Progettazione e implementazione di un sistema dinamico per la gestione del packet filtering

Un livello di sicurezza che prevede l’autenticazione e autorizzazione di un utente e che permette di tenere traccia di tutte le operazioni effettuate, non esclude una rete dall’essere soggetta a incidenti informatici, che possono derivare da tentativi di accesso agli host tramite innalzamento illecito di privilegi o dai classici programmi malevoli come virus, trojan e worm. Un rimedio per identificare eventuali minacce prevede l’utilizzo di un dispositivo IDS (Intrusion Detection System) con il compito di analizzare il traffico e confrontarlo con una serie d’impronte che fanno riferimento a scenari d’intrusioni conosciute. Anche con elevate capacità di elaborazione dell’hardware, le risorse potrebbero non essere sufficienti a garantire un corretto funzionamento del servizio sull’intero traffico che attraversa una rete. L'obiettivo di questa tesi consiste nella creazione di un’applicazione con lo scopo di eseguire un’analisi preventiva, in modo da alleggerire la mole di dati da sottoporre all’IDS nella fase di scansione vera e propria del traffico. Per fare questo vengono sfruttate le statistiche calcolate su dei dati forniti direttamente dagli apparati di rete, cercando di identificare del traffico che utilizza dei protocolli noti e quindi giudicabile non pericoloso con una buona probabilità.

Costrutti ed Applicazioni di Programmazione Generica in Linguaggi Object-Oriented

Generic programming is likely to become a new challenge for a critical mass of developers. Therefore, it is crucial to refine the support for generic programming in mainstream Object-Oriented languages — both at the design and at the implementation level — as well as to suggest novel ways to exploit the additional degree of expressiveness made available by genericity. This study is meant to provide a contribution towards bringing Java genericity to a more mature stage with respect to mainstream programming practice, by increasing the effectiveness of its implementation, and by revealing its full expressive power in real world scenario. With respect to the current research setting, the main contribution of the thesis is twofold. First, we propose a revised implementation for Java generics that greatly increases the expressiveness of the Java platform by adding reification support for generic types. Secondly, we show how Java genericity can be leveraged in a real world case-study in the context of the multi-paradigm language integration. Several approaches have been proposed in order to overcome the lack of reification of generic types in the Java programming language. Existing approaches tackle the problem of reification of generic types by defining new translation techniques which would allow for a runtime representation of generics and wildcards. Unfortunately most approaches suffer from several problems: heterogeneous translations are known to be problematic when considering reification of generic methods and wildcards. On the other hand, more sophisticated techniques requiring changes in the Java runtime, supports reified generics through a true language extension (where clauses) so that backward compatibility is compromised. In this thesis we develop a sophisticated type-passing technique for addressing the problem of reification of generic types in the Java programming language; this approach — first pioneered by the so called EGO translator — is here turned into a full-blown solution which reifies generic types inside the Java Virtual Machine (JVM) itself, thus overcoming both performance penalties and compatibility issues of the original EGO translator. Java-Prolog integration Integrating Object-Oriented and declarative programming has been the subject of several researches and corresponding technologies. Such proposals come in two flavours, either attempting at joining the two paradigms, or simply providing an interface library for accessing Prolog declarative features from a mainstream Object-Oriented languages such as Java. Both solutions have however drawbacks: in the case of hybrid languages featuring both Object-Oriented and logic traits, such resulting language is typically too complex, thus making mainstream application development an harder task; in the case of library-based integration approaches there is no true language integration, and some “boilerplate code” has to be implemented to fix the paradigm mismatch. In this thesis we develop a framework called PatJ which promotes seamless exploitation of Prolog programming in Java. A sophisticated usage of generics/wildcards allows to define a precise mapping between Object-Oriented and declarative features. PatJ defines a hierarchy of classes where the bidirectional semantics of Prolog terms is modelled directly at the level of the Java generic type-system.

Studio dei profili di espressione dei microRNA nell'epatocarcinoma umano

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il più frequente tumore maligno del fegato e rappresenta il sesto tipo di tumore più comune nel mondo. Spesso i pazienti con HCC vengono diagnosticati a stadi piuttosto avanzati, quando le uniche opzioni terapeutiche in grado di migliorarne la sopravvivenza sono la chemoembolizzazione dell'arteria epatica ed il trattamento con l'inibitore multi-cinasico, Sorafenib. In questo contesto, la scoperta del ruolo centrale dei microRNA (miRNA) nella tumorigenesi umana risulta di fondamentale importanza per lo sviluppo di nuovi marcatori diagnostici e bersagli terapeutici. I microRNA (miRNA) sono delle piccole molecole di RNA non codificante, della lunghezza di 19-22 nucleotidi, filogeneticamente molto conservati, ed esercitano un ruolo cruciale nella regolazione di importanti processi fisiologici, quali sviluppo, proliferazione, differenziamento, apoptosi e risposta a numerosi segnali extracellulari e di stress. I miRNA sono inoltre responsabile della fine regolazione dell'espressione di centinaia di geni bersaglio attraverso il blocco della traduzione o la degradazione dell'mRNA target. Studi di profiling hanno evidenziato l'espressione aberrante di specifici miRNA in numerosi tipi di tumore umano. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di individuare un pannello di miRNA deregolati nell'epatocarcinoma umano e di caratterizzare il ruolo biologico di tre miRNA deregolati nell'HCC, al fine di individuare alcuni dei meccanismi molecolari alla base della trasformazione maligna miRNA-associata. La nostra ricerca è stata inoltre focalizzata nell'individuazione di nuovi bersagli e strumenti terapeutici, quali i microRNA, per il trattamento combinato di HCC in stadio intermedio-avanzato.

Il cibo come creatore di circoli virtuosi. Slow Food e Terra Madre, eccellenze nello sviluppo sostenibile del territorio.

Punto di partenza per il lavoro presentato, sono le tematiche legate alle pratiche di consumo di cibo in un’ottica che superi una semplice visione utilitaristica delle stesse, mentre viene evidenziato invece il più profondo rapporto uomo-cibo e i fenomeni di socializzazione che ne scaturiscono. Si trovano pertanto a coniugarsi la sociologia dei consumi e la sociologia della cultura. La base per questa visione del cibo e delle pratiche di produzione e consumo ad esso collegate è l’ipotesi che nel rapporto uomo-cibo sia individuabile un livello di significato superiore al mero utilitarismo/nutrizionismo, che si compone di una dimensione strutturale, una dimensione simbolica ed una dimensione metaforica. Il cibo, e di conseguenza tutte le pratiche ad esso collegate (produzione, elaborazione, consumo), rientrano pertanto in maniera naturale nella categoria “cultura”, e quindi, accostandoci al paradigma del passaggio da natura a società, attraverso il cibo si crea e si alimenta la socialità del consorzio umano, e quindi l’umanità stessa. Accostando a queste concettualizzazioni l’idea che il consumo in generale possa diventare una prassi tramite cui esperire una più diffusa ricerca di sostenibilità nello sviluppo del territorio, (facendosi carico delle conseguenze socio-ambientali derivanti dalla fruizione di determinati oggetti piuttosto che altri), si è sviluppata l’ipotesi che al consumo alimentare possa competere un ruolo precipuamente attivo nella definizione di pratiche sociali orientate alla sostenibilità, capaci cioè di integrare attraverso il consumo – e in relazione all’indebolimento delle tradizionali agenzie di socializzazione – quella perdita di senso civico e solidarietà organizzata che sperimentiamo nelle prassi di vita quotidiana. Sul piano operativo, la tesi è articolata in sei capitoli: • Il percorso presentato prende le mosse dalla considerazione che il cibo, inteso in un’ottica sociologica, costituisce un fattore culturale non irrilevante, anzi fondamentale per il consorzio umano. Si fornisce quindi una breve descrizione del ruolo del cibo nei suoi accostamenti con la definizione di un territorio (e quindi con la sua storia, economia e società), con le arti visive, con il cinema, con la musica, ma anche con la sfera sensoriale (tatto, gusto, olfatto) ed emotivo-cognitiva (psiche) dell’uomo. • Successivamente, si analizza nello specifico la funzione socializzante delle pratiche alimentari, ripercorrendo le tappe principali degli studi classici di sociologia e antropologia dell’alimentazione e introducendo anche l’idea di cibo come simbolo e metafora, che si riflettono sul piano sociale e sulle relazioni tra gli individui. La constatazione che le pratiche legate al cibo sono le uniche attività umane da sempre e per sempre irrinunciabili è un chiaro indicatore di come esse giochino un ruolo fondamentale nella socializzazione umana. • Nel terzo capitolo, la prospettiva simbolico-metaforica è la base di un’analisi di tipo storico delle pratiche alimentari, nello specifico delle pratiche di consumo di cibo, dalle origini dell’umanità ai giorni nostri. Viene presentato un excursus essenziale in cui l’attenzione è focalizzata sulla tavola, sui cibi ivi serviti e sugli eventi di socializzazione che si sviluppano attorno ad essa, considerando situazioni storico-sociali oggettive di cui si è in grado, oggi, di ricostruire le dinamiche e le fasi più significative. • Il quarto capitolo costituisce un momento di riflessione teorica intorno al tema della globalizzazione nella contemporaneità. Sia per una logica progressione cronologica all’interno del lavoro presentato, sia per la rilevanza in quanto inerente alla società attuale in cui viviamo, non si è potuto infatti non soffermarsi un po’ più a fondo sull’analisi delle pratiche alimentari nella contemporaneità, e quindi nella società generalmente definita come “globalizzata” (o “mcdonaldizzata”, per dirla alla Ritzer) ma che in realtà è caratterizzata da un più sottile gioco di equilibri tra dimensione locale e dimensione globale, che si compenetrano come anche nel termine che indica tale equilibrio: il “glocale”. In questo capitolo vengono presentati i principali riferimenti teorici relativi a queste tematiche. • Nel quinto capitolo è stata analizzata, quindi, la declinazione in senso “alimentare” della relazione tra globale e locale, e quindi non solo i mutamenti intercorsi nella contemporaneità nelle pratiche di produzione, scambio e consumo di cibo con particolare riferimento ai sistemi culturali e al territorio, ma anche alcune proposte (sia teoriche che pratiche) a garanzia di uno sviluppo sostenibile del territorio, che trovi i suoi fondamenti sulla perpetuazione di modalità tradizionali di produzione, commercio e consumo di cibo. • Nel sesto capitolo viene analizzato un caso di studio significativo, (il movimento Slow Food, con il suo progetto Terra Madre) senza la pretesa di confermare o smentire né le ipotesi di partenza, né i concetti emersi in itinere, ma semplicemente con l’intenzione di approfondire il percorso svolto attraverso l’esemplificazione operativa e la ricerca entro un piccolo campione composto da testimoni significativi e intervistati, sottoposti a colloqui e interviste incentrate su item inerenti i temi generali di questo lavoro e sul caso di studio considerato. La scelta del caso è motivata dalla considerazione che, alla luce delle filosofia che lo anima e delle attività che svolge, il movimento Slow Food con il progetto Terra Madre costituisce una vera e propria eccellenza nella pianificazione di uno sviluppo sostenibile del territorio e delle sue risorse, tanto economiche quanto sociali e culturali. L’intera analisi è stata condotta tenendo presente l’importanza della comparazione e della collocazione del singolo caso non solo nel contesto sociale di riferimento, ma anche in sintonia con l’ipotesi della ricerca, e quindi con l’assunto che le pratiche alimentari possano guidare uno sviluppo sostenibile del territorio. Per analizzare la realtà individuata, si è in primo luogo proceduto alla raccolta e all’analisi di dati e informazioni volte alla ricostruzione della sua storia e del suo sviluppo attuale. Le informazioni sono state raccolte attraverso l’analisi di materiali, documenti cartacei e documenti multimediali. Si è poi proceduto con colloqui in profondità a testimoni significativi individuati nell’ambito delle attività promosse da Slow Food, con particolare riferimento alle attività di Terra Madre; le informazioni sono state elaborate con l’ausilio dell’analisi del contenuto. Alla luce di quanto analizzato, tanto a livello teorico quanto a livello empirico, la tesi si conclude con alcune considerazioni che, in linea con la finalità dichiarata di approfondire (più che di confermare o smentire) le ipotesi di partenza circa un ruolo fondamentale delle pratiche alimentari nello sviluppo sostenibile del territorio, non possono comunque non tendere ad una convalida dei concetti introduttivi. Si individuano pertanto spunti importanti per affermare che nelle pratiche alimentari, nei tre momenti in cui trovano specificazione (la produzione, lo scambio, il consumo), siano individuabili quei semi valoriali che possono dare solidità alle ipotesi di partenza, e che quindi - nell’intento di operare per uno sviluppo sostenibile del territorio - sia possibile farne un valido strumento al fine di costruire dei veri e propri percorsi di sostenibilità ancorati ai concetti di tutela della tradizione locale, recupero e salvaguardia dei metodi tradizionali di produzione e conservazione, certificazione di tipicità, controllo della distribuzione, riscatto e promozione delle modalità tradizionali di consumo con particolare riferimento alle culture locali.

Architectures for Context Aware Services in Smart Environments

This thesis deals with Context Aware Services, Smart Environments, Context Management and solutions for Devices and Service Interoperability. Multi-vendor devices offer an increasing number of services and end-user applications that base their value on the ability to exploit the information originating from the surrounding environment by means of an increasing number of embedded sensors, e.g. GPS, compass, RFID readers, cameras and so on. However, usually such devices are not able to exchange information because of the lack of a shared data storage and common information exchange methods. A large number of standards and domain specific building blocks are available and are heavily used in today's products. However, the use of these solutions based on ready-to-use modules is not without problems. The integration and cooperation of different kinds of modules can be daunting because of growing complexity and dependency. In this scenarios it might be interesting to have an infrastructure that makes the coexistence of multi-vendor devices easy, while enabling low cost development and smooth access to services. This sort of technologies glue should reduce both software and hardware integration costs by removing the trouble of interoperability. The result should also lead to faster and simplified design, development and, deployment of cross-domain applications. This thesis is mainly focused on SW architectures supporting context aware service providers especially on the following subjects: - user preferences service adaptation - context management - content management - information interoperability - multivendor device interoperability - communication and connectivity interoperability Experimental activities were carried out in several domains including Cultural Heritage, indoor and personal smart spaces – all of which are considered significant test-beds in Context Aware Computing. The work evolved within european and national projects: on the europen side, I carried out my research activity within EPOCH, the FP6 Network of Excellence on “Processing Open Cultural Heritage” and within SOFIA, a project of the ARTEMIS JU on embedded systems. I worked in cooperation with several international establishments, including the University of Kent, VTT (the Technical Reserarch Center of Finland) and Eurotech. On the national side I contributed to a one-to-one research contract between ARCES and Telecom Italia. The first part of the thesis is focused on problem statement and related work and addresses interoperability issues and related architecture components. The second part is focused on specific architectures and frameworks: - MobiComp: a context management framework that I used in cultural heritage applications - CAB: a context, preference and profile based application broker which I designed within EPOCH Network of Excellence - M3: "Semantic Web based" information sharing infrastructure for smart spaces designed by Nokia within the European project SOFIA - NoTa: a service and transport independent connectivity framework - OSGi: the well known Java based service support framework The final section is dedicated to the middleware, the tools and, the SW agents developed during my Doctorate time to support context-aware services in smart environments.

Smart Sensors For Interoperable Smart Environment

Smart Environments are currently considered a key factor to connect the physical world with the information world. A Smart Environment can be defined as the combination of a physical environment, an infrastructure for data management (called Smart Space), a collection of embedded systems gathering heterogeneous data from the environment and a connectivity solution to convey these data to the Smart Space. With this vision, any application which takes advantages from the environment could be devised, without the need to directly access to it, since all information are stored in the Smart Space in a interoperable format. Moreover, according to this vision, for each entity populating the physical environment, i.e. users, objects, devices, environments, the following questions can be arise: “Who?”, i.e. which are the entities that should be identified? “Where?” i.e. where are such entities located in physical space? and “What?” i.e. which attributes and properties of the entities should be stored in the Smart Space in machine understandable format, in the sense that its meaning has to be explicitly defined and all the data should be linked together in order to be automatically retrieved by interoperable applications. Starting from this the location detection is a necessary step in the creation of Smart Environments. If the addressed entity is a user and the environment a generic environment, a meaningful way to assign the position, is through a Pedestrian Tracking System. In this work two solution for these type of system are proposed and compared. One of the two solution has been studied and developed in all its aspects during the doctoral period. The work also investigates the problem to create and manage the Smart Environment. The proposed solution is to create, by means of natural interactions, links between objects and between objects and their environment, through the use of specific devices, i.e. Smart Objects

Caratterizzazione e generazione di segnali PWM per amplificatori in classe D ad alta efficienza

The convergence of information technology and consumer electronics towards battery powered portable devices has increased the interest in high efficiency, low dissipation amplifiers. Class D amplifiers are the state of the art in low power consumption and high performance amplification. In this thesis we explore the possibility of exploiting nonlinearities introduced by the PWM modulation, by designing an optimized modulation law which scales its carrier frequency adaptively with the input signal's average power while preserving the SNR, thus reducing power consumption. This is achieved by means of a novel analytical model of the PWM output spectrum, which shows how interfering harmonics and their bandwidth affect the spectrum. This allows for frequency scaling with negligible aliasing between the baseband spectrum and its harmonics. We performed low noise power spectrum measurements on PWM modulations generated by comparing variable bandwidth, random test signals with a variable frequency triangular wave carrier. The experimental results show that power-optimized frequency scaling is both feasible and effective. The new analytical model also suggests a new PWM architecture that can be applied to digitally encoded input signals which are predistorted and compared with a cosine carrier, which is accurately synthesized by a digital oscillator. This approach has been simulated in a realistic noisy model and tested in our measurement setup. A zero crossing search on the obtained PWM modulation law proves that this approach yields an equivalent signal quality with respect to traditional PWM schemes, while entailing the use of signals whose bandwidth is remarkably smaller due to the use of a cosine instead of a triangular carrier.

Security control brought back to the user

The activity of the Ph.D. student Juri Luca De Coi involved the research field of policy languages and can be divided in three parts. The first part of the Ph.D. work investigated the state of the art in policy languages, ending up with: (i) identifying the requirements up-to-date policy languages have to fulfill; (ii) defining a policy language able to fulfill such requirements (namely, the Protune policy language); and (iii) implementing an infrastructure able to enforce policies expressed in the Protune policy language. The second part of the Ph.D. work focused on simplifying the activity of defining policies and ended up with: (i) identifying a subset of the controlled natural language ACE to express Protune policies; (ii) implementing a mapping between ACE policies and Protune policies; and (iii) adapting the ACE Editor to guide users step by step when defining ACE policies. The third part of the Ph.D. work tested the feasibility of the chosen approach by applying it to meaningful real-world problems, among which: (i) development of a security layer on top of RDF stores; and (ii) efficient policy-aware access to metadata stores. The research activity has been performed in tight collaboration with the Leibniz Universität Hannover and further European partners within the projects REWERSE, TENCompetence and OKKAM.

I principi generali della politica energetica europea

La tesi analizza i collegamenti tra la dimensione interna e la dimensione esterna del diritto europeo dell’energia al fine valutare l’efficacia e la coerenza della politica energetica europea in un approccio realmente globale ed integrato. Lo scopo della ricerca è quello di interrogarsi sull’evoluzione della competenza dell’Unione in tema di energia e su quale possa essere il suo contributo allo studio del diritto dell’Unione. L’analisi mira a chiarire i principi cardine della politica energetica europea ed i limiti che incontra l’azione dell’Unione nella disciplina dei settori energetici. Nonostante la centralità e l’importanza dell’energia, tanto per il buon funzionamento del mercato interno, quanto per la protezione dell’ambiente e per la sicurezza internazionale, la ricerca ha riscontrato come manchi ancora in dottrina una sufficiente elaborazione dell’energia in chiave organica e sistematica. L’analisi è svolta in quattro capitoli, ciascuno dei quali è suddiviso in due sezioni. Lo studio si apre con l’indagine sulla competenza energetica dell’Unione, partendo dai trattati settoriali (CECA ed Euratom) fino ad arrivare all’analisi delle disposizioni contenute nel Trattato di Lisbona che prevedono una base giuridica ad hoc (art. 194 TFUE) per l’energia. Lo scopo del primo capitolo è quello di fornire un inquadramento teorico alla materia, analizzando le questioni riguardanti l’origine del ‘paradosso energetico’ ed i limiti della competenza energetica dell’Unione, con un sguardo retrospettivo che tenga conto del dinamismo evolutivo che ha caratterizzato il diritto europeo dell’energia. Nel corso del secondo capitolo, la ricerca analizza l’impatto del processo di liberalizzazione sulla struttura dei mercati dell’elettricità e del gas con la graduale apertura degli stessi al principio della libera concorrenza. L’analisi conduce ad una ricognizione empirica sulle principali categorie di accordi commerciali utilizzate nei settori energetici; la giurisprudenza della Corte sulla compatibilità di tali accordi rispetto al diritto dell’Unione mette in evidenza il difficile bilanciamento tra la tutela della sicurezza degli approvvigionamenti e la tutela del corretto funzionamento del mercato interno. L’applicazione concreta del diritto antitrust rispetto alle intese anticoncorrenziali ed all’abuso di posizione dominante dimostra la necessità di tener conto dei continui mutamenti indotti dal processo di integrazione dei mercati dell’elettricità e del gas. Il terzo capitolo introduce la dimensione ambientale della politica energetica europea, sottolineando alcune criticità relative alla disciplina normativa sulle fonti rinnovabili, nonché gli ostacoli al corretto funzionamento del mercato interno delle quote di emissione, istituito dalla legislazione europea sulla lotta ai cambiamenti climatici. I diversi filoni giurisprudenziali, originatisi dalle controversie sull’applicazione delle quote di emissioni, segnalano le difficoltà ed i limiti della ‘sperimentazione legislativa’ adottata dal legislatore europeo per imporre, attraverso il ricorso a strumenti di mercato, obblighi vincolanti di riduzione delle emissioni inquinanti che hanno come destinatari, non solo gli Stati, ma anche i singoli. Infine, il quarto ed ultimo capitolo, affronta il tema della sicurezza energetica. Nel corso del capitolo vengono effettuate considerazioni critiche sulla mancanza di collegamenti tra la dimensione interna e la dimensione esterna del diritto europeo dell’energia, evidenziando i limiti all’efficacia ed alla coerenza dell’azione energetica dell’Unione. L’inquadramento teorico e normativo della dimensione estera della politica energetica europea tiene conto del processo di allargamento e della creazione del mercato interno dell’energia, ma viene inserito nel più ampio contesto delle relazioni internazionali, fondate sul delicato rapporto tra i Paesi esportatori ed i Paesi importatori di energia. Sul piano internazionale, l’analisi ricostruisce la portata ed i limiti del principio di interdipendenza energetica. Lo studio si concentra sulle disposizioni contenute nei trattati internazionale di cooperazione energetica, con particolare riferimento ai diversi meccanismi di risoluzione delle controversie in tema di protezione degli investimenti sull’energia. Sul piano interno, la ricerca pone in evidenza l’incapacità dell’Unione di ‘parlare con una sola voce’ in tema di sicurezza energetica a causa della contrapposizione degli interessi tra i vecchi ed i nuovi Stati membri rispetto alla conclusione degli accordi di fornitura di lunga durata con i Paesi produttori di gas. Alla luce delle nuove disposizioni del Trattato di Lisbona, il principio solidaristico viene interpretato come limite agli interventi unilaterali degli Stati membri, consentendo il ricorso ai meccanismi comunitari previsti dalla disciplina sul mercato interno dell’elettricità e del gas, anche in caso di grave minaccia alla sicurezza degli approvvigionamenti energetici.

Sintesi di nanoparticelle polimeriche basate su acido(D,L-lattico-co-glicolico) per applicazioni in nanomedicina

Questo lavoro di tesi rientra nel progetto europeo SaveMe, al quale partecipa il gruppo di ricerca del dipartimento di chimica organica nel quale ho svolto l’attività di tirocinio. Obiettivo finale di tale progetto è la sintesi di nanoparticelle a base di PLGA (acido poli(D,L-lattico-co-glicolico)) superficialmente funzionalizzate con biomolecole, per l’impiego nel trattamento e nella diagnosi del cancro al pancreas. L’obiettivo da raggiungere nel primo anno di ricerca per il mio gruppo era la sintesi delle nanoparticelle centrali (core nanosystems). Nel presente lavoro sono quindi riportati i metodi di sintesi di polimeri derivati da PLGA e suoi copolimeri con PEG (polietilenglicole) aventi vari gruppi funzionali terminali: acidi idrossamici, amminici e acidi carbossilici. I polimeri sintetizzati sono stati caratterizzati tramite test colorimetrici qualitativi, 1H-NMR, 13C-NMR, spettrometria IR e TGA. Sono state sintetizzate nanoparticelle polimeriche (PNPs), con le tecniche Oil/Water (O/W) e nanoprecipitazione (NP), basate sui polimeri ottenuti, aventi quindi funzioni acide, idrossamiche ed amminiche sulla superficie. Su queste PNPs è stato effettuata una decorazione superficiale con nanoparticelle metalliche di maghemite (CAN-Maghemite). Le nanoparticelle polimeriche sono state caratterizzate tramite DLS e delle PNPs decorate sono state ottenute immagini TEM. Sono riportati inoltre i test di viabilità cellulare delle nanoparticelle ottenute.

La metilazione del DNA come meccanismo di regolazione dell'espressione genica

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da fattori multipli, tra i quali quelli epigenetici hanno richiamato l’attenzione nell’ultima decade. I meccanismi di regolazione epigenetica comprendono la metilazione del DNA a livello delle isole CpG nella regione del promotore del gene e le modifiche istoniche post-traduzionali, quali acetilazioni e metilazioni. Questa serie di elementi di regolazione concorre a determinare uno stato di impacchettamento della cromatina più o meno rilassato, che influenzerà la trascrizione di geni critici, per esempio nello sviluppo o nelle neoplasie. Gli ambiti nei quali lo studio del profilo epigenetico ha assunto maggiore rilievo sono effettivamente quello oncologico e quello del differenziamento di cellule staminali, due contesti nei quali si è svolto il mio programma di Dottorato, nel quale ho seguito in parallelo più progetti presentati nella tesi in modo indipendente. La ricerca in campo tumorale è centrata sull’indagine di nuovi marcatori e sull’individuazione di profili epigenetici specifici per un determinato tumore che possano aiutare la diagnostica precoce, la classificazione e la sorveglianza dell’evoluzione clinica della neoplasia. In questo contesto si inserisce il progetto finalizzato alla costruzione di quadri associativi di metilazione in due tumori cerebrali, il glioblastoma (GBM) e l’oligodendroglioma (ODG). La casistica di GBM e di ODG in dotazione è stata valutata dal punto di vista della metilazione dei promotori di geni (MGMT, EMP3,..) con funzioni oncosoppressive e trovati ipermetilati anche in altri tumori o localizzati in regioni citologicamente instabili, per poter correlare questi dati con la risposta terapeutica nel caso del GBM o con i dati di perdita di eterozigosità (LOH) 1p19q nel caso dell’ODG. Parallelamente all’individuazione di marcatori epigenetici in ambito oncologico, la ricerca si sta muovendo anche nell’indagine di nuove potenziali terapie farmacologiche antitumorali su base epigenetica. In questo contesto, con lo scopo di approfondire le relazioni tra i meccanismi alla base della regolazione epigenetica, ci si è riproposti di valutare la correlazione tra il meccanismo di metilazione/demetilazione del DNA e quello di acetilazione/deacetilazione istonica e la loro vicendevole influenza nel determinare silenziamento genico piuttosto che riattivazione dell’espressione di geni ipermetilati. Sono stati usati farmaci epigenetici demetilanti, quali Azacitidina e Decitabina, inibitori della istone deacetilasi, quali la Tricostatina A, e inibitori della via di sintesi di molecole, le poliammine, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica con modalità ancora da precisare in modo definitivo. Sebbene i meccanismi di regolazione epigenetica vengano studiati per lo più nel cancro, a causa delle gravi conseguenze che una loro disregolazione porta in termini di silenziamento di geni oncosoppressori, essi sono implicati fisiologicamente anche nel differenziamento di cellule staminali. Gli ultimi due progetti trattati nella tesi si contestualizzano in questo ambito. In particolare viene presentata la messa a punto di una metodologia di immunoprecipitazione sequenziale della cromatina finalizzata all’individuazione di due modificazioni istoniche associate alla stessa regione di DNA. Le modifiche hanno riguardato i marcatori rappresenatativi di cromatina trascrizionalmente repressa H3K27me3 (trimetilazione della Lys27 dell’istone H3) e di cromatina trascrizionalmente attiva H3K24me2 (dimetilazione della Lys4 dell’istone H3) che definiscono i domini detti bivalenti, associati a geni che codificano per fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo in cellule embrionali staminali, mantenendoli pronti per un veloce indirizzamento verso l’ attivazione trascrizionale. Il ruolo che la regolazione epigenetica svolge durante il differenziamento di cellule staminali non è ancora noto con precisione. È chiaro però che la memoria della linea cellulare verso la quale si differenzia una cellula staminale adulta, implica l’utilizzo di modifiche epigenetiche, quali la metilazione del DNA e correlati pattern di metilazione e acetilazione istonica. L’ultimo progetto, trattato, è stato finalizzato a verificare il coinvolgimento dell’epigenetica e in particolare della metilazione dei promotori di fattori trascrizionali precocemente attivati durante il differenziamento verso il fenotipo muscolare cardiaco di cellule staminali umane derivate da tessuto adiposo (ADSCs).

Modulation der Immunogenität von humanen Nierenzellkarzinomzellen durch stabilen TAP1-Gentransfer

Bei Nierenzellkarzinomen (NZK), wie auch bei vielen anderen Tumoren konnte eine reduzierte Expression der Klasse I Haupthistokompatibilitäts-Komplexe (MHC Klasse I) nachgewiesen werden, die assoziiert sein kann mit der gestörten Expression oder Funktion von Komponenten der Antigenprozessierung. Eine verminderte Erkennung solcher Tumore durch zytotoxische T-Lymphozyten und ein Zusammenhang mit einem Fortschreiten der Erkrankung führte zu der Annahme, daß es sich bei diesen Störungen um "immune escape"-Mechanismen handelt. Um die Bedeutung des heterodimeren Peptidtransporters TAP ("transporter associated with antigen processing") für die Immunogenität von Nierenzellkarzinomen zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der stabile Gentransfer des humanen TAP1A-Gens in Nierenzellkarzinom-Zellen erfolgreich durchgeführt.
Dies konnte durch die Optimierung der Transfektionsmethode und des verwendeten Plasmid-Vektors erreicht werden. Die Transfektionen wurden mit Hilfe der Rechteck-Impuls-Elektroporation unter spezifischen, in der Arbeit etablierten Bedingungen durchgeführt. Der CMV-regulierte TAP-Expressions-Vektor wurde dahingehend verbessert, daß durch die Einführung einer IRES ("internal ribosomal entry site") Sequenz eine bicistronische m-RNS transkribiert wird, die sowohl das TAP1-Transgen als auch den Neomycin-Selektionsmarker enthält.
Es konnte nach klonaler Selektion eine stabile, aber unter den sieben getesteten Klonen heterogene Transkription der transgenen TAP1-mRNS nachgewiesen werden. In der Protein-Expression zeigten 5/7 der TAP1A-positive Klone eine mindestens zweifache Induktion der TAP1-Expression. In 2/7 dieser TAP1A-positive Klone war die TAP1-Überexpression mit einer Erhöhung der MHC Klasse I-Expression und selektiver Induktion des HLA-A2-Moleküls in der Durchflußzytometrie verbunden. Eine Quantifizierung des Peptidtransportes ergab je nach verwendetem Modellpeptid eine geringe oder gar keine Erhöhung der Transportrate in den TAP1-Transfektanden gegenüber Kontrollzellen. Ebenfalls konnte in Zytotoxizitäts-Analysen mit einer autologen T-Zellinie eine Erhöhung der spezifischen Lyse nicht gezeigt werden. Jedoch wurden im Zellkultur-Überstand dieser Zytotoxizitäts-Analysen bei einigen TAP1A-positive Transfektanden gegenüber mock transfizierten-Kontrollzellen deutlich erhöhte Werte des Tumornekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha) gemessen, was als Maß einer T-Zell-Aktivierung gilt. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer ebenfalls deutlich gesteigerten T-Zell-Proliferation in Anwesenheit von TAP1A-positive Transfektanden.
Die alleinige stabile Überexpression von TAP1 in Nierenzellkarzinomzellen kann somit zu einer Modulation der MHC Klasse I-Expression und der T-Zell-Reaktivität führen. Das weist darauf hin, daß eine starke, konstitutive TAP1-Expression eine grundlegende Voraussetzung für eine effiziente Antigenprozessierung und Immunantwort darstellt und die Immuntoleranz gegenüber NZK durch stabilen TAP1-Gentransfer beinflußbar ist. Eine denkbare klinische Anwendung dieser Technik ist die Herstellung einer Tumorantigen-präsentierenden Zellvakzine, die eine T-Zell-Anergie gegenüber NZK durchbrechen könnte.
Schlüsselwörter: TAP, MHC, Antigenprozessierung, Tumorimmunologie, Gentransfer