Sistemas bacterianos no estudo da bioactivação do antirectroviral nevirapina

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

O antirectroviral Nevirapina (NVP) é um inibidor não nucleosídico da transcriptase reversa (INNTR) aplicado contra infecções pelo vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), cuja utilização é principalmente limitada pela hepatotoxicidade severa e erupções cutâneas associadas. Embora o mecanismo exacto da toxicidade de NVP não seja completamente conhecido, estudos prévios sugeriram que a bioactivação de NVP possa ocorrer por hidroxilação a 12-hidroxi-NVP, e subsequente sulfatação, levando à formação de electrófilos altamente reactivos. Para estudar esta via de bioactivação, inicialmente, construiu-se uma nova estirpe teste de mutagenicidade de Escherichia coli, BTC2A6_SULT1A1_POR, expressando as enzimas da biotransformação humana, citocromo P450 2A6 (CYP2A6) e sulfotransferase 1A1 (SULT1A1). Contudo, utilizando o pro-mutagénio 1-metilpireno, não foi possível validar esta estirpe. Várias razões para a sua insensibilidade foram consideradas: procedimento experimental não optimizado, insensibilidade do alvo genético, e níveis limitados de PAPS, cofactor de SULT1A1. Para estudar estas hipóteses, desenvolveram-se novas estirpes teste, expressando somente SULT1A1 humana, derivadas de estirpes de Ames (S.typhimurium TA1535_pLCMSULT1A1 e TA1538_pLCMSULT1A1) e de E. coli (BTC_SULT1A1). Para verificar os níveis limitados de PAPS, construíram-se as estirpes TA1535_pLCMSULT1A1_cys e TA1538_pLCMSULT1A1_cys, as quais sobre-expressam o operão cysDNC bacteriano, codificante de enzimas da biossíntese de PAPS. A optimização das condições de cultura e do procedimento do ensaio permitiram respostas mutagénicas elevadas, em particular com estirpes sobre-expressando cysDNC, utilizando furfuril álcool (estirpes derivadas de TA1535) e 1-hidroximetilpireno (estirpes derivadas de TA1538), pro-mutagénios bioactivados por SULT1A1. As novas estirpes de S. typhimurium foram testadas com 12-hidroxi-NVP, mostrando mutagenicidade substancial, em particular a estirpe TA1538-cysDNC. Estes resultados sugerem que o metabolismo de NVP a 12-hidroxi-NVP, e subsequente sulfo-esterificação, seja um factor determinante na mutagenicidade de NVP, potencialmente implicado na carcinogenicidade de NVP observada em roedores. Esta via de bioactivação pode ser responsável pela reactividade de NVP com vários alvos, causando hepatotoxicidade severa e erupções cutâneas.