Design of bio-inspired ionic liquids for protein stabilisation

Ionic Liquids (ILs) consist in organic salts that are liquid at/or near room temperature. Since ILs are entirely composed of ions, the formation of ion pairs is expected to be one essential feature for describing solvation in ILs. In recent years, protein - ionic liquid (P-IL) interactions have been the subject of intensive studies mainly because of their capability to promote folding/unfolding of proteins. However, the ion pairs and their lifetimes in ILs in P-IL thematic is dismissed, since the action of ILs is therefore the result of a subtle equilibrium between anion-cation interaction, ion-solvent and ion-protein interaction. The work developed in this thesis innovates in this thematic, once the design of ILs for protein stabilisation was bio-inspired in the high concentration of organic charged metabolites found in cell milieu. Although this perception is overlooked, those combined concentrations have been estimated to be ~300 mM among the macromolecules at concentrations exceeding 300 g/L (macromolecular crowding) and transient ion-pair can naturally occur with a potential specific biological role. Hence the main objective of this work is to develop new bio-ILs with a detectable ion-pair and understand its effects on protein structure and stability, under crowding environment, using advanced NMR techniques and calorimetric techniques. The choline-glutamate ([Ch][Glu]) IL was synthesized and characterized. The ion-pair was detected in water solutions using mainly the selective NOE NMR technique. Through the same technique, it was possible to detect a similar ion-pair promotion under synthetic and natural crowding environments. Using NMR spectroscopy (protein diffusion, HSQC experiments, and hydrogen-deuterium exchange) and differential scanning calorimetry (DSC), the model protein GB1 (production and purification in isotopic enrichment media) it was studied in the presence of [Ch][Glu] under macromolecular crowding conditions (PEG, BSA, lysozyme). Under dilute condition, it is possible to assert that the [Ch][Glu] induces a preferential hydration by weak and non-specific interactions, which leads to a significant stabilisation. On the other hand, under crowding environment, the [Ch][Glu] ion pair is promoted, destabilising the protein by favourable weak hydrophobic interactions , which disrupt the hydration layer of the protein. However, this capability can mitigates the effect of protein crowders. Overall, this work explored the ion-pair existence and its consequences on proteins in conditions similar to cell milieu. In this way, the charged metabolites found in cell can be understood as key for protein stabilisation.

Impact of genetic SLC28 transporter and ITPA variants on ribavirin 21 serum level, hemoglobin drop and therapeutic response in patients with HCV infection

Background: T reatment o f chronic hepatitis C i s evolving, a nd direct acting antivirals ( DAAs) are now a dded to p egylated interferon-α ( Peg- INF-α) and ribavirin (RBV) for the treatment o f hepatitis C v irus ( HCV) genotype 1 infection. DAAs c ause d ifferent side effects and can even worsen RBV induced hemolytic anemia. T herefore, identifying host genetic d eterminants of R BV bioavailability and therapeutic e fficacy will remain crucial for individualized treatment. Recent d ata showed associations between R BV induced h emolytic anemia and genetic polymorphisms o f concentrative nucleoside transporters s uch as C NT3 (SLC28A3) and i nosine t riphosphatase (ITPA). T o analyze t he association of genetic variants of SLC28 transporters and ITPA with RBV induced hemolytic anemia and treatment o utcome. Methods: I n our study, 173 patients f rom t he S wiss Hepatitis C C ohort Study and 2 2 patients from Swiss Association for the Study of the Liver study 24 (61% HCV g enotype 1, 3 9% genotypes 2 o r 3) were analyzed for SLC28A2 single nucleotide p olymorphism (SNP) rs11854484, SLC28A3 rs56350726 and SLC28A3 rs10868138 as well as ITPA SNPs rs1127354 and rs7270101. RBV serum levels during treatment were measured in 49 patients. Results: SLC28A2 r s11854484 genotype TT was associated with significantly higher dosage- and body weight-adjusted RBV levels as compared to genotypes TC and CC (p=0.04 and p=0.02 at weeks 4 and 8, respectively). ITPA SNPs rs1127354 and rs7270101 were associated with h emolytic a nemia both in genotype as w ell as i n allelic a nalyses. SLC28A3 rs56350726 genotype TT (vs. AT/AA, RR=2.1; 95% CI 1.1-4.1) as well as the T allele (vs. A; RR=1.8, 95% CI 1.1-3.2) were associated with increased SVR rates. The combined analysis of overall ITPA activity and SLC28 v ariants together revealed n o significant a dditive effects on either treatment-related anemia or SVR. Conclusions: T he newly identified association between RBV serum levels a nd SLC28A2 rs11854484 genotype as well as the replicated association of ITPA and SLC28A3 g enetic p olymorphisms w ith RBV induced hemolytic anemia and treatment r esponse underpin the need for further studies on host genetic d eterminants of R BV bioavailability and therapeutic e fficacy f or individualized treatment of chronic hepatitis C.

Vaniprevir with pegylated interferon alpha-2a and ribavirin in treatment-naïve patients with chronic hepatitis C: a randomized phase II study.

Vaniprevir (MK-7009) is a macrocyclic hepatitis C virus (HCV) nonstructural protein 3/4A protease inhibitor. The aim of the present phase II study was to examine virologic response rates with vaniprevir in combination with pegylated interferon alpha-2a (Peg-IFN-α-2a) plus ribavirin (RBV). In this double-blind, placebo-controlled, dose-ranging study, treatment-naïve patients with HCV genotype 1 infection (n = 94) were randomized to receive open-label Peg-IFN-α-2a (180 μg/week) and RBV (1,000-1,200 mg/day) in combination with blinded placebo or vaniprevir (300 mg twice-daily [BID], 600 mg BID, 600 mg once-daily [QD], or 800 mg QD) for 28 days, then open-label Peg-IFN-α-2a and RBV for an additional 44 weeks. The primary efficacy endpoint was rapid viral response (RVR), defined as undetectable plasma HCV RNA at week 4. Across all doses, vaniprevir was associated with a rapid two-phase decline in viral load, with HCV RNA levels approximately 3 log(10) IU/mL lower in vaniprevir-treated patients, compared to placebo recipients. Rates of RVR were significantly higher in each of the vaniprevir dose groups, compared to the control regimen (68.8%-83.3% versus 5.6%; P < 0.001 for all comparisons). There were numerically higher, but not statistically significant, early and sustained virologic response rates with vaniprevir, as compared to placebo. Resistance profile was predictable, with variants at R155 and D168 detected in a small number of patients. No relationship between interleukin-28B genotype and treatment outcomes was demonstrated in this study. The incidence of adverse events was generally comparable between vaniprevir and placebo recipients; however, vomiting appeared to be more common at higher vaniprevir doses. CONCLUSION: Vaniprevir is a potent HCV protease inhibitor with a predictable resistance profile and favorable safety profile that is suitable for QD or BID administration.

L'Écho de Paris

1900/11/02 (Numéro 6000).

Protocole ou formulaire rédigé sous Louis XI par GEOFFROY DAVIER.

Contient : 1° d'un tableau fait par MICHEL DE BIGUE du produit de différentes sommes par le nombre des jours de l'année : « Une picte par jour fait par an VII S. VII d. picte... » ; 2° d'une série de poésies ; 3° Table des chapitres de la seconde partie du formulaire ; I Première partie. Actes de Charles VII et de Louis XI, rois de France, ainsi que de Louis XII, duc d'Orléans ; « Sequuntur nomina archiepiscopatuum et episcopatuum ab eis suffraganeorum in regno Francie et ejus metis existentium » ; « Instructions abregées touchant le stille de parlement, et de la manière de procéder en iceluy » ; « Qui sont les pers de France et quelles prerogatives ilz ont » ; « Desquelles causes la court de parlement a acoustumé de congnoistre » ; « Quelz sont les droiz royaulx » ; « Des cas especiaulx dont la court laye congnoist à l'encontre des gens d'eglise contre droit commun » ; « Des causes d'appel et de la manière de la poursuite d'icelles en la court de parlement » ; « Des deffaulx en cas d'appel et quel prouffit ilz emportent » ; « De la manière et du temps de renoncer aux appellacions interjectées en parlement » ; « Des causes en cas de nouvelleté » ; « Autres notables du stille de parlement » ; « S'ensuivent aucunes notes et enseignemens touchant les offices de notaire et secretaire du roi nostre sire » ; « Avalument des escus à la raison de XXXV grans blancs de XI deniers tournois, qui sont XXXII sols 1 denier tournois, pour escu. — Et premièrement : demy escu vault XVI sols obole tournois... » ; « Autre avalument des escus de XXXIII sols tournois pièce, qui sont de XXXVI grans blans de XI deniers tournois. — Et premièrement : demy escu dudict pois, XVI S. VI d.... » ; « Autre avalument de livres tournois à escus de XXXII S. 1 denier tournois pièce. — Et premièrement : une livre [vault] XX sols tournois... » ; II Deuxième partie ; Actes de Louis XI, roi de France, et de Louis XII, duc d'Orléans et roi de France ; « Respitz » : — « Respit à ung an » (fol. 28 v°) ; — « Idem, in latino » ; — « Respit à cinq ans » ; — « Idem, in latino » (fol. 29 r°) ; — « Dispensacio prelati » [lettre d'un archevêque de Bourges, primat d'Aquitaine] ; — « Respit à deux ans contre usuriers » ; — « Respit à trois ans, pour gens d'eglise » ; — « Contre-respit, en latin ». (fol. 29 v° ; « Hommaiges et souffrances » : — « Hommaige » ; — « Serment de feaulté » (fol. 30 r°) ; — « Idem, in latino » ; — « Souffrance de faire hommaige et bailler denombrement » ; — « Souffrance de bailler denombrement seulement » ; — « Souffrance de non admortir » (fol. 30 v°) ; — « Souffrance de paier rachapt et autres devoirs » [CHARLES, duc d'ORLEANS, au gouverneur du duché d'Orléans, entre 1418 et 1422] ; — « Souffrance, en latin, d'amortir » [lettre de LOUIS XI pour les prévôt, chantre et chapitre de l'église métropolitaine de Tours et les chapelains de Sainte Catherine, dans la même église, « datum Tholose, XIIII augusti »] (fol. 31 r°) ; — « Mandement pour descharges perdues » ; — « Mandement pour asseoir certain argent en ung pays ou recepte, oultre le paiement des gens de guerre et autres deniers, hors Languedoc, et pour Guienne, là où il n'y a point d'esleuz » ; « Pris de sel » [les conseillers du roi sur le fait de ses finances aux grenetier et contrôleur du grenier à sel de Château Gontier, 1482]; — « Autre pris de sel » ; « Les noms des élections de ce royaume » ; « Les greniers de ce royaume » ; Extraits des « ordonnances faictes sur le cours des monnoyes, faictes au Plessis du Parc », le 15 déc. 1475 ; « Confiscation » ; « Congiez et aides » ; « Pension » de 3000 liv. tourn à la princesse de Navarre, Madeleine de France, soeur de Louis XI, épouse de Gaston-Phoebus, prince de Viane ; « Offices » ; « Retenues » ; « Commission pour la charge d'oultre Seine, touchant la continuacion de la creue de IIII l. t. sur chacun muy de sel » ; « Papier du paiement des lances, creues et fraiz mis sus en l'année commançant en janvier 1477, et finissant l'an revolu 1478 » ; « Offices et confirmacions » ; « Office de conseillier et maistre des comptes vaccant par mort et soubz condicion » [en faveur d'Étienne Chevalier, contrôleur de la recette générale des finances, en remplacement de feu Robert Malien] (fol. 112 v°) ; — « Don d'argent deu à feu Jaques Cueur » [remise à Théaulde de Valpargue, bailli de Lyon, d'une somme de cent écus d'or qu'il devait à Jacques Coeur, et que Jehan Briçonnet, commis à tenir le compte des biens dudit Jacques Coeur en Languedoil, s'efforçait de recouvrer] ; — « Acquict pour ung receveur ordinaire pour certains deniers des confiscacions par lui baillez au roy nostre sire, ou à son certain mandement » [Lettre de LOUIS XI aux trésoriers de France, leur ordonnant de faire remettre par Guillaume Gombault, vicomte de Rouen, à Guillaume de Varye, valet de chambre dudit roi et commis à son argenterie, un fermaillet provenant des biens du duc de Bedford, et acquis au roi par droit de confiscation, après la conquête de la Normandie, lequel fermaillet, valant 1200 livres tournois, le roi veut garder par devers lui, pour servir à son plaisir] (fol. 113 r°) ; — « Acquict pour deniers ou joyaulx baillez au roy pour faire ses plaisirs et voulentez » [lettre relative à la même affaire] ; — « Mandement adressant à messeigneurs des comptes, pour faire allouer ès comptes [de maître Jehan Bourdin, receveur des tailles et aides en Poitou] certaines sommes de deniers autresfoys tauxées par le roy » (fol. 113 v°) ; — « Mandement adressant à messr des comptes, afin qu'ilz alouent ou compte d'un receveur général [du pays de Languedoc et duché de Guyenne, maître Etienne Petit], 6000 livres tournois assignées par le roy » à son argentier Jacques Coeur, et puis diminuées de 1380 It. pour son premier écuyer de corps et maître de son écurie (fol. 114 r°) ; — « Lectre de pas à seel placqué pour ung marchant » [en faveur de Balsarin de Tiez, armurier du roi, qui avait reçu ordre de se transporter de Tours à Bourges] ; — « Forme de saufconduit pour ennemiz » [lettre de JEAN, bâtard D'ORLEANS, comte de Longueville] (fol. 116 r°) ; « Retenue et pension de cappitaine de cent lances » [en faveur de Louis de Joyeuse, à qui le roi baille la charge de cent lances, tenue auparavant par Pierre de Comberel, chevalier Sr de L'Isle, aux gages de XX l. t. pour chacune lance fournie, par mois] (fol. 117 v°) ; — « Declaracion de biens ». [Acte de Louis XI en faveur de Philippe de Montmorency, veuve de Charles de Melun] ; — « Autre charge de cent lances » [tenue par Joachim Coningham, qui en est déchargé en faveur d'un Sr d'Aubigny, aux gages de XX s. t., pour chacune lance fournie, par mois] (fol. 118 r°) ; — Acte de Louis XI portant : « Commission pour signer comme secretaire au fait des finances » [pour Germain de Marle, aux lieu et place de Macé Picot, aux gages de douze sous parisis par jour] (fol. 118 v°) ; — « Vicariat bien espécial » [LOUIS XI donne au connétable de Saint-Pol plain pouvoir de conférer au nom du roi toutes les prébendes, etc., qui vaqueront à la collation de l'évêque de Laon] ; — « Vicariat » [LOUIS XI, après la mort de René, roi de Sicile, duc de Bar, donne aux gens de la chambre des comptes à Bar-le-Duc plein pouvoir de pourvoir Claude Merlin des premières chanoinies et prébendes qui vaqueront dans les églises de Saint-Pierre et Saint-Macé de Bar-le-Duc] ; — « Don des fruitz d'une regalle, et povoir de pervoir aux benefices, durant la regalle » [en faveur de l'évêque d'Angoulême Raoul Du Fou, à qui LOUIS XI octroie tous les fruits, etc., du temporel de l'évêché d'Évreux, devenu vacant] (fol. 120 r°) ; — « Don de folles enchières » (fol. 120 v°) ; — « Congié de marchander à ung officier, et quictance de ce qu'il avoit marchandé avant l'octroy » ; — « Tauxation » en faveur de maître Denis de Bidaut, receveur general des finances, Jehan de La Loere, Jehan Maignan et Jacques Picot, pour leurs peines et travaux d'avoir fait l'assiette des deniers du paiement des gens de guerre ès jugeries de Rivière-Verdun (fol. 121 r°) ; — « Accroissement de gaiges d'un office d'esleu » [en faveur de l'élu de Dreux] ; — « Assiete de IIIe l. de rente » [sur le domaine de Normandie, en faveur de Jehan Colle, natif d'Angleterre, qui était venu fixer sa résidence en France] (fol. 121 v°) ; — « Union de plusieurs foys et hommaiges en ung » [LOUIS XI joint les seigneuries de l'île de Ré et de Marant, que Louis de La Trémoïlle, Sr de Sully et comte de Benon, tenait à foy et hommage, au comté de Benon] ; — « Octroy à porter les armes de France » [à Ludovic Sforza le Maure « au dedans des armes que lui et ses prédecesseurs ont acoustumé de porter » (fol. 122 r°) ; — « Pour descharge perdue » [en faveur de Nicole Tilhart, receveur des VIIIes, assises et équivalent aux aides]. 1472 ; « S'ensuit les noms des cappitaines des gens de guerre de l'ordonnance du roy nostre sire, estans soubz les charges de deux tresoriers des guerres », Denis Le Breton et Guillaume de La Croix ; Formulaire de confession

Resoluciones Cámara de Comercio de Bogotá

Doctrina

Hydration, conformational states and kinetics of yeast hexokinase PII /

The kinetic study of the coupled enzymatic reaction involving monomeric yeast hexokinase PII (HK) and yeast glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) yields a Michaelis constant of 0.15 ± 0.01 mM for D-glucose. At pH 8.7 HK is present in monomeric form. The addition of polyethylene glycol (PEG), to the reaction mixture increased the affinity of HK for glucose, independent ofMW of the PEG from 2000 to 10000. The osmotic stress exerted by PEG can be used to measure the change in number of water molecules that accompany enzyme conformational changes (Rand, et al., 1993). Results indicate that the G-6-PDH is not osmotically sensitive and thus, the change in the number of PEG-inaccessible water molecules (ANw) measured in the coupled reaction is only the difference between the glucose-bound and glucosefree conformations of HK. ANw ~ 450 with PEGs of MW > 2000 under conditions for both binding (Reid and Rand, 1997) and kinetic assays. The contribution water may play in the binding of ATP (Km = 0.24 + 0.02 mM) has also been examined. It was found that in this case ANw = (for osmotic pressures < 2.8x10* dynes/cm^), suggesting no additional numbers of waters are displaced when ATP binds to HK. Osmotic pressure experiments were also performed with dimeric HK. It was determined that both the monomeric and dimeric forms of HK give the same ANw under low pressures. If this large ANw is due to conformational flexibility, it would appear that the flexibility is not reduced upon dimerization ofthe enzyme.

The influence of water on the glucose affinity of hexokinase

In the present thesis, the role of hydration during the glucose induced conformational change of hexokinase is investigated. This is accomplished by applying the osmotic stress technique. The osmotic stress technique is founded on varying of the activity of water in a system in order to determine ifs effects. This is accomplished by adding inert solute molecules that are excluded from the system under study. The solute molecules used within the present investigation are Polyethylene glycols (PEGs). PEGs aid in the removal of water from hexokinase by exerting osmotic pressure. The osmotic pressures of the PEG solutions are also measured with both vapour pressure osmometry and secondary osmometry with phospholipids. An interesting discovery is made in that the osmotic pressures of PEG and co-solute solutions are non-additive. This indicates that PEG concentrates co-solutes in solution by making a certain proportion of the water inaccessible. Glucose binding was measured fluorometrically and the glucose equilibrium dissociation constant (GEDC) of hexokinase is measured in solutions containing the different MW PEGs. Changes in the sensitivity of the glucose affinity with osmotic pressure allows the calculation of the change in the numbers of polymer-inaccessible water molecules upon the binding of glucose to hexokinase ~Nw. It was determined the ~Nw decreases with increases in osmotic pressure in the presence of all MW PEGs. ~Nw decreases from values between 45-290 water molecules at low pressure to approximately 15 at high pressure. There is also a molecular weight dependence observed. There are large decreases in ~Nw with osmotic pressure in the presence of PEGs above MW 1000. However, below MW 1500 changes in ~Nw with osmotic pressure are relatively small. These findings are interpreted with respect to two possible mechanisms involving changes in the conformation of hexokinase u~der osmotic pressure and the access of the PEG molecules to water surrounding hexokinase.

Proposal for Construction of Brock’s Monument, Queenston, newspaper fragment, 1824

Brock’s Monument is owned by Parks Canada and maintained by the Niagara Parks Commission in collaboration with the Friends of Fort George and Niagara National Historic Sites. It is located in Queenston Heights Park atop the Niagara Escarpment. On March 14, 1815, Parliament passed an act to erect a monument to the memory of General Isaac Brock. A design by engineer Francis Hall was selected. He envisioned a 135 ft. tall Tuscan column, made out of stone with a winding staircase inside. By the spring of 1824, work had begun on the monument. In June of that year, the cornerstone was laid and William Lyon Mackenzie was in attendance at the ceremony. It was on October 13th, 1824 (the anniversary of Brock’s death) that 6000 people traveled to Queenston to inter the remains of Brock and Lieutenant-Colonel Macdonell. This was the second burial for both. After 3 years the tower had reached 135 feet, but there was no inscription at the base, the fence around the observation deck had not been installed and there was no statue of Brock. Hall submitted a plan to finish the statue, but he was turned down and a simple ornament was placed where the Brock statue should have been. A massive blast of gunpowder destroyed the monument in 1840. It is alleged that an American sympathizer with the Upper Canada Rebellion set off the blast. Brock and Macdonell’s bodies were reburied in the Hamilton Family Cemetery in Queenston. The present monument was rebuilt in 1853. William Thomas (designer of St. Michael’s Cathedral in Toronto) was the architect. Brock and Macdonell were once again laid to rest in separate vaults at the statue. In 1968, Brock’s Monument was declared a national historical site. In 2005, it was closed to the public due to safety concerns, but it reopened in 2010. Source: http://www.thecanadianencyclopedia.com/articles/brocks-monument-queenston-heights

Towards Evaluating and Modelling the Impacts of Mobile-Based Augmented Reality Applications on Learning and Engagement

Mobile augmented reality applications are increasingly utilized as a medium for enhancing learning and engagement in history education. Although these digital devices facilitate learning through immersive and appealing experiences, their design should be driven by theories of learning and instruction. We provide an overview of an evidence-based approach to optimize the development of mobile augmented reality applications that teaches students about history. Our research aims to evaluate and model the impacts of design parameters towards learning and engagement. The research program is interdisciplinary in that we apply techniques derived from design-based experiments and educational data mining. We outline the methodological and analytical techniques as well as discuss the implications of the anticipated findings.

By-Law No. 56

The by-law reads: "Be it enacted as a By-Law of the Ontario Grape Growing & Wine Manufacturing Company Limited that the Directors be and they are hereby authorized to make application to the lieutenant-Governor of the Province of Ontario, for issuance of Supplementary letters Patent providing for, 1) Changing the name of the said Company to Barnes Wines, Limited. 2) The Management of the affairs of the Company by a Board of 7 Directors. 3) Re-dividing the Capitol Stock of the Company from 60 shares of par value of $500.00 each, to 6000 shares of par value of $5.00 each. Passed this 5th day of February A.D. 1934."

Prevalencia de enfermedad periodontal crónica en pacientes de 35 a 70 años del área metropolitana de Monterrey. Clínicas 2, 15, 26, 28 y 35 del IMSS.

Tesis (Maestría en Ciencias Odontológicas con especialidad en Periodoncia) UANL, 2014.

Polymeric micelles as versatile carriers for drugs and nucleic acids

Le cancer est la principale cause de mortalité au Canada. Les taxanes (e.g. le paclitaxel et le docétaxel (DCTX)) constituent des remèdes efficaces contre une série de tumeurs solides telles que les cancers du sein, du poumon et de l’ovaire. Par ailleurs, des acides nucléiques (e.g. les oligonucléotides antisens (AON) ou les petits ARN interférents (siRNAs)), capables de supprimer sélectivement certains oncogènes impliqués dans la carcinogénèse, sont actuellement étudiés pour traiter une large gamme de cancers. Bien que l’activité des taxanes et des acides nucléiques soit bien établie sur des modèles humains et/ou animaux, plusieurs aspects physico-chimiques et cliniques restent encore à améliorer. Leur solubilité limitée (pour les taxanes), leur dégradation rapide dans le sang (pour les acides nucléiques), leur élimination précoce, leur absence de sélectivité et leur toxicité envers les tissus sains sont les principaux facteurs limitant leur efficacité. C’est pourquoi de nombreux efforts ont porté sur l’élaboration de systèmes de vectorisation ciblés à base de polymères, dans le but de surmonter les problèmes associés aux thérapies actuelles. Dans cette thèse, deux types de micelles polymères ont été développés pour la vectorisation de DCTX et d’acides nucléiques. D’une part, des micelles de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(oxyde de butylène/styrène) ont été étudiées pour la première fois pour solubiliser le DCTX et le protéger de l’hydrolyse. Ces polymères se sont révélés moins toxiques que le surfactant utilisé commercialement pour solubiliser le DCTX (i.e. polysorbate 80) et ont permis une libération prolongée du principe actif. D’autre part, deux systèmes différents de micelles polyioniques (PICM) ont été mis au point pour la vectorisation d’acides nucléiques. De nouveaux conjugués de poly(éthylène glycol) (PEG)-oligonucléotide ont été proposés pour la protection et la libération contrôlée d’AON. Lorsque ces conjugués ont été formulés avec des dendrimères de poly(amidoamine) (PAMAM), des complexes de taille homogène ont été obtenus. Ces PICM ont permis de prolonger la libération de l’AON et de le protéger efficacement contre la dégradation enzymatique. De plus, des polymères de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(méthacrylate de propyle-co-acide méthacrylique) ont été incorporés afin de conférer des propriétés acido-sensibles aux PICM. Dans ces micelles, formées de ce dernier polymère formulé avec le dendrimère PAMAM, des oligonucléotides (AON et siRNA) ciblant l’oncogène Bcl-2 ont été encapsulés. L’internalisation cellulaire fut assurée par un fragment d’anticorps monoclonal (Fab’) situé à l’extrémité de la couronne de PEG. Après l’internalisation cellulaire et la protonation des unités d’acide méthacrylique sous l’effet de l’acidification des endosomes, les micelles se sont affranchies de leur couronne. Elles ont ainsi exposé leur cœur composé d’acide nucléique et de dendrimère PAMAM, qui possède une charge positive et des propriétés endosomolytiques. En effet, ces PICM acido-sensibles ciblées ont permis d’augmenter la biodisponibilité des acides nucléiques vectorisés et se sont avérées plus efficaces pour silencer l’oncoprotéine Bcl-2 que les micelles non ciblées ou que le dendrimère de PAMAM commercial seul. Finalement, les nanovecteurs polymères présentés dans cette thèse se révèlent être des systèmes prometteurs pour la vectorisation des anticancéreux et des acides nucléiques.

Systèmes vésiculaires colloïdaux pour la vectorisation de la 1-β-D-arabinofuranosylcytosine

La 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) demeure l’agent anticancéreux principalement utilisé dans le traitement de la leucémie myéloblastique aiguë (LMA), malgré sa dégradation et son élimination rapide après une administration parentérale. Son encapsulation dans des vecteurs pharmaceutiques, majoritairement des liposomes, a permis de surmonter ces inconvénients. L’objectif général de ce projet de doctorat était de développer deux systèmes à libération prolongée, à base de phospholipides, de cholestérol et de poly(éthylène glycol) (PEG) afin d’encapsuler l’ara-C et ultimement, d’améliorer son efficacité dans le traitement de la LMA. Des Sphérulites® (vésicules multilamellaires d’un type particulier) ont d’abord été étudiées pour leur forte capacité d’encapsulation, due à leur mode de préparation. Par la suite, une formulation liposomale capable, d’une part de cibler spécifiquement les cellules leucémiques et, d’autre part, de promouvoir la libération intracellulaire de l’ara-C grâce à sa sensibilité au pH, a été mise au point. Les deux formulations se devaient d’avoir un faible diamètre, une stabilité en présence de fluides biologiques et des temps de circulation prolongés chez l’animal. Une préparation de Sphérulites®, composée de Phospholipon 90G, de Solutol HS15 et de cholestérol, a permis d’obtenir des vésicules de 300 nm de diamètre. Un dérivé lipidique de PEG a pu être fixé à leur surface, sans modifier la disposition concentrique des lamelles, ni changer leur stabilité. Les Sphérulites® PEGylées ont été chargées d’ara-C et injectées chez le rat par la voie intraveineuse. Elles ont démontré des temps de circulation significativement prolongés comparativement aux Sphérulites® sans PEG. Cependant, l’ara-C s’est retrouvée éliminée de la circulation sanguine très rapidement, révélant une libération précoce du principe actif à partir de ces vésicules. Les liposomes sensibles au pH (~150 nm) ont été obtenus suite à l’insertion d’un copolymère à base de dioctadécyle, de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique. L’anticorps anti-CD33, soit complet soit son fragment Fab’, a été fixé à la surface des liposomes afin de cibler les cellules leucémiques. Les essais in vitro ont démontré la spécificité de la formulation pour différentes cellules leucémiques (CD33+), sa stabilité en présence de protéines plasmatiques et la libération intracellulaire d’un marqueur fluorescent et de l’ara-C. Enfin, des études menées chez la souris saine et immunodéprimée inoculée de cellules HL60 ont montré que la formulation exposant le fragment Fab’ possédait un profil pharmacocinétique et une biodistribution semblables à ceux des liposomes contrôles non-ciblés. L’encapsulation de l’ara-C a permis d’améliorer grandement ses temps de circulation après une administration intraveineuse. Cependant, bien que les immunoliposomes ont permis de prolonger la survie des souris leucémiques comparativement à l’ara-C libre, l’addition du polymère sensible au pH n’a pas permis d’apporter de réel avantage à la formulation lorsque administrée in vivo. Les résultats obtenus dans ce travail de thèse ont, dans un premier temps, mis en évidence que les Sphérulites® pourraient s’avérer utiles dans la vectorisation d’agents anticancéreux si leur capacité à retenir le principe actif in vivo était améliorée. Dans un second temps, les données présentées avec les immunoliposomes suggèrent qu’ils pourraient apporter un bénéfice notable dans le traitement de la LMA.