Associação entre o Uso de Abortifacientes e Defeitos Congênitos

Objetivo: verificar a associação entre o uso de abortivos durante o primeiro trimestre de gestação e a ocorrência de defeitos congênitos em recém-nascidos (RN). Métodos: estudo caso-controle com amostra de 800 nativivos, em maternidade pública de Salvador, Bahia, pelo período de um ano. Eram selecionados os seis primeiros nascimentos ocorridos em um só dia, sendo feitas consultas aos prontuários para verificação do registro de defeitos congênitos. Nos casos positivos eram observados os bebês afetados e realizada entrevista com as puérperas para o levantamento de antecedentes gestacionais e genéticos, utilizando questionário como instrumento de coleta de dados. Posteriormente os dados eram inseridos em programa de computador Epi-Info 5.0 para análise estatística. Resultados: as puérperas estudadas foram predominantemente de classe socioeconômica baixa (74,8%), sem escolaridade ou apenas 1º grau (61,1%). A taxa geral de defeitos congênitos foi de 4,7%. Entre as puérperas, 16% relataram a ingestão de substâncias abortivas no primeiro trimestre de gestação e 10,9% destas tiveram filhos com malformações. Nas crianças em que as mães não utilizaram abortivos essa incidência foi 3,6%. Os principais agentes usados como abortifacientes foram os chás medicinais e o misoprostol (Cytotec). O alumã (Vermonia baiensis Tol) e o espinho cheiroso (Kanthoxilum shifolium Lam) foram as plantas mais utilizadas inadequadamente, pois não apresentam propriedades abortivas, justificando assim a sua ineficácia. Conclusão: o presente estudo evidencia que tentativas de abortamento são práticas muito usuais em populações de baixa renda. Revela ainda que o uso de abortivos provoca um percentual significativo de malformações congênitas em bebês nativivos.

Detecção e exérese de lesões mamárias não palpáveis orientadas por cirurgia radioguiada com injeção de ar para controle radiológico

OBJETIVO: avaliar a eficiência da localização e exérese por cirurgia radioguiada de lesões ocultas mamárias utilizando radiofármaco injetado diretamente no interior das lesões ou até dois centímetros destas com posterior injeção de ar como controle radiológico. MÉTODOS: vinte e nove pacientes com 32 lesões mamárias ocultas, detectadas por mamografia ou ultra-sonografia, classificadas como Bi-Rads® 3, 4 e 5 foram incluídas neste estudo observacional com resultados expressos em percentagens. O radiofármaco utilizado foi o macroagregado de albumina marcado com tecnécio-99m (99mTc-MAA) injetado por orientação mamográfica ou guiado por ultra-sonografia. A injeção do radiofármaco foi seguida pela imediata administração de ar, através da agulha da estereotaxia, visando o controle radiológico da injeção do radiofármaco. A biopsia excisional foi feita com o auxílio do aparelho portátil gamma-probe (detector de radiação gama) e a remoção completa das lesões foi verificada pela radiografia das peças cirúrgicas ou por exame por congelação intra-operatório. RESULTADOS: câncer de mama foi encontrado em 10% (1/10) das lesões BI-RADS® 3, em 31,5% (6/19) das BI-RADS® 4 e em 66,6% (2/3) das BI-RADS® 5. As 29 pacientes corresponderam a 32 espécimes, cirúrgicos. O radiofármaco foi corretamente posicionado em 96,8% (31/32) dos espécimes permitindo remoção de 96,8% das lesões mamárias não palpáveis estudadas. A completa remoção da lesão foi demonstrada pela radiografia das peças em 23 casos (71,8%), pelo estudo intra-operatório por congelação em 21,8% (7/32) e por ambos os métodos em 6,2% (2/32). CONCLUSÃO: a cirurgia radioguiada é importante instrumento na remoção de lesões mamárias não palpáveis, tratando-se de método simples, rápido e exeqüível que pode ser implementado na rotina clínica dessas pacientes.

Criopreservação de sêmen humano: comparação entre métodos de congelação e tipos de envase

OBJETIVOS: comparar duas diferentes técnicas de congelação e dois tipos de envase do sêmen humano durante processo de criopreservação. MÉTODOS: estudo experimental, no qual foi analisada a criopreservação de 18 amostras de sêmen de 18 voluntários. Após a adição de meio crioprotetor, "Test-yolk buffer" , as amostras de sêmen foram envasadas em palhetas com capacidade de 0,25 mL ou em criotubos de 2 mL e submetidas à criopreservação por dois métodos, um lento e outro rápido, totalizando quatro tratamentos distintos: RP (congelação pelo método rápido e envasado em palheta), RT (rápido-criotubo), LP (lento-palheta) e LT (lento-criotubo). As amostras, após 24 horas, foram descongeladas em temperatura ambiente e mantidas a 37ºC. Os dados coletados foram analisados através do teste t de Student, com p<0,05, utilizando o programa de computador SPSS for Windows® versão 11.0.0. RESULTADOS: houve redução da motilidade espermática após o processo de criopreservação. A taxa de motilidade inicial foi 58,1% e as motilidades após os diferentes métodos de criopreservação foram: 19,2% (RP), 27% (RT), 21,1% (LP) e 30,3% (LT). Houve redução significativa na morfologia normal. A taxa de morfologia normal inicial foi 14,2% e as morfologias após os diferentes métodos de criopreservação foram: 12,8% (RP), 12,6% (RT), 12,6% (LP) e 12,4% (LT). CONCLUSÕES: o método de criopreservação lento com envase em criotubo esteve associado à melhor motilidade espermática após o descongelamento. Não houve diferença entre os métodos quando avaliada a morfologia espermática.

Morfologia das células intersticiais de ovários policísticos de ratas: um estudo experimental

OBJETIVOS: Avaliar a histomorfometria das células intersticiais dos ovários, bem como analisar a concentração sanguínea de esteroides sexuais de ratas portadoras de ovários policísticos induzidos pela luz contínua. MÉTODOS: Vinte ratas foram divididas em dois grupos: ratas na fase de estro (GCtrl ) e ratas portadoras de ovários policísticos induzidos pela iluminação contínua (GOP). Os animais do GCtrl permaneceram com período de luz das 7:00 s 19:00 horas, e os animais do GOP, com iluminação contínua (400 Lux), durante um período de 60 dias. Ao final desse período todos os animais foram anestesiados, foi coletado o sangue, para determinação dos níveis séricos de estradiol (E2), progesterona (P4) e testosterona (T), seguido da retirada dos ovários que foram fixados em formol a 10% e processados para inclusão em parafina. Cortes histológicos com 5 µm corados pela hematoxilina e eosina foram utilizados para análise histomorfométrica. As análises morfológicas, contagem de cistos, determinação da concentração e do volume nuclear das células intersticiais foram realizadas com o auxílio de microscópio de luz adaptado a uma câmera de alta resolução (AxioCam), cujas imagens foram transmitidas e analisadas em computador com software AxioVision Rel 4.8 (Carl Zeiss). Os dados obtidos foram submetidos ao teste t de Student (p<0,05). RESULTADOS: A morfologia mostrou a presença de cistos nos ovários pertencentes ao Grupo OP e de corpos lúteos no GCtrl, mostrando ainda evidências da origem das células intersticiais a partir das células da teca interna desses cistos. Com relação aos níveis hormonais o GOP apresentou níveis séricos de estradiol (pg/mL) aumentados em relação ao GCtrl (GOP=124,9±4,2>GCtrl=73,2±6,5; p<0,05), o mesmo ocorrendo com os níveis de testosterona (pg/mL) (GOP=116,9±4,6>GCtrl=80,6±3,9; p<0,05). Entretanto os níveis de progesterona (ng/mL) foram mais elevados no GCtrl em relação ao GOP (GCtrl=16,3±2,0>GOP=4,2±1,5; p<0,05). A morfometria mostrou haver aumento significante do volume nuclear no grupo GOP (GOP=102,1±5,2>GCtrl=63,6±16,5; p<0,05), assim como da área ocupada (%) pelas células intersticiais (GOP=24,4±6,9>GCtrl=6,9±3,2; p<0,05) em relação aos animais do GCtrl. CONCLUSÃO: As células intersticiais do ovário policístico da rata provavelmente provêm dos cistos ovarianos devido degeneração das células da granulosa e diferenciação das células da teca interna. As elevações dos níveis séricos de testosterona e de estradiol provavelmente provêm do aumento significativo da atividade celular e da área ocupada pelas células intersticiais.

Viabilidade econômica dos sistemas manual e mecanizado de aplicação de herbicidas em ferrovias

A aplicação mecanizada de herbicidas em ferrovias tem como principal vantagem a grande capacidade operacional, cobrindo trechos extensos em curtos espaços de tempo. Entretanto em função das características dos equipamentos utilizados, quase sempre ocorre grande desperdício de herbicida. A aplicação manual, através de pulverizadores costais, tem como principal vantagem a possibilidade da pulverização dirigida às áreas infestadas, diminuindo a quantidade de herbicida aplicado. Por outro lado, sua reduzida capacidade operacional faz com que a aplicação de longos trechos seja demorada, tornando-a, assim, mais dependente dos problemas climáticos e operacionais da ferrovia. O objetivo do trabalho foi realizar uma análise comparativa das características operacionais e econômicas destes sistemas de aplicação, apontando os fatores mais importantes a serem avaliados para a sua implantação. Para tanto, foram realizadas simulações em computador, baseando-se em diversas equações matemáticas e dados levantados no campo. Os resultados mostraram que a aplicação manual apresentou-se mais econômica apenas para trechos com baixas infestações (até 10%, e média). Na composição de custos, os gastos com herbicidas corresponderam a cerca de 80% do total para a aplicação mecanizada e apenas 8% na manual. Levando-se em conta os fatores operacionais e de mão-de-obra, em apenas um dos trechos avaliados houve vantagem econômica do uso da aplicação manual.

Caracteres morfoanatômicos de Brachiaria brizantha submetida à aplicação de Trinexapac-Ethyl

Objetivou-se com este trabalho avaliar alterações nos caracteres anatômicos e morfológicos da folha (bainha e lâmina) e do caule de Brachiaria brizantha tratada com o regulador de crescimento trinexapac-ethyl. O delineamento experimental utilizado foi o completamente ao acaso, com duas doses do trinexapac-ethyl (0,00 e 0,75 kg ha-1) e cinco repetições. Cinquenta dias após a aplicação dos tratamentos, amostras do terço médio da bainha, da lâmina da segunda folha completamente expandida e do entrenó do caule abaixo da inserção da bainha foliar foram coletadas para a determinação de características morfológicas, como altura de planta, comprimento e diâmetro de entrenó, comprimento da bainha, comprimento e largura da folha. Para avaliação das características anatômicas, foram realizados cortes transversais da folha e do caule e cortes longitudinais do caule, em micrótomo de mesa, e corados com fuccina e azul de astra preparadas em lâminas semipermanentes. As imagens obtidas foram digitalizadas usando-se microscópio de luz acoplado a câmera digital e conectado a um computador. Para obtenção das medidas de área e medidas lineares foi utilizado o software Image Pro-Plus. Os dados foram submetidos à análise estatística, pelo teste F a 5% de probabilidade. O regulador de crescimento promoveu redução do comprimento do limbo foliar, do entrenó, da bainha e da altura de plantas. Por outro lado, no limbo foliar, o trinexapac-ethyl aumentou a espessura da lâmina foliar, da área das células da bainha e da área do mesofilo em B. brizantha.

Distribuição volumétrica e espectro de gotas de pontas de pulverização de baixa deriva

Objetivou-se neste trabalho avaliar a distribuição volumétrica e o espectro de gotas das pontas de pulverização de baixa deriva TTI110015, AI110015 e AVI11001 sob diferentes condições operacionais. A distribuição volumétrica foi determinada em bancada de ensaios padronizada analisando o coeficiente de variação (CV%) de uma barra simulada em computador, utilizando pressões de 200, 300 e 400 kPa, altura de 30, 40 e 50 cm em relação à bancada e espaçamento entre pontas de 40 a 100 cm. O espectro de gotas foi produzido utilizando-se apenas água como calda em um analisador de partículas em meio aquoso, nas pressões de 200, 300 e 400 kPa. Foram avaliados o DMV, a porcentagem de gotas com diâmetro inferior a 100 µm (%100 µm) e a amplitude relativa (AR). As pontas proporcionaram perfil descontínuo nas pressões de 300 e 400 kPa e uniforme a 200 kPa. Na pressão de 200 kPa, as pontas foram adequadas apenas para aplicação em faixa, e a 300 e 400 kPa, apenas para área total. Ocorreu menor CV (abaixo de 7%) com a maior pressão de trabalho e menor espaçamento entre pontas. À medida que se aumentou a pressão de trabalho, reduziu-se o DMV. As pontas TTI110015 e AI110015 em todas as pressões e a ponta AVI11001 na pressão de 200 kPa produziram gotas extremamente grossas e gotas grossas nas pressões de 300 e 400 kPa apenas para a ponta AVI11001. As pontas proporcionaram baixos valores de amplitude relativa (AR) e gotas de tamanho uniforme, bem como produziram baixa porcentagem de gotas menores que 100 µm, principalmente TTI110015 e AI110015, com menor risco de deriva.

De medios ordinarios y extraordinarios: la Iglesia Católica y los debates sobre la "muerte digna" en Argentina

El artículo aborda los debates públicos en torno a la sanción de la llamada ley de "muerte digna" en Argentina, que garantiza el derecho de los pacientes con enfermedades terminales o incurables a rechazar o suspender tratamientos e intervenciones que les prolonguen la vida. El artículo analiza puntualmente el papel de los actores religiosos en estos debates, examinando los actores que representan la voz de la Iglesia Católica en la esfera pública, la naturaleza de los argumentos y las estrategias desplegadas para incidir en la legislación. En primer lugar, a partir de documentos históricos de la Iglesia Católica se reconstruye los posicionamientos de la institución respecto a los dilemas que presenta la gestión del final de la vida en contextos médicos. En segundo lugar, se aborda la estrategia de la Iglesia Católica Argentina (y de sus portavoces) en los debates públicos recientes en dicho país.

Avaliação do relacionamento entre danos mecânicos e vigor, em sementes de milho, por meio da análise de imagens

A possibilidade de utilização da técnica de análise de imagens, para a determinação de danos mecânicos em sementes, é promissora; é um método de precisão, onde as sementes podem ser examinadas individualmente em imagens ampliadas e capazes de indicar, com detalhes, a área danificada, a localização e a extensão do dano. Por se tratar de método não destrutivo, as sementes em análise podem ser submetidas a testes fisiológicos e, desta forma, permitir o estabelecimento de relações entre os danos mecânicos e os prejuízos causados à qualidade. Assim, o presente trabalho teve o objetivo de estudar os efeitos dos danos mecânicos sobre o vigor de sementes de milho, utilizando a referida técnica. Cinqüenta sementes de cada um dos cultivares estudados (CO 32, AG 6690 e Attack) foram selecionadas visualmente, de tal maneira que a amostra fosse constituída por sementes íntegras e com danos mecânicos de intensidades variáveis. Em seguida, as sementes foram radiografadas, fotografadas (faces ventral e dorsal) e destinadas ao teste de frio (método do rolo de papel com terra). As plântulas normais, anormais e sementes mortas provenientes do teste de frio foram, também, fotografadas. As imagens obtidas foram disponibilizadas em computador de tal maneira que, examinadas simultaneamente na tela do monitor, pudessem ser buscadas relações de causa e efeito nas imagens anteriores e posteriores ao teste de frio. Os resultados obtidos indicam que o método estudado permite relacionar o dano mecânico com eventuais prejuízos ocasionados ao vigor das sementes de milho.

Análise de imagens na avaliação da qualidade de sementes de milho localizadas em diferentes posições na espiga

A análise de imagens, para avaliar a qualidade de sementes, é um método de precisão que possibilita examinar, com detalhes, a região danificada ou alterada, sua localização e extensão. Por ser um método não destrutivo, as sementes em análise podem ser submetidas a testes fisiológicos e, desta forma, é possível estabelecer as relações de causa e efeito. Assim, a pesquisa teve o objetivo de estudar os efeitos de diferentes posições da semente de milho na espiga, sobre a qualidade, utilizando-se a técnica de análise de imagens. Para tanto, as espigas do cultivar DKB 212 foram debulhadas de maneira que pudessem ser isoladas as sementes das posições proximal, intermediária e distal. As sementes foram caracterizadas fisicamente e avaliadas quanto ao vigor e sanidade. Paralelamente, as sementes foram radiografadas, fotografadas (faces ventral e dorsal) e destinadas ao teste de primeira contagem de germinação; as plântulas normais, anormais e sementes mortas foram, também, fotografadas. Todas as imagens obtidas foram disponibilizadas em computador para serem examinadas simultaneamente e, assim, fazer um diagnóstico completo para cada semente. As sementes das posições proximal e intermediária apresentam qualidade semelhante e superiores às da posição distal; sementes esféricas com eixos embrionários apresentando torções, porém não alterados, não tem sua qualidade diminuída, no entanto as alterações nos eixos embrionários identificados por manchas escuras e sem definição, presentes em maior quantidade na posição distal da espiga, são responsáveis pela redução da qualidade das sementes.

Validação do aplicativo computacional SEEDSOLVE para previsão das perdas de germinação e vigor de sementes armazenadas

Objetivou-se validar o aplicativo computacional SEEDSOLVE para previsão das perdas de germinação e vigor de sementes ortodoxas armazenadas. A validação foi realizada comparando-se valores calculados com valores experimentais das perdas de germinação e vigor de sementes de três cultivares de milho e de soja armazenadas em laboratório, durante um período de 210 dias. Sementes de milho e soja, com três níveis de grau de umidade (11, 13 e 15% para o milho e 9, 11 e 13% para a soja), foram acondicionadas em embalagens de plástico polietileno e armazenadas em câmaras BOD sob três temperaturas (15, 25 e 35ºC). Os resultados das comparações dos dados calculados e experimentais de germinação e vigor durante o armazenamento de sementes dos três lotes de cada espécie, sob diferentes condições de armazenagem, permitiram concluir que o SEEDSOLVE prediz com razoável precisão as perdas de germinação e vigor de sementes de milho e de soja armazenadas.

Développement d'un tandem multicatalytique méthylénation - couplage de Heck et Approche synthétique de l'Hodgsonox

Cette thèse comprend deux parties distinctes, dans lesquelles seront décrits tout d’abord, le développement d’un procédé multicatalytique en un seul pot d’une réaction de méthylénation suivie d’un couplage de Heck, puis dans un second temps, une étude vers la synthèse de l’Hodgsonox. Le premier thème de la thèse correspond à la mise en place d’un procédé en un seul pot, basé sur la méthodologie de méthylénation catalysée par un métal de transition, développée au sein du groupe du Pr. Lebel, et sur des couplages de Heck. Différentes études de compatibilité des réactifs mis en présence sont abordées, ainsi que le choix des conditions optimales (Pd(OAc)2 et P(o-tol)3) pour la réalisation d’un tel système qui ne requiert aucun isolement du produit intermédiaire. Il a été démontré que la présence de triphénylphosphine en excès inhibe la réaction de couplage de Heck, ce qui a finalement orienté notre choix vers les sels de cuivre pour la catalyse de la réaction de méthylénation. Le tandem séquentiel a ensuite été appliqué à la synthèse de divers stilbènes, notamment des composés dérivés du Resvératrol, molécule d’intérêt thérapeutique pour les maladies cardiovasculaires, et à la synthèse d’indanes substitués, avec un couplage intramoléculaire, avec de bons rendements. La deuxième partie de cette thèse traite de l’étude menée vers la synthèse de l’Hodgsonox. Cette molécule correspond à une nouvelle classe de sesquiterpènes tricycliques, comportant un dihydropyrane doté d’une fonction éther diallylique. Cette molécule représente un défi synthétique pour le groupe du Pr. Lebel, qui envisage de synthétiser les deux doubles liaisons terminales au moyen de la méthodologie de méthylénation développée au sein du groupe. L’Hodgsonox, dont la biosynthèse utilise la voie MEP, a un potentiel insecticide pour la croissance de la larve de la mouche verte d’Australie, Lucilia cuprina. La synthèse envisagée au cours de ces travaux est basée sur la formation préalable d’un cycle à 5 chaînons, comportant 3 centres stéréogéniques, puis sur la cyclisation du cycle pyranique au moyen d’une réaction d’insertion dans un lien O H. Un dédoublement cinétique dynamique sur une δ butyrolactone substituée permet de fixer la stéréochimie relative de deux centres chiraux dès la première étape. Le cycle à 5 chaînons est ensuite formé par métathèse après 6 étapes avec un rendement de 37%. Une addition conjuguée suivie d’une réaction de Saegusa et d’une réaction d’hydrosilylation introduit le groupement isopropyle de manière syn. Après mise en place d’un groupement céto-ester, un transfert de groupement diazonium permet de préparer le précurseur pour la réaction d’insertion dans un lien O-H. Le bicycle correspondant à la structure de base de l’Hodgsonox a été préparé au moyen de 16 étapes linéaires avec un rendement global de 12%.

Implication du récepteur aux cannabinoïdes CB2 dans le développement de la voie rétinothalamique

Durant le développement du système visuel, les cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) envoient des axones qui seront influencés par divers signaux guidant leur cône de croissance, permettant ainsi la navigation des axones vers leurs cibles terminales. Les endocannabinoïdes, des dérivés lipidiques activant les récepteurs aux cannabinoides (CB1 et CB2), sont présents de manière importante au cours du développement. Nous avons démontré que le récepteur CB2 est exprimé à différents points du tractus visuel durant le développement du hamster. L’injection d’agonistes et d’agonistes inverses pour le récepteur CB2 a modifié l’aire du cône de croissance et le nombre de filopodes présents à sa surface. De plus, l’injection d’un gradient d’agoniste du récepteur CB2 produit la répulsion du cône de croissance tandis qu’un analogue de l’AMPc (db-AMPc) produit son attraction. Les effets du récepteur CB2 sur le cône de croissance sont produits en modulant l’activité de la protéine kinase A(PKA), influençant la présence à la membrane cellulaire d’un récepteur à la nétrine-1 nommé Deleted in Colorectal Cancer (DCC). Notamment, pour que le récepteur CB2 puisse moduler le guidage du cône de croissance, la présence fonctionnelle du récepteur DCC est essentielle.. Suite à une injection intra-occulaire d’un agoniste inverse du récepteur CB2, nous avons remarqué une augmentation de la longueur des branches collatérales des axones rétiniens au niveau du LTN (noyau lateral terminal). Nous avons également remarqué une diminution de la ségrégation des projections ganglionnaires au niveau du dLGN, le noyau genouillé lateral dorsal, chez les animaux transgéniques cnr2-/-, ayant le gène codant pour le récepteur CB2 inactif. Nos données suggèrent l’implication des endocannabinoïdes et de leur récepteur CB2 dans la modulation des processus de navigation axonale et de ségrégation lors du développement du système visuel.

Caractérisation moléculaire du rôle de facteurs accessoires ArgR et PepA au niveau de la recombinaison spécifique sur le site cer

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA.

Caractérisation structurale et thermodynamique de la reconnaissance du substrat par le ribozyme VS de Neurospora

Les interactions ARN/ARN de type kissing-loop sont des éléments de structure tertiaire qui jouent souvent des rôles clés chez les ARN, tant au niveau fonctionnel que structural. En effet, ce type d’interaction est crucial pour plusieurs processus dépendant des ARN, notamment pour l’initiation de la traduction, la reconnaissance des ARN antisens et la dimérisation de génome rétroviral. Les interactions kissing-loop sont également importantes pour le repliement des ARN, puisqu’elles permettent d’établir des contacts à longue distance entre différents ARN ou encore entre les domaines éloignés d’un même ARN. Ce type d’interaction stabilise aussi les structures complexes des ARN fonctionnels tels que les ARNt, les riborégulateurs et les ribozymes. Comme d’autres ARN fonctionnels, le ribozyme VS de Neurospora contient une interaction kissing-loop importante. Celle-ci est impliquée dans la reconnaissance du substrat et se forme entre la tige-boucle I (stem-loop I, SLI) du substrat et la tige-boucle V (stem-loop V, SLV) du domaine catalytique. Des études biochimiques ont démontré que l’interaction kissing-loop I/V, dépendante du magnésium, implique trois paires de bases Watson-Crick (W-C). De plus, cette interaction est associée à un réarrangement de la structure du substrat, le faisant passer d’une conformation inactive dite unshifted à une conformation active dite shifted. Les travaux présentés dans cette thèse consistent en une caractérisation structurale et thermodynamique de l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme VS, laquelle est formée de fragments d’ARN représentant les tige-boucles I et V dérivées du ribozyme VS (SLI et SLV). Cette caractérisation a été réalisée principalement par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et par titrage calorimétrique isotherme (isothermal titration calorimetry, ITC) en utilisant différents complexes SLI/SLV dans lesquels l’ARN SLV est commun à tous les complexes, alors que différentes variations de l’ARN SLI ont été utilisées, soit en conformation shiftable ou preshifted. Les données d’ITC ont permis de démontrer qu’en présence d’une concentration saturante de magnésium, l’affinité d’un substrat SLI preshifted pour SLV est extrêmement élevée, rendant cette interaction plus stable que ce qui est prédit pour un duplexe d’ARN équivalent. De plus, l’étude effectuée par ITC montre que des ARN SLI preshifted présentent une meilleure affinité pour SLV que des ARN SLI shiftable, ce qui a permis de calculer le coût énergétique associé au réarrangement de structure du substrat. En plus de confirmer la formation des trois paires de bases W-C prédites à la jonction I/V, les études de RMN ont permis d’obtenir une preuve structurale directe du réarrangement structural des substrats SLI shiftable en présence de magnésium et de l’ARN SLV. La structure RMN d’un complexe SLI/SLV de grande affinité démontre que les boucles terminales de SLI et SLV forment chacune un motif U-turn, ce qui facilite l’appariement W-C intermoléculaire. Plusieurs autres interactions ont été définies à l’interface I/V, notamment des triplets de bases, ainsi que des empilements de bases. Ces interactions contribuent d’ailleurs à la création d’une structure présentant un empilement continu, c’est-à-dire qui se propage du centre de l’interaction jusqu’aux bouts des tiges de SLI et SLV. Ces études de RMN permettent donc de mieux comprendre la stabilité exceptionnelle de l’interaction kissing-loop I/V au niveau structural et mènent à l’élaboration d’un modèle cinétique de l’activation du substrat par le ribozyme VS. En considérant l’ensemble des données d’ITC et de RMN, l’étonnante stabilité de l’interaction I/V s’explique probablement par une combinaison de facteurs, dont les motifs U-turn, la présence d’un nucléotide exclu de la boucle de SLV (U700), la liaison de cations magnésium et l’empilement de bases continu à la jonction I/V.