In vitro evaluation of the odontogenic potential of mouse undifferentiated pulp cells

The aim of this study was to evaluate the odontogenic potential of undifferentiated pulp cells (OD-21 cell line) through chemical stimuli in vitro. Cells were divided into uninduced cells (OD-21), induced cells (OD-21 cultured in supplemented medium/OD-21+OM) and odontoblast-like cells (MDPC-23 cell line). After 3, 7, 10 and 14 days of culture, it was evaluated: proliferation and cell viability, alkaline phosphatase activity, total protein content, mineralization, immunolocalization of dentin matrix acidic phosphoprotein 1 (DMP1), alkaline phosphatase (ALP) and osteopontin (OPN) and quantification of genes ALP, OSTERIX (Osx), DMP1 and runt-related transcription factor 2 (RUNX2) through real-time polymerase chain reaction (PCR). Data were analyzed by Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U tests (p<0.05). There was a decrease in cell proliferation in OD-21 + OM, whereas cell viability was similar in all groups, except at 7 days. The amount of total protein was higher in group OD-21 + OM in all periods; the same occurred with ALP activity after 10 days when compared with OD-21, with no significant differences from the MDPC-23 group. Mineralization was higher in OD-21+OM when compared with the negative control. Immunolocalization demonstrated that DMP1 and ALP were highly expressed in MDPC-23 cells and OD-21 + OM cells, whereas OPN was high in all groups. Real-time PCR revealed that DMP1 and ALP expression was higher in MDPC-23 cell cultures, whereas RUNX2 was lower for these cells and higher for OD-21 negative control. Osx expression was lower for OD-21 + OM. These results suggest that OD-21 undifferentiated pulp cells have odontogenic potential and could be used in dental tissue engineering.

In vitro organogenesis of Eucalyptus grandis: effects of boron and calcium

The in vitro organogenesis of woody species plays an essential role in the improvement of forest products by providing saplings with high commercial value. Furthermore, mineral nutrition plays an important role in the induction of organogenic responses. The objective of this study was to evaluate the effects of boron and calcium in the organogenesis of nodal segments from seedlings of Eucalyptus grandis growing under in vitro conditions. The concentration of boron and calcium in MS medium was modified to induce organogenic responses in 45-day-old nodal segments used as explants. After 60 days, the fresh weight, dry weight, ratio of fresh and dry weight, relative water content and relative matter content accumulated by the explants were evaluated. The concentrations of boron and calcium in the culture medium influenced the in vitro organogenic control of Eucalyptus grandis. Reduced combinations of boron and calcium induced callus formation and dry matter accumulation in the explants. A boron concentration of 100% (1.10 mg L-1) combined with 100% (119.950 mg L-1) and 200% (239.900 mg L-1) of calcium, and 200% (2.20 mg L-1) of boron combined with 100% (119.950 mg L-1) of calcium allowed the induction of well-developed buds, which can be used for the regeneration of micro-plants.

Identifizierung und Charakterisierung cis regulatorischer Elemente des humanen Gens für Keratin 20 in vitro und im transgenen Mausmodell

ZusammenfassungKeratin 20 (K20) ist ein Intermediärfilament, das als Strukturelement in den Epithelien des Intestinaltrakts und den Merkelzellen der Haut exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene K20 Expressionsvektoren generiert, mit denen regulatorische Elemente des humanen Gens für K20 charakterisiert wurden. Analysiert wurde der Bereich von –4,8 kb bzw. –21,5 kb bis 12,9 kb vom Transkriptionsstart. Die Vektoren, welche die Sequenz von –21,5 kb bis 12,9 kb umfassten, konnten die Expression des EGFP Reportergens in HT-29 Zellen signifikant steigern. Zwei Enhancer-Elemente zwischen –21,5 und –18,4 kb bzw. –18,4 und –14,9 kb verstärkten die Expression der Reporterkonstrukte in vitro signifikant. Die Analyse der Vektoren in transgenen Mäusen zeigte, dass diese das Transgen gewebespezifisch exprimieren. Mit dem Bereich von –4,8 kb bis 12,9 kb ließ sich transgenspezifische mRNA Expression in intestinalen Geweben mittels RT-PCR nachweisen. Die Verwendung der Sequenz von –21,5 kb bis 21,8 kb steigerte die Expression in vivo nicht weiter.Für die gewebespezifische Expression des K20 Vektors reicht die 4,8 kb 5´upstream Sequenz aus, der Bereich bis –21,5 kb verstärkt die Expression in vitro, allerdings fehlen für die starke gewebespezifische Expression von Transgenen in vivo noch weitere Kontrollelemente.

Etablierung einer Ko-Kultur von Alveolarepithel und mikrovaskulärem Endothel als in-vitro-Modell einer humanen respiratorischen Einheit

Ziel der Promotionsarbeit war die Etablierung einer humanen respiratorischen Einheit in vitro zur Untersuchung von Wirkmechanismen einer akuten Lungenschädigung. Als Ko-Kulturmodell wurde eine Kultur humaner Alveoloarepithelzellen vom Typ II (A549, NCI H441, primäre hATII Zellen) mit mikrovaskulären Endothelzellen (ISO-HAS-1, primäre HPMEC) auf den beiden Seiten einer mikroporösen Filtermembran (Bilayer) gewählt. Ein differenzierter Monolayer von NCI H441 konnte in Bilayer-Ko-Kultur mit ISO-HAS-1 oder HPMEC durch die Zugabe von Dexamethason (1 µM) unter Verwendung eines serumhaltigen Mediums induziert werden. Dabei wurde eine von Tag 10 bis Tag 12 phänotypisch stabile Ko-Kultur mit TER-Werten um 500 Ohm x cm2 erhalten. Im Hinblick auf die Freisetzung von IL-8 und MCP-1 und die fehlende Freisetzung von RANTES nach Stimulation waren NCI H441 den hATII Zellen ähnlicher als die häufig als hATII-analog eingesetzte Zell-Linie A549, die RANTES freisetzte. Außerdem bildeten A549 trotz zahlreicher Variatione

Phytoremediation by poplar: polyphenols polyamines and oxidative damage in the response to heavy metals in in vitro and in hydroponic cultures.

Poplar is considered a good candidate for phytoremediation, but its tolerance to heavy metals has not been fully investigated yet. In the present work, two different culture systems (in vitro and aeroponic/hydroponic) and two different stress tolerant clones of Populus alba (AL22 and Villafranca) were investigated for their total polyphenol and flavonoid content, individual phenolic compounds, polyamine, lipid peroxidation and hydrogen peroxide levels in response to Cu. In AL22 poplar plants cultured in vitro in the presence or absence of 50 μM Cu, total leaves polyphenol and flavonoid content was higher in treated samples than in controls but unaltered in the roots. Equally the same clone, grown under aeroponic conditions and hydroponically treated for 72 h with 100 μM Cu, displayed increased amount of polyphenols and flavonoids in the leaves, in particular chlorogenic acid and quercetin, and no differences in the roots. In exudates from treated roots total polyphenols and flavonoids, in particular catechin and epicatechin, were more abundant than in controls. Polyamine levels show an increase in conjugated putrescine (Put) and spermidine (Spd) was found. In the Villafranca clone, treated with 100 μM Cu for 6, 24 and 72 h, the pattern of polyphenol and flavonoid accumulation was the same as in AL22; in Cu-treated roots these compounds decreased compared with controls while they increased in root exudates. Free polyamine levels rose at 24 and 72 h while only conjugated Put increased at 24 h. Cu-treated Villafranca plants exhibited a higher malondialdehyde production than controls indicative of membrane lipid peroxidation and, therefore, oxidative stress. An in vitro experiment was carried to investigate the antioxidant effect of the polyamine spermidine (Spd). Exogenous Spd, supplied together with 100 μM Cu, reduced the accumulation of polyphenols and flavonoids, MDA and hydrogen peroxide induced by Cu.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Toward a 3D in vitro model based on decellularized thymus to maintain adult thymic ephitelial cells functionality

During my PhD,I have been develop an innovative technique to reproduce in vitro the 3D thymic microenvironment, to be used for growth and differentiation of thymocytes, and possible transplantation replacement in conditions of depressed thymic immune regulation. The work has been developed in the laboratory of Tissue Engineering at the University Hospital in Basel, Switzerland, under the tutorship of Prof.Ivan Martin. Since a number of studies have suggested that the 3D structure of the thymic microenvironment might play a key role in regulating the survival and functional competence of thymocytes, I’ve focused my effort on the isolation and purification of the extracellular matrix of the mouse thymus. Specifically, based on the assumption that TEC can favour the differentiation of pre-T lymphocytes, I’ve developed a specific decellularization protocol to obtain the intact, DNA-free extracellular matrix of the adult mouse thymus. Two different protocols satisfied the main characteristics of a decellularized matrix, according to qualitative and quantitative assays. In particular, the quantity of DNA was less than 10% in absolute value, no positive staining for cells was found and the 3D structure and composition of the ECM were maintained. In addition, I was able to prove that the decellularized matrixes were not cytotoxic for the cells themselves, and were able to increase expression of MHC II antigens compared to control cells grown in standard conditions. I was able to prove that TECs grow and proliferate up to ten days on top the decellularized matrix. After a complete characterization of the culture system, these innovative natural scaffolds could be used to improve the standard culture conditions of TEC, to study in vitro the action of different factors on their differentiation genes, and to test the ability of TECs to induce in vitro maturation of seeded T lymphocytes.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Microglial involvement in brain physiopathology: in vitro studies using rat primary cultures

Microglial involvement in neurological disorders is well-established, being microglial activation not only associated with neurotoxic consequences, but also with neuroprotective effects. The studies presented here, based on microglia rat primary cell cultures and mainly on microglial conditioned medium (MCM), show insights into the mechanism of Superoxide dismutase 1 (SOD1) and Apolipoprotein E (ApoE) secretion by microglia as well as their neuroprotective effect towards primary cerebellar granule neurons (CGNs) exposed to the dopaminergic toxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA). SOD1 and ApoE are released respectively through non-classical lysosomal or the classical ER/Golgi-mediated secretion pathway. Microglial conditioned medium, in which SOD1 and ApoE accumulated, protected CGNs from degeneration and these effects were replicated when exogenous SOD1 or ApoE was added to a non-conditioned medium. SOD1 neuroprotective action was mediated by increased cell calcium from an external source. ApoE release is negatively affected by microglia activation, both with lipopolysaccharide (LPS) and Benzoylbenzoyl-ATP (Bz-ATP) but is stimulated by neuronal-conditioned medium as well as in microglia-neurons co-culture conditions. This neuronal-stimulated microglial ApoE release is differently regulated by activation states (i.e. LPS vs ATP) and by 6-hydroxydopamine-induced neurodegeneration. In co-culture conditions, microglial ApoE release is essential for neuroprotection, since microglial ApoE silencing through siRNA abrogated protection of cerebellar granule neurons against 6-OHDA toxicity. Therefore, these molecules could represent a target for manipulation aimed at promoting neuroprotection in brain diseases. Considering a pathological context, and the microglial ability to adopt a neuroprotective or neurotoxic profile, we characterize the microglial M1/M2 phenotype in transgenic rats (McGill-R-Thy1-APP) which reproduce extensively the Alzheimer’s-like amyloid pathology. Here, for the first time, cortical, hippocampal and cerebellar microglia of wild type and transgenic adult rats were compared, at both early and advanced stages of the pathology. In view of possible therapeutic translations, these findings are relevant to test microglial neuroprotection, in animal models of neurodegenerative diseases.

Generierung und Charakterisierung von in-vitro- und in- vivo-Modellsystemen zur Untersuchung des Skelettsystems

Die Entstehung und Aufrechterhaltung von Knorpel- und Knochengewebe wird durch eine Vielzahl von hemmenden oder fördernden Faktoren hoch komplex reguliert, wobei die dabei involvierten physiologischen Prozesse bisher nur teilweise verstanden werden. Auch die Ursachen sowohl degenerativer Erkrankungen, aber auch durch Mutationen im FGFR3-Gen verursachter Chondrodysplasien sind in ihrer Ätiopathogenese noch nicht vollständig erforscht. In dieser Arbeit wurden verschiedene experimentelle Ansätze verfolgt, die zur weiteren Aufklärung der Pathophysiologie zweier unterschiedlicher Skeletterkrankungen beitragen sollten.rnEin relevantes Charakteristikum der degenerativen Gelenkserkrankung Osteoarthrose ist der Verlust an Aggrekan, hauptverantwortlich verursacht durch die Aggrekanase ADAMTS5. Es wurde ein Tiermodell generiert, bei dem gezielt mittels des Tet-ON-Systems die Aggrekanase mAdamts-5 überexprimiert werden kann. Nach Konstruktherstellung und Generierung als auch Charakterisierung des in vitro-Modells wurde das Tiermodell hergestellt, um die Folgen der Überexpression im Hinblick auf einen verstärkten Aggrekanabbau im Knorpel der Mäuse zu analysieren. Nach initialer Charakterisierung auf Induzierbarkeit zeigte eine Gründerlinie eine induzierbare transgene mAdamts5-Expression. Die Überprüfung auf Knorpelspezifität zeigte, sowohl embryonal als auch im adulten Tier, dass sich der verwendete, zusammengesetzte Kollagen-Typ II Promotor wie der endogene verhielt und somit funktional war. Nach Doxyzyklininduktion wurde bei der optimalen Dosis von 1 mg/ml im Vergleich zum induzierten Wildtyp-Tier eine 15%ige Abnahme des Gesamt-Glykosamino-glykan(GAG)-Gehaltes und eine um 120% erhöhte GAG-Abgabe ins Medium detektiert, was eine verstärkte Spaltung von Aggrekan bedeutete. Die transgene Aggrekanase wurde überexprimiert und spaltete verstärkt Aggrekan. Da aufgrund der histologischen Untersuchungen jedoch keine Knorpelerosionen feststellbar waren, konnte im Umkehrschluss gefolgert werden, dass der Knorpel einen Verlust an Glykosaminoglykanen bis zu einer gewissen Grenze tolerieren kann. Mit dem generierten und charakterisierten Tiermodell konnte mit dem Verlust an GAG eine Osteoarthrose-ähnliche Situation simuliert werden, insbesondere im Hinblick auf frühe Stadien der Erkrankung, bei denen noch keine makroskopisch eindeutig sichtbare Knorpelerosionen vorliegen. rnIm zweiten Teil der Arbeit wurden Zellkulturexperimente zur weiteren Aufklärung FGFR3-regulierter Prozesse durchgeführt. Nach Generierung und Verifizierung der stabilen Zelllinien, die mittels des Tet-ON-Systems das FGFR3-Gen mit jeweils einer Chondrodysplasie-assoziierten Mutation (Achondroplasie-Mutation G380R, Thanatophore Dysplasie Typ II-Mutation K650E) induzierbar überexprimieren, wurden die Auswirkungen der zwei verschiedenen Mutationen anhand bereits beschriebener Signalwege untersucht. Über die Rekrutierung des ERK-Signalweges konnte bei beiden Zelllinien die Funktionalität nachgewiesen werden, wobei die Zelllinie mit der einen schwereren Phänotyp beim Menschen verursachenden TDII-Mutation eine stärkere Aktivierung zeigte. Bei der Aktivierung von STAT1 wies nur die TDII-Zelllinie eine Phosphorylierung auf, nicht jedoch die ACH-Zelllinie; dies deckte sich mit bereits publizierten Untersuchungen. Beide Kaskaden zeigten eine unterschiedliche Signalantwort aufgrund der verschiedenen Mutationen. Des Weiteren konnte eine unterschiedliche MMP13-Zielgenexpression nachgewiesen werden, wobei lediglich die ACH-Zelllinie eine erhöhte MMP13-Expression (6-fach) zeigte. Zur Identifizierung neuer involvierter FGFR3-Zielgene wurde die differentielle Genexpression der TDII-Zelllinie im Vergleich induziert/nicht induziert mittels Microarray-Hybridisierung untersucht. Als interessantes Zielgen fiel STC1 auf, welches ebenfalls eine Rolle in der Chondrogenese spielt und bislang nicht mit FGFR3 in Verbindung gebracht wurde. Es konnte jedoch nur auf RNA-Ebene eine Regulation nachgewiesen werden. Nachfolgend durchgeführte transiente Experimente zeigten, dass die Wildtyp-Variante von FGFR3 möglicherweise eine Funktion in der Sekretion des Proteins STC1 hat und dass durch die beiden eingefügten Mutationen (ACH, TDII) diese aufgehoben ist. Der Einfluss von FGFR3 auf die Sekretion von STC1 stellt ein neues Ergebnis dar, insbesondere auch die Auswirkungen der beiden für die unterschiedlichen Krankheitsbilder stehenden Mutationen. Welche Relevanz allerdings die STC1-Sekretion im Rahmen FGFR3-assoziierter Erkrankungen hat, kann nicht eindeutig beurteilt werden. Weitere Faktoren aus dem hoch komplexen Zusammenspiel während der Knorpel/Knochenentwicklung müssen untersucht werden, um eine definitive Einordnung zu ermöglichen.

Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Bone-implant interface. Evaluation of osteoblastic cells behavior on nanopatterned titanium surfaces: an in vitro analysis

Protein-adsorption occurs immediately following implantation of biomaterials. It is unknown at which extent protein-adsorption impacts the cellular events at bone-implant interface. To investigate this question, we compared the in-vitro outcome of osteoblastic cells grown onto titanium substrates and glass as control, by modulating the exposure to serum-derived proteins. Substrates consisted of 1) polished titanium disks; 2) polished disks nanotextured with H2SO4/H2O2; 3) glass. In the pre-adsorption phase, substrates were treated for 1h with αMEM alone (M-noFBS) or supplemented with 10%-foetal-bovine-serum (M-FBS). MC3T3-osteoblastic-cells were cultured on the pre-treated substrates for 3h and 24h, in M-noFBS and M-FBS. Subsequently, the culture medium was replaced with M-FBS and cultures maintained for 3 and 7days. Cell-number was evaluated by: Alamar-Blue and MTT assay. Mitotic- and osteogenic-activities were evaluated through fluorescence-optical-microscope by immunolabeling for Ki-67 nuclear-protein and Osteopontin. Cellular morphology was evaluated by SEM-imaging. Data were statistically analyzed using ANOVA-test, (p<0.05). At day3 and day7, the presence or absence of serum-derived proteins during the pre-adsorption phase had not significant effect on cell-number. Only the absence of FBS during 24h of culture significantly affected cell-number (p<0.0001). Titanium surfaces performed better than glass, (p<0.01). The growth rate of cells between day3 and 7 was not affected by the initial absence of FBS. Immunolabeling for Ki-67 and Osteopontin showed that the mitotic- and osteogenic- activity were ongoing at 72h. SEM-analysis revealed that the absence of FBS had no major influence on cell-shape. • Physico-chemical interactions without mediation by proteins are sufficient to sustain the initial phase of culture and guide osteogenic-cells toward differentiation. • The challenge is avoiding adsorption of ‘undesirables’ molecules that negatively impact on the cueing cells receive from surface. This may not be a problem in healthy patients, but may have an important role in medically-compromised-individuals in whom the composition of tissue-fluids is altered.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur für immuntherapeutische Ansätze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antikörpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antikörper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabhängige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabhängig von der T-Zellrezeptorspezifität sowie kostimulatorischen Molekülen und allein abhängig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Moleküle (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu können, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner hämatopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- Mäuse führte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter Mäuse in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers ebenfalls konzentrationsabhängige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte Mäuse keine messbare Abstoβungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erhöhte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verfügte die verwendete Melanomzelllinie über eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein noduläres Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erhöhte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe ermöglichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antikörpern möglicherweise gesteigert werden. rn

Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn

Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in-vitro-differenzierten Folgelinien

Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre große Plastizität ein immenses Potential für die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der großen Röhrenknochen vor und können zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Veränderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen müssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist für das Verständnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nächsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe Ähnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfügbar ist. Primärkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgeführt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur („alte MSC“), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und für nachfolgende Experimente wo nötig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Färbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, während die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab für die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, für die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklären in zukünftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe Ähnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen für eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am stärksten exprimierten Gene jeder Zelllinie ließen sich für junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulären Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstärkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschließender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik unterstützt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zusätzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Für Adipozyten konnte mit Genen des „Jak-STAT signaling pathway“, der Fokalen Adhäsion, sowie Genen des „Cytokine-cytokine receptor interaction pathway“ sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedürfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als für die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell äußerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung möglich sind. Als Grundlage für nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermöglichen, könnten künftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgeführt werden. Zudem wären weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollständigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wünschenswert.