Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Vox Dei:metáfora(s) da espiritualidade

Tese de doutoramento, Belas-Artes (Pintura), Universidade de Lisboa, Faculdade de Belas-Artes, 2014

Griots cosmopolitas : mobilidade e performance de artistas mandingas entre Lisboa e Guiné-Bissau

Tese de doutoramento, Antropologia (Antropologia da Etnicidade e do Político), Universidade de Lisboa, Instituto de Ciências Sociais, 2014

Flesh of the Law: Material Metaphors

Existing legal metaphors, even the predominantly spatial and corporeal ones, paradoxically perpetuate a dematerialized impression of the law. This is because they depict the law as universal, adversarial, and court-based, thus ignoring alternative legalities. Instead, there is a need to employ more radically material metaphors, in line with the material turn in law and other disciplines, in order to allow law's materiality to come forth. I explore the connection between language and matter (the ‘flesh’ of the law) through legal, linguistic, and art theory, and conclude by suggesting four characteristics of material legal metaphors.

TRFS: desenvolvimento de um protótipo para simulação microscópica de tráfego

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Civil na Área de Especialização de Vias de Comunicação e Transportes

HIV-1 drug resistance transmission networks in southwest Switzerland.

To determine viral subtypes and resistance mutations to antiretroviral treatment (ART) in untreated HIV-1 acutely infected subjects from Southwest Switzerland. Clinical samples were obtained from the HIV primary infection cohort from Lausanne. Briefly, pol gene was amplified by nested PCR and sequenced to generate a 1?kb sequence spanning protease and reverse transcriptase key protein regions. Nucleotide sequences were used to assess viral genotype and ART resistance mutations. Blood specimens and medical information were obtained from 30 patients. Main viral subtypes corresponded to clade B, CRF02_AG, and F1. Resistant mutations to PIs consisted of L10V and accessory mutations 16E and 60E present in all F1 clades. The NNRTI major resistant mutation 103N was detected in all F1 viruses and in other 2 clades. Additionally, we identified F1 sequences from other 6 HIV infected and untreated individuals from Southwest Switzerland, harboring nucleotide motifs and resistance mutations to ART as observed in the F1 strains from the cohort. These data reveal a high transmission rate (16.6%) for NNRTI resistant mutation 103N in a cohort of HIV acute infection. Three of the 5 resistant strains were F1 clades closely related to other F1 isolates from HIV-1 infection untreated patients also coming from Southwest Switzerland. Overall, we provide strong evidence towards an HIV-1 resistant transmission network in Southwest Switzerland. These findings have relevant implications for the local molecular mapping of HIV-1 and future ART surveillance studies in the region.

Buying Britney : pop culture icons to cultural brands

This thesis demonstrates that mUSIC stars who attain cultural icon status heavily contribute to the fashion styles of the time. Where as style and music have always had a connection, icons such as Britney Spears are now dictating popular style so much so that music artists are becoming full-fledged fashion designers. While much analysis is devoted to Britney Spears, her largest contributions do not lie in the rise of teenage sexuality, but in establishing music artists as vehicles of consumption. The artists' signature has now become a brand and ~ term "signabrand" has been created to define such a trend. To understand such a shift, a review of past literature devoted to fashion and music, largely consisting of subculture theory is examined, followed by a combination of content analysis, political economy, fashion and postmodem theory to address how music stars attain icon status and guide style.

"I might be a duck, but I'm human" : an analysis of clothing in Disney cartoons

Mickey Mouse, one of the world's most recognizable cartoon characters, did not wear a shirt in his earliest incarnation in theatrical shorts and, for many years, Donald Duck did not wear pants and still rarely does so. Especially when one considers the era in which these figures were first created by the Walt Disney Studio, in the 1920s and 1930s, why are they portrayed without full clothing? The obvious answer, of course, is that they are animals, and animals do not wear clothes. But these are no ordinary animals: in most cases, they do wear clothing - some clothing, at least - and they walk on two legs, talk in a more or less intelligible fashion, and display a number of other anthropomorphic traits. If they are essentially animals, why do they wear clothing at all? On the other hand, if these characters are more human than animal, as suggested by other behavioral traits - they walk, talk, work, read, and so on - why are they not more often fully clothed? To answer these questions I undertook three major research strategies used to gather evidence: interpretive textual analysis of 321 cartoons; secondary analysis of interviews conducted with the animators who created the Disney characters; and historical and archival research on the Disney Company and on the times and context in which it functioned. I was able to identify five themes that played a large part in what kind of clothing a character wore; first, the character's gender and/or sexuality; second, what species or "race" the character was; third, the character's socio-economic status; fourth, the degree to which the character was anthropomorphized; and, fifth, the context in which the character and its clothing appeared in a particular scene or narrative. I concluded that all of these factors played a part in determining, to some extent, the clothing worn by particular characters at particular times. However, certain patterns emerged from the analysis that could not be explained by these factors alone or in combination. Therefore, my analysis also investigates the individual and collective attitudes and desires of the men in the Disney studio who were responsible for creating these characters and the cultural conditions under which they were created. Drawing on literature from the psychoanalytic approach to film studies, I argue that the clothing choices spoke to an idealized fantasy world to which the animators (most importantly, Walt Disney himself), and possibly wider society, wanted to return.

Percy Carruthers Band fonds, 1857-2005, n.d. (non-inclusive)

Percy Carruthers Band was born on November 27, 1892 in Toronto, Ontario to Charles Walter Band, a grain merchant and Jessie Camp Shaw Band. He graduated from Upper Canada College and became a broker. He worked at the Dominion Bank and then at Maple Leaf Milling Company. He was stationed at Port Colborne for a while. Before leaving for the front, he was with Bankers Bond Company of Toronto and is also listed as working with the firm of Bailey, Wood and Cross. Lieutenant Band received a Certificate of Military Qualifications on Dec. 24th, 1914. He received his Certificate of Military Instruction on Nov. 30, 1915. He received these certificates while with the 48th Regiment (Highlanders). He enlisted in 1914 and went overseas in August of 1915 as an officer in the 35th Battalion. By August 26, 1915, he is listed as being with the 23rd Reserve Battalion. A year later, in August of 1916 Lieutenant Band arrived in France and was posted to the 2nd Battalion – “The Second Iron”. In 1916, Band was the victim of shell shock received during a charge. He was wounded in April of 1917 at Vimy Ridge yet he remained on duty. At this time he received a gunshot wound to his right jaw. He earned a promotion to Captain on September 16th, 1917. He was wounded again in November of 1917 at Passchendaele where he suffered a gunshot wound to the ear. For his courage and determination Percy Band received the Military Cross on February 18, 1918. He led his company under difficult circumstances even though he was wounded. He was awarded a bar to the Military Cross for gallantry during a successful attack on two villages on December 2nd, 1918. During this attack he led his company against enemy machine guns. It is said that he displayed exceptional leadership qualities and skill during this time. On the 30th of August in 1918, he made a daring reconnaissance to the front under heavy fire in an attack on Upton Wood. He was also commended on his gallantry during attacks on Cagnicourt and the Canal du Nord in September of 1918. He was awarded the second bar to the Military Cross on February 1, 1919. The award of the Croix de Guerre was conferred on Captain Percy Carruthers Band by the President of the French Republic on December 15th, 1918 for distinguished service rendered during the course of the campaign. His general demobilization took place on April 25, 1919. Percy Band married Margaret Julia Woodruff on November 25, 1919, and they had three children: Charles Woodruff Band (1921), Margaret Elizabeth Band (1924) and Robert DeVeaux Woodruff Band (1927). After the war, Mr. Band was a manager at Geo. Weston Bread and Cakes Limited, St. Catharines. Percy Band was also an avid collector. His collections included antique toys and art. He died suddenly on May 19, 1961. The Toronto Telegram published this about him: “Captain Percy Carruthers Band, M.C. with two Bars, Croix de Guerre with Palm – was an officer whose buoyant spirit and gallantry mirrored the vibrant soul of the Battalion. Blythe of heart, yet endowed with a fine sense of responsibility, he gave inspired leadership of No. 3 Company.”

Le statut ontologique de la dunamis chez Aristote

Ce mémoire a pour tâche de déterminer le statut ontologique de la puissance chez Aristote. Pour ce faire, il est d’abord question, dans le premier chapitre, de bien définir les deux sens de la puissance, soit la puissance motrice et l’état potentiel. Nous expliquons aussi alors les multiples sens de la puissance motrice et les multiples types de la puissance que sont la nature, l’âme et l’art. Ensuite, le second chapitre étudie les liens entre l’état potentiel et la matière, d’une part, et les liens entre le non-être, la puissance et la possibilité, d’autre part. Enfin, le troisième chapitre explicite la hiérarchie ontologique aristotélicienne pour en dégager le statut ontologique de la puissance par rapport à l’acte. Cela est fait de trois manières : selon l’antériorité de l’acte sur la puissance au sein d’une substance unique ; selon l’antériorité des êtres éternels, notamment celle du premier moteur, sur les êtres générables et corruptibles ; l’antériorité du bien en acte sur le bien puissance.

Une esthétique hyperréaliste en littérature? : narrativité picturale et langage visuel dans l'œuvre romanesque de Suzanne Jacob (1991-2005)

Ce mémoire s'attarde à la notion d'hyperréalisme en littérature contemporaine et à son incarnation spécifique dans trois romans de Suzanne Jacob : L'Obéissance (1991), Rouge mère et fils (2001) et Fugueuses (2005). Le recours à la théorie et à l'histoire de la peinture est essentiel puisque l'hyperréalisme est d'abord endossé par l'art pictural. De plus, la peinture, la photographie, le cinéma, la musique, la télévision, la sculpture, l'architecture et la littérature sont autant de médiations fortement présentes dans le roman hyperréaliste. Cette présence multiple des médias est essentielle au caractère hyperréaliste d'une œuvre ; la tentative d'intégrer le réel passe par un détour représentationnel. Les manifestations stylistiques et narratives de l'hyperréalisme sont associées à l'intégration de formes empruntées à d'autres arts ou médias comme la fugue et le fait divers. Les effets de l'hyperréalisme sur la narration se manifestent également par un éclatement des focalisations, en témoignent la fragmentation narrative ainsi que l'importance accordée au détail. Enfin, l'hyperréalisme joue sur une tension constante entre continuité et rupture. Les conséquences sont à envisager dans une sorte d'appréhension du réel, tant par le personnage que par le roman, qui doivent composer avec une multiplicité de représentations.

L’apport du capital social, familial, personnel et délinquant à l’explication de la relation entre alcool, drogues et violence chez les jeunes

Cette étude s’inscrit dans le cadre plus large des travaux menés par le groupe de recherche Drug, Alcool and Violence International (DAVI) qui cherche à préciser la nature des liens qui se tissent entre l’alcool, les drogues et la violence chez trois groupes de jeunes - étudiants, décrocheurs, contrevenants - des villes de Montréal, Toronto, Philadelphie et Amsterdam. Elle explore plus spécialement les dimensions du capital social, familial, individuel et délinquant comme étant des voies d’explication possibles de la relation constatée entre la consommation d’alcool et de drogues et la manifestation de gestes de violence chez les jeunes de la grande région montréalaise fréquentant le milieu scolaire secondaire. Trois objectifs spécifiques de recherche sont poursuivis soit : 1) déterminer, à travers une recension des écrits scientifiques, les modalités formant les dimensions du capital social, familial, individuel et délinquant; 2) cerner empiriquement dans les données, quelles sont les modalités à disposition permettant de rendre compte de la contribution du capital social, du capital familial, du capital individuel et du capital délinquant dans l’explication de la relation alcool/drogues et violence chez les jeunes; et 3) vérifier si les dimensions à l’étude influencent a) la consommation par les jeunes d’alcool et de drogues; b) la manifestation par eux de comportements délinquants, et plus spécialement de comportements violents, et c) la relation entre alcool, drogues et violence chez les jeunes fréquentant le milieu scolaire secondaire montréalais en fonction de ces dimensions. L’échantillon de type aléatoire est composé de 995 répondants (garçons et filles ) qui se répartissent dans huit écoles secondaires francophones et deux écoles secondaires anglophones provenant des secteurs public ou privé et de milieu favorisé ou défavorisé se trouvant sur les territoires des villes de Montréal, Laval et Longueuil constituant « la grande région de Montréal ». Les participants devaient répondre à un questionnaire composé de 138 questions dont la grande majorité sont fermées. Les données sociodémographiques caractérisant le jeune et son environnement, ses rapports avec sa famille, ses amis, l’école, son quartier, sa consommation d’alcool et de drogues, l’existence dans sa vie de comportements violents dont il aurait été auteur ou victime, la manifestation de gestes de délinquance ou de troubles de comportement sont les principales dimensions de la vie du jeune sondées par le questionnaire utilisé. D’entrée de jeu, spécifions que peu importe les substances consommées, très peu d’étudiants en font un usage problématique et que l’on ne note aucune propension à la délinquance chez la majorité des élèves de l’échantillon En somme, les analyses amènent à conclure à l’existence de relations statistiquement significatives entre la consommation d’alcool, de marijuana et de drogues dures et la propension à la délinquance et aux troubles de comportement, ces relations étant de force variable allant de modérée à forte. Toutefois, il faut bien noter que ces relations ne touchent qu’un petit nombre des élèves du secondaire participant à notre étude, comme ce fût le cas dans d’autres études. Plus spécifiquement, le capital familial paraît influencer seulement la consommation de marijuana. Ainsi, plus le degré de supervision parentale diminue, plus la fréquence de consommation de marijuana augmente. Le capital individuel produit un impact plus important sur la consommation d’alcool, de marijuana et de drogues dures, les troubles de comportement, et la propension à la délinquance. Ainsi, plus le capital individuel est affecté négativement, plus la consommation d’alcool, de marijuana et de drogues dures de même que la propension à la délinquance et aux troubles de comportement seront importants. Le capital social, quant à lui, explique davantage la consommation de marijuana que la consommation d’alcool et de drogues dures ou encore la manifestation de troubles de comportement et la propension à la délinquance. Finalement, le capital délinquant paraît influencer la consommation d’alcool, de marijuana et de drogues dures. Son influence se fait ressentir également, mais dans une moindre mesure, sur la manifestation de troubles de comportement et la propension à la délinquance. À notre grande surprise, la dimension du capital familial qui se révèle être particulièrement influente dans les écrits scientifiques ne ressort pas dans nos analyses comme nous l’avions envisagé. Nous attribuons cet état de fait aux limites imposées par l’utilisation d’une banque de données constituée initialement à d’autres fins que celles visées dans notre étude, et dans laquelle les facteurs reliés au capital familial, identifiés dans les écrits, n’étaient pas tous présents. Nul doute à que la consommation de substances psychoactives et la propension à la délinquance et aux troubles de comportement sont des comportements présents dans la population juvénile. Les modèles généralement utilisés pour expliquer les comportements déviants à l’étude ne produisent pas de résultats probants en ce qui concerne les écoliers, une population de jeunes d’ailleurs rarement étudiée à cet égard. Le modèle d’explication au cœur de nos analyses, mettant à contribution les dimensions du capital social, familial, individuel et délinquant, paraît prometteur surtout en ce qui concerne le capital délinquant, et ce, en dépit des limites imposées par la banque de données utilisée. À la lumière des résultats obtenus, il semble que l’explication de la cooccurrence de la consommation de substances psychoactives et de la propension à la délinquance et aux troubles de comportement soit multifactorielle. Les principaux facteurs contributifs sont ceux du capital délinquant pour la consommation d’alcool, de marijuana et de drogues dures de même que pour la propension à la délinquance alors les troubles de comportement se révèlent davantage expliqués par les facteurs composant le capital individuel. Nous estimons que la combinaison des dimensions du capital familial, individuel, social et individuel constitue une voie d’explication prometteuse de la relation alcool/drogue et violence chez les jeunes. Il nous apparaît dès lors qu’un instrument de collecte de données spécifiquement conçu pour en explorer le potentiel explicatif devrait être à la base de prochaines recherches en ce sens.

Scénarios d’aveuglement dans la littérature d’Orhan Pamuk, d’Ernesto Sábato, et de José Saramago

Scénarios d’aveuglement dans la littérature d’Orhan Pamuk, d’Ernesto Sábato, et de José Saramago analyse trois œuvres importantes de trois auteurs contemporains : Mon nom est Rouge d’Orhan Pamuk ; « Rapport sur les aveugles » du roman Héros et tombes d’Ernesto Sábato ; et L’aveuglement de José Saramago. Malgré leurs différences, ces romans ont des points communs évidents, synthétisés dans la figure de l’aveuglement. Cette figure signale l’avènement, dans les textes, d’un régime de connaissance alternatif, centré moins sur le primat de la raison et du visuel que sur une nouvelle capacité cognitive, basée sur une logique spéciale du destin. L’aveuglement s’ouvre également sur une nouvelle compréhension de l’histoire, grâce à une capacité du récit de fiction qui passe par le point de fuite de la cécité. Pour Pamuk, l’aveuglement est le couronnement paradoxal d’une vision du monde, gravement mise en crise à la fin du XVIe siècle par le perspectivisme et le réalisme de la Renaissance, la voie d’entrée vers un monde imaginal qui n’est plus accessible à l’imaginaire occidental. Pour Sábato, il représente la variante renversée d’une quête de l’absolu qui passe par les antres de l’inceste, de l’enfer et du crime, tandis que le monde décrit par Saramago est un monde qui sombre sur la pente de la déchéance, en suivant une logique implacable. Il est l’équivalent de plusieurs formes de cécité qui menacent le monde contemporain, comme le fondamentalisme religieux, l’homogénéité préconisée par la société de masse, l’exclusion raciale, l’oppression idéologique. La thèse se divise en trois parties, La violente beauté du monde, Un mythe hérétique de la caverne et Une épidémie à cause inconnue, chacune d’entre elles analysant l’œuvre d’un auteur, mais établissant également des liens avec les autres chapitres. L’approche adoptée est interdisciplinaire, un croisement entre études littéraires, philosophie et histoire de l’art. Dans leur quête de nouveaux concepts et de nouvelles formes de pensée qui s’écartent du modèle rationnel dominant de la modernité, les trois auteurs partent de la présupposition que regarder les choses n’est pas du tout l’équivalent de voir les choses. Ils tentent d’articuler une logique du voir qui ressemble plutôt à la vision et à la clairvoyance qu’à la conformité logique. La figure de l’aveuglement sert de tremplin vers le monde imaginal (Pamuk), la pensée magique (Sábato) et la vision dystopique (Saramago) – des espaces ontologiquement différents où les auteurs mènent leurs attaques contre la rationnalité à tout prix. C’est précisément ces espaces que nous avons choisi d’explorer dans les trois romans. Nous soutenons également que ces trois textes proposent un nouveau régime de « connaissance » qui met en question les règles de pensée héritées de la Renaissance et surtout des Lumières, qui constituent un discours dominant dans la culture visuelle et philosophique moderne.