação aos homens possa ser reduzido ou até eliminado com o uso da ATCP apóia a necessidade de que se desenvolva um ensaio clínico a fim de avaliar esta questão.

Some predictors of cardiovascular mortality among the elderly population of Botucatu (SP)

OBJECTIVE: To detect factors associated with cardiovascular mortality in the elderly of Botucatu. METHODS: We evaluated 29 variables of interest in a cohort of patients aged ³60 using data from a survey conducted between 1983/84. The elderly cohort was analyzed in 1992 to detect the occurrence of cardiovascular deaths. Survival analysis was performed using the Kaplan-Meier method, the log-rank test, and Cox regression analysis. Three models were adapted for each group of variables, and a final model was chosen from those variables selected from each group. RESULTS: We identified predictor for cardiovascular death according to age for elderly males not supporting the family, not possessing a vehicle, and previous cardiovascular disease. In elderly females, the predictor variables were previous cardiovascular disease and diabetes mellitus. CONCLUSION: Socioeconomic indicators (family heading and vehicle ownerrship) may be added to well stabilished medical factors (diabete mellitus and hypertension to select target groups for programs intended to reduce deaths due to cardiovascular diseases in elderly people.