Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Dinâmica do fósforo no solo em função da adição de ácidos orgânicos de baixa massa molar

A baixa eficiência da adubação fosfatada em solos altamente intemperizados é devido, entre outros fatores, à adsorção do fósforo (P) à superfície das argilas silicatadas do tipo 1:1 e, principalmente, dos (hidr)óxidos de Fe e de Al. Manejos do solo que induzem a solubilização de formas de P indisponíveis para as plantas têm sido intensamente estudados nos últimos anos. Uma tentativa de aumentar a concentração de P disponível na solução do solo para sua absorção pelas plantas é a mobilização de P por ânions de ácidos orgânicos de baixa massa molar (AOBMM). Ânions derivados de AOBMM exsudados pelas raízes de plantas ou excretados por microrganismos são associados com algumas condições de rizosfera como deficiência de P e fitotoxidez de Al e interagem com o solo de forma a aumentar a biodisponibilidade de P. Dependendo dos atributos do solo, do grau de dissociação, das propriedades e do número de grupos carboxílicos dos ânions orgânicos, o P pode ser mobilizado do solo principalmente devido à dissolução complexométrica de minerais e à adsorção competitiva dos grupos funcionais carboxílicos e fosfato nos sítios de superfície coloidais. A capacidade dos ânions citrato, malato e oxalato em mobilizar P de amostras de um Neossolo Quartzarênico típico (RQ) e de um Latossolo Vermelho ácrico (LVwf) foi avaliada por meio de um estudo de lixiviação de ânions em colunas. Devido a não detecção de P nos efluentes das colunas com LVwf, foi realizado outro estudo em colunas, no qual somente citrato foi lixiviado, mas num volume maior, e as alterações das formas de P nas amostras desse solo induzidas pela lixiviação de citrato foram identificadas por espectroscopia de absorção de raios-X na borda K do fósforo (X-ray absorption near edge structure -XANES - spectroscopy). A capacidade dos ânions de AOBMM em solubilizar P foi mais dependente do teor de P disponível e de outros atributos do solo que do número de grupos funcionais carboxílicos dos ânions orgânicos. Somente o oxalato mobilizou P do RQ, enquanto todos os ânions de AOBMM foram capazes de mobilizar P do LVwf. Quando baixos volumes de solução contendo ânions de AOBMM foram lixiviados no solo, além do aumento do pH, a mobilização de P foi acompanhada pela mobilização de Al no RQ (pH água = 5), e pela mobilização de Ca no LVwf (pH água = 5.6), o que indica solubilização de P pela complexação de Al, Ca, ou Fe, de fosfatos insolúveis, ou pela inibição da precipitação de P com esses metais. Ao lixiviar um volume maior de citrato no LVwf, o P também não foi detectado nos efluentes das colunas, mas houve lixiviação intensa de Al e Fe, bem como mudanças nas proporções de formas de P no solo caracterizadas pelos espectros XANES. Embora tenhamos encontrado indícios da ação dos principais mecanismos de solubilização de P (dissolução complexométrica de minerais e troca de ligantes entre grupos funcionais carboxílicos e P adsorvido ao solo), os ânions de AOBMM mostraram pouco potencial de efetivamente aumentar a biodisponibilidade de P.

Avaliação de massa e rugosidade superficial de pastilhas de Ti-6Al-4V com aplicação de nanopartículas de prata submetidos ao teste de escovação

Este estudo teve por objetivo avaliar a variação da massa e rugosidade de pastilhas de Ti-6Al-4V com e sem aplicação superficial de nanopartículas de prata coloidal (BSafe®) de dimensões 1,5 cm; 0,5 cm e 0,2 cm, submetidas à teste de escovação e imersão pelo período experimental de 10 anos. No teste de escovação, quinze espécimes de Ti-6Al-4V (TE), quinze com B-Safe® (BE) e quinze de PMMA (PE) como controle foram subdivididos em três condições de escovação: dentifrício comum (DC), dentifrício experimental (DE) e controle com água destilada (H2O) por 200 mil ciclos em máquina de escovação. Os resultados foram submetidos ao teste ANOVA a 2 critérios (condição de escovação e ciclos) e teste de Tukey (α=0,05) para comparações múltiplas. Foi observada variação de massa apenas quando a condição de escovação foi DC nos espécimes do grupo PE e TE. Houve diferença estatisticamente significante nos valores da variação de rugosidade no grupo TE e PE quando a condição de escovação foi DC; no grupo BE, houve diferença quando a condição foi DC e DE, porém em DE houve redução dos valores médios. No teste de imersão, objetivando analisar a ação dos dentifrícios sem o atrito das cerdas, seis espécimes de Ti-6Al-4V (TI) e seis com B-Safe® (BI) foram subdivididos em três condições de imersão: DC, DE e H2O pelo período de 244 horas. Os resultados foram submetidos ao teste t de student pareado. Não foi observada diferença estatística entre as variações de massa e rugosidade de nenhum dos corpos de prova após o teste. Complementar aos ensaios, foi realizado um protocolo de desinfecção com terapia fotodinâmica com azul de metileno pelo período de 4 semanas nos espécimes escovados. Após todos os testes, foi realizada espectrometria de energia dispersiva de raios-X (EDS) para caracterização dos elementos químicos presentes nos espécimes, onde não se observou variações. Os resultados sugerem que o DE é mais indicado para utilização com implantes, enquanto DC apresenta um poder abrasivo capaz de danificar a superfície do Ti-6Al- 4V. Não foi observado nenhum indício de corrosão em nenhum grupo testado.

Avaliação do efeito de diferentes concentrações de fotoiniciadores em propriedades mecânicas e na cor de um adesivo dental experimental

O presente trabalho teve por foco prover uma revisão de conceitos relacionados às resinas dentais fotopolimeráveis e, também, analisar como diferentes concentrações de fotoiniciadores de uso comum em odontologia podem influenciar no desempenho mecânico e na cor de resinas dentais. Concentrações de 0,01%, 0,10%, 0,25% 0,50%, 0,75%, 1,00% e 10% em massa de fotoiniciador foram adicionadas em uma matriz polimérica composta por TEGDMA/BisGMA 50%/50% em massa de forma que, fixando variáveis externas referentes à fonte de luz e à preparação das amostras, foi possível avaliar o efeito da concentração de fotoiniciador nas propriedades mecânicas de resistência à fratura por compressão, resistência à fratura pela aplicação de tensão diametral e dureza Barcol. Por fim, o efeito da concentração na cor aferida através do método CIELab foi investigada. Os fotoiniciadores utilizados foram o Irgacure® 819, a 1-fenil-1,2-propanodiona (PPD) e a Canforoquinona a qual foi utilizada juntamente com ocoiniciador Etil-4 dimetilaminobenzoato (EDB) na concentração constante de 1% em massa. Os resultados mecânicos e de cor foram comparados entre as diferentes amostras através de análises estatísticas (ANOVA) e, especificamente para cor, o parâmetro de diferença de cor (ΔE) foi interpretado verificar se as alterações observadas são perceptíveis ao olho humano. Para fundamentar os estudos, análises do espectro de absorção das amostras, do espectro de irradiação da fonte de luz e do grau de conversão das amostras foram realizadas. Os resultados revelaram que, independentemente do fotoiniciador, graus de conversão da mesma ordem de grandeza de um adesivo comercial foram obtidos, porém as velocidades de reação foram diferentes (maior velocidade para as amostras de CQ e menor para PPD). Curvas características foram obtidas para os espectros de absorção e de irradiação confirmando, pela sobreposição das curvas, que a fonte de luz é efetiva para iniciação da polimerização das amostras. As análises de resistência à fratura revelaram que a quebra catastrófica do material ocorrerá preferencialmente quando a força é aplicada ao longo do diâmetro para os corpos de prova preparados. Quanto à dureza, verificou-se que que para a CQ houve um máximo, para Irgacure um comportamento assintótico com aumento da concentração e, para a PPD, não foi possível a obtenção de amostras (verificado que a PPD necessita de tempo de irradiação superior ao convencionalmente utilizado na prática odontológica). Os testes de ANOVA permitiram verificar que o Irgacure é capaz de fornecer resultados mecânicos semelhante em relação à CQ ocasionando, em contrapartida, um menor escurecimento e amarelamento. Analisando o parâmetro ΔE, confirmou-se que a alteração na cor se torna evidente à medida que ocorre o aumento da concentração de fotoiniciador independentemente do fotoiniciador utilizado, porém a alteração é maior para a CQ.

Efeito da adição de amido resistente de milho e enzimas sobre as propriedades da massa de pão e as propriedades físicas do pão de forma.

O amido resistente de milho (ARM) não é digerido em humanos fornecendo benefícios para a saúde tais como redução do colesterol, do índice glicêmico e fermentação no cólon. Porém, a substituição parcial de farinha de trigo (FT) por ARM em massa de pão resulta na diluição do glúten prejudicando a qualidade do produto. Massa de pão foi produzida com 12,5 g/100g de ARM e os efeitos das enzimas glicose-oxidase (Gox), tranglutaminase (TG) e xilanase (HE) na massa foram estudados. Massa produzida sem ARM e sem enzimas foi considerada padrão e massa produzida com ARM e sem enzimas foi considerada controle para comparação. Uma metodologia foi desenvolvida para medir o torque durante o amassamento em grande escala, utilizando um reômetro dinâmico adaptado. As propriedades reológicas foram avaliadas nos testes de medidas descritivas de textura, adesividade Chen-Hoseney, extensão uniaxial Kieffer, extensão biaxial e testes oscilatórios em reômetro. Pão produzido de acordo com as formulações padrão, controle e ótima foi avaliado com relação ao volume específico (VEP), firmeza do miolo, cor e análise sensorial para o atributo preferência. As três enzimas testadas influenciaram positivamente o torque máximo atingido durante o amassamento que variou entre (8,36 e 9,38) N m. Gox e TG apresentaram efeito positivo na altura máxima desenvolvida pela massa medida em reofermentógrafo enquanto que o efeito da HE foi negativo. Uma formulação com ARM e enzimas apresentou desempenho de panificação similar a massa padrão (altura máxima ajustada igual a (45,5 ± 3,9) mm), correspondente a adição de (4, 2,5 e 0,5) mg/100g de TG, Gox e HE respectivamente (ótima). A formulação ótima apresentou adesividade, trabalho de adesão, coesividade, dureza, resiliência, resistência à extensão e extensibilidade similares a massa padrão e diferentes da massa controle. As enzimas aumentaram o índice de strain hardening reduzido pela adição de ARM. Para o pão de forma, o VEP variou entre (3,16 e 3,64) cm3/g (diferença não significativa) e o pão produzido com a formulação ótima foi o mais escolhido como preferido. Durante o armazenamento por até 7 dias, o ARM diminuiu a taxa de envelhecimento do pão enquanto que as enzimas apresentaram efeito oposto. Em geral, a substituição parcial de FT por ARM reduziu a elasticidade da massa diminuindo a qualidade do pão enquanto que as enzimas minimizaram esse efeito.

Utilização de metanol, etanol e metano como doadores de elétrons para a desnitrificação

Esta tese apresenta e discute os dados obtidos a partir de trabalho experimental projetado para avaliar comparativamente o desempenho de reatores desnitrificantes em batelada, tendo etanol, metanol e gás metano como doadores de elétrons. Os experimentos foram realizados em reatores em escala de bancada. Os ensaios com gás metano objetivaram verificar a efetividade deste sub-produto de reatores anaeróbios em substituir os doadores exógenos de elétrons comumente utilizados, tais como metanol e etanol. Para alcançar o objetivo principal deste trabalho, os parâmetros cinéticos de desnitrificação, para os doadores de elétrons ensaiados, foram determinados nas diferentes condições operacionais. Além disso, as alterações ocorridas na população microbiana, ao longo do período experimental, foram avaliadas em relação à diversidade microbiana, por meio de análises microscópicas (óptica, de fluorescência e eletrônica de varredura) e da técnica de Biologia Molecular de PCR/DGGE. A completa desnitrificação foi alcançada para todos os compostos testados, e o etanol foi o doador de elétrons mais eficiente para a desnitrificação. A melhor razão carbono-nitrogênio para a desnitrificação foi igual a 1,0. Contudo, este parâmetro foi encontrado ser inadequado para utilização no processo de desnitrificação, uma vez que não expressa a capacidade real do composto usado em doar elétrons. A desnitrificação com metano ocorreu tanto na presença como na ausência de oxigênio, embora a baixas velocidades quando comparado com os outros compostos. No entanto, a configuração do reator utilizado neste estudo não foi adequada para promover a efetiva dissolução do gás metano na fase líquida. Por essa razão, sugere-se o desenvolvimento de configurações de reatores apropriadas para minimizar as resistências à transferência de massa da fase gasosa para a líquida e também desta para a biomassa.

Obtenção e caracterização de amido termoplástico e de suas misturas com polipropileno.

Este trabalho está dividido em: obtenção e caracterização de amido termoplástico (TPS); estudo do envelhecimento do TPS e blendas de PP/TPS. O estudo do TPS, foi realizado utilizando amido de milho, 30% em massa de glicerol e outros componentes que variam entre as amostras. Primeiramente foi realizado um planejamento estatístico para obter a composição ótima de TPS. Foram escolhidos cinco parâmetros de entrada: 2 de composição (umidade e teor de ácido cítrico) e 3 de processamento (temperatura, velocidade dos rotores e tempo), visando obter um TPS com propriedades térmicas e mecânicas superiores. De acordo com os resultados de infravermelho, termogravimetria, microscopia ótica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram escolhidas 2 composições. Estas foram calandradas e confeccionadas para obtenção dos corpos de prova de tração. Os resultados dos ensaios mecânicos mostraram que amostras com teor de ácido cítrico de aproximadamente 2% em massa apresentam os maiores valores de módulo de elasticidade e resistência à tração. Com estes resultados foram realizadas novas composições com outros ácidos carboxílicos: adípico, málico e tartárico e amostras sem ácidos. As curvas de torque indicaram que as amostras sem ácido carboxílico e com ácido adípico perdem água durante o processamento. Analisando os resultados verifica-se que o TPS com os ácidos málico e tartárico apresentam melhores propriedades mecânicas e térmicas. Também foi analisado o envelhecimento, e notou-se que com o tempo as amostras tendem a perder plastificante, modificando suas propriedades mecânicas e sua cristalinidade. Entretanto, durante o intervalo de um ano, as amostras de TPS com ácido málico e tartárico não sofreram perda significativa de plastificante. Por último, foram obtidas blendas de PP reciclado com TPS nas composições 50/50, 60/40 e 70/30 em massa, respectivamente, com e sem adição de ácidos: cítrico, málico e tartárico e anidrido maleico. As amostras foram caracterizadas por FTIR, DRX, reometria capilar, MEV e por teste de resistência à tração. Micrografias obtidas por MEV indicaram que todas as composições estudadas possuem morfologia predominantemente co-contínua. A presença dos ácidos, geralmente, reduz os valores das propriedades mecânicas da blenda de PP com TPS e a adição de PP-g-MA é mais efetiva nas blendas sem adição de ácido. Ao analisar o envelhecimento das blendas com adição de ácidos tartárico e málico, notou-se que as propriedades mecânicas não foram alteradas em função do tempo de estocagem.

Mathematical modeling of drying process of unripe banana slices

Unripe banana flour (UBF) production employs bananas not submitted to maturation process, is an interesting alternative to minimize the fruit loss reduction related to inappropriate handling or fast ripening. The UBF is considered as a functional ingredient improving glycemic and plasma insulin levels in blood, have also shown efficacy on the control of satiety, insulin resistance. The aim of this work was to study the drying process of unripe banana slabs (Musa cavendishii, Nanicão) developing a transient drying model through mathematical modeling with simultaneous moisture and heat transfer. The raw material characterization was performed and afterwards the drying process was conducted at 40 ºC, 50 ºC e 60 ºC, the product temperature was recorded using thermocouples, the air velocity inside the chamber was 4 m·s-1. With the experimental data was possible to validate the diffusion model based on the Fick\'s second law and Fourier. For this purpose, the sorption isotherms were measured and fitted to the GAB model estimating the equilibrium moisture content (Xe), 1.76 [g H2O/100g d.b.] at 60 ºC and 10 % of relative humidity (RH), the thermophysical properties (k, Cp, ?) were also measured to be used in the model. Five cases were contemplated: i) Constant thermophysical properties; ii) Variable properties; iii) Mass (hm), heat transfer (h) coefficient and effective diffusivity (De) estimation 134 W·m-2·K-1, 4.91x10-5 m-2·s-1 and 3.278?10-10 m·s-2 at 60 ºC, respectively; iv) Variable De, it presented a third order polynomial behavior as function of moisture content; v) The shrinkage had an effect on the mathematical model, especially in the 3 first hours of process, the thickness experienced a contraction of about (30.34 ± 1.29) % out of the initial thickness, finding two decreasing drying rate periods (DDR I and DDR II), 3.28x10-10 m·s-2 and 1.77x10-10 m·s-2, respectively. COMSOL Multiphysics simulations were possible to perform through the heat and mass transfer coefficient estimated by the mathematical modeling.

Um sensível espectrômetro de massa de fonte sólida e sua aplicação à análise de K, Rb e Sr

Um espectrômetro de massa de fonte sólida de alta sensibilidade e construído de vidro Pyrex é descrito com detalhe. Um sistema de vácuo convencional, constituído de uma bomba mecânica e uma bomba de difusão de mercúrio de duplo estágio, possibilita obter-se, após cerca de 6 horas de contínuo bombeamento, pressão adequada para início de análise de materiais sólidos pela técnica de ionização térmica. Por esta técnica, quantidades tão pequenas quanto alguns micromicrogramas de potássio ou rubídio podem ser analisadas, enquanto que para estrôncio, quantidades tão pequenas quanto 0,1 μg podem ser dosadas. É apresentada também a precisão média obtida na análise desses elementos, bem como a precisão na medida das razões isotópicas. Finalmente, uma série de resultados obtidos em diferentes tipos de rochas empregando-se tal aparelho, é submetida a estudos estatísticos para melhor aquilatar o comportamento do mesmo.

Peso e massa de um corpo

Na linguagem do nosso dia-a-dia, confundem-se muitas vezes Massa e Peso (Fiolhais, 2002). Usamos inúmeras vezes o termo “pesar” para designar a operação de determinar a massa de um corpo. Isto gera alguma confusão dando origem a ideias erradas (concepções alternativas), por vezes muito difíceis de eliminar. Neste relato pretendemos partilhar experiências, vividas numa aula de Ciências Físico-Químicas, que se revelaram muito positivas para nós na compreensão destes conceitos.

Garantia patrimonial e prejudicialidade : um estudo sobre a resolução em benefício da massa

A resolução em benefício da massa constitui um dos mecanismos mais relevantes do Direito da Insolvvência, tendo por finalidade destruir os efeitos provocados por actos praticados ou omitidos pelo devedor durante um específico período anterior à declaração de insolvência em prejuízo da massa insolvente e dos interesses dos credores. Este trabalho tem como objectivo analisar o conceito de actos prejudiciais de acordo com os princípios basilares de Direito Civil e do Direito da Insolvência, nomeadamente dos princípios da prevalência do interesse dos credores e da par conditio creditorum, bem como os efeitos e o procedimento. Todos os actos que causem uma diminuição do património do devedor ou que lesem a par conditio creditorum podem ser integrados no conceito de actos prejudiciais. A existência de prejuízo pode ser presumida iuris et de iure em determinados casos ou deve ser provada pelo administrador da insolvência. É, igualmente, relevante a má fé do terceiro, que pode ser presumida iuris tantum e é excluída na resolução incondicional. Constituindo um instrumento de protecção dos interesses dos credores na insolvência do devedor, a resolução em benefício da massa ergue-se a direito da colectividade dos credores e torna inoponíveis em relação a estes os actos praticados pelo devedor e por um terceiro. A lei prevê excepções à oponibilidade a terceiros. A resolução em benefício da massa ou outras acções de idêntica natureza previstas na lei civil devem ser exercidas de forma exclusiva pelo administrador da insolvência na pendência do processo de insolvência, ainda que o CIRE permita o exercício pelos credores da impugnação pauliana. No entanto, os efeitos da referida acção devem aproveitar a todos os credores.

Os degraus da implementação efetiva no Brasil: como as regulamentações locais de acesso à informação impactam na implementação de portais de dados abertos e transparência

2015 Open Data Research Symposium, 27th May 2015, Ottawa, Canada

Nuovo codice scolastico vigente, leggi, decreti, regolamenti, circolari e programmi dal 1859 al 1909; raccolta commentata de' testi sull' amministrazione centrale e locale sull' insegnamento superiore, classico, tecnico, elementare e normale e sugli istituti complementari di cultura (antichità e belle arti, biblioteche, educazione fisica); con decisioni e pareri dei corpi consultivi e deliberanti amministrativi e giudiziari con cenni statistici e di legislazione sugli istituti di istruzione e di educazione del regno e con indici per materie, analitico-alfabetico e cronologico;

Mode of access: Internet.

Portrait of a Couple, Probably Isaac Abrahamsz Massa and Beatrix van der Laen

Frans Hals; 4 ft. 7 1/8 in.x 5 ft. 5 35/64 in.; oil on canvas