A method for multiple sequential analyses of macrophage functions using a small single cell sample

Microbial pathogens such as bacillus Calmette-Guérin (BCG) induce the activation of macrophages. Activated macrophages can be characterized by the increased production of reactive oxygen and nitrogen metabolites, generated via NADPH oxidase and inducible nitric oxide synthase, respectively, and by the increased expression of major histocompatibility complex class II molecules (MHC II). Multiple microassays have been developed to measure these parameters. Usually each assay requires 2-5 x 10(5) cells per well. In some experimental conditions the number of cells is the limiting factor for the phenotypic characterization of macrophages. Here we describe a method whereby this limitation can be circumvented. Using a single 96-well microassay and a very small number of peritoneal cells obtained from C3H/HePas mice, containing as little as <=2 x 10(5) macrophages per well, we determined sequentially the oxidative burst (H2O2), nitric oxide production and MHC II (IAk) expression of BCG-activated macrophages. More specifically, with 100 µl of cell suspension it was possible to quantify H2O2 release and nitric oxide production after 1 and 48 h, respectively, and IAk expression after 48 h of cell culture. In addition, this microassay is easy to perform, highly reproducible and more economical.

The use of reverse transcription-PCR for the diagnosis of X-linked chronic granulomatous disease

Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the innate immune system characterized by a defective oxidative burst of phagocytes and subsequent impairment of their microbicidal activity. Mutations in one of the NADPH-oxidase components affect gene expression or function of this system, leading to the phenotype of CGD. Defects in gp91-phox lead to X-linked CGD, responsible for approximately 70% of CGD cases. Investigation of the highly heterogeneous genotype of CGD patients includes mutation analysis, Northern blot or Western blot assays according to the particular case. The aim of the present study was to use reverse transcription (RT)-PCR for the analysis of molecular defects responsible for X-linked CGD in eight Brazilian patients and to assess its potential for broader application to molecular screening in CGD. Total RNA was prepared from Epstein B virus-transformed B-lymphocytes and reverse transcribed using random hexamers. The resulting cDNA was PCR-amplified by specific and overlapping pairs of primers designed to amplify three regions of the gp91-phox gene: exons 1-5, 3-9, and 7-13. This strategy detected defective gp91-phox expression in seven patients. The RT-PCR results matched clinical history, biochemical data (nitroblue tetrazolium or superoxide release assay) and available mutation analysis in four cases. In three additional cases, RT-PCR results matched clinical history and biochemical data. In another case, RT-PCR was normal despite a clinical history compatible with CGD and defective respiratory burst. We conclude that this new application of RT-PCR analysis - a simple, economical and rapid method - was appropriate for screening molecular defects in 7 of 8 X-linked CGD patients.

Superoxide release and cellular gluthatione peroxidase activity in leukocytes from children with persistent asthma

Asthma is an inflammatory condition characterized by the involvement of several mediators, including reactive oxygen species. The aim of the present study was to investigate the superoxide release and cellular glutathione peroxidase (cGPx) activity in peripheral blood granulocytes and monocytes from children and adolescents with atopic asthma. Forty-four patients were selected and classified as having intermittent or persistent asthma (mild, moderate or severe). The spontaneous or phorbol myristate acetate (PMA, 30 nM)-induced superoxide release by granulocytes and monocytes was determined at 0, 5, 15, and 25 min. cGPx activity was assayed spectrophotometrically. The spontaneous superoxide release by granulocytes from patients with mild (N = 15), moderate (N = 12) or severe (N = 6) asthma was higher at 25 min compared to healthy individuals (N = 28, P < 0.05, Duncan test). The PMA-induced superoxide release by granulocytes from patients with moderate (N = 12) or severe (N = 6) asthma was higher at 15 and 25 min compared to healthy individuals (N = 28, P < 0.05 in both times of incubation, Duncan test). The spontaneous or PMA-induced superoxide release by monocytes from asthmatic patients was similar to healthy individuals (P > 0.05 in all times of incubation, Duncan test). cGPx activity of granulocytes and monocytes from patients with persistent asthma (N = 20) was also similar to healthy individuals (N = 10, P > 0.05, Kruskal-Wallis test). We conclude that, under specific circumstances, granulocytes from children with persistent asthma present a higher respiratory burst activity compared to healthy individuals. These findings indicate a risk of oxidative stress, phagocyte auto-oxidation, and the subsequent release of intracellular toxic oxidants and enzymes, leading to additional inflammation and lung damage in asthmatic children.

Increased sympathetic activity in normotensive offspring of malignant hypertensive parents compared to offspring of normotensive parents

Malignant hypertension seems to be the consequence of very high blood pressure. Furthermore, an increase in sympathetic and renin-angiotensin system activity is considered to be the main mechanisms producing malignant hypertension. In the present study, 10 offspring of malignant hypertensive (OMH) parents (age 28 ± 5 years, 7 males, 3 females, 2 white and 8 non-white) and 10 offspring of normotensive (ONT) parents (age 28 ± 6 years, 2 males, 8 females, 3 white and 7 non-white) were evaluated. The OMH group had significantly higher (P < 0.05) casual blood pressure (125 ± 10/81 ± 5 mmHg) compared with ONT (99 ± 13/67 ± 5 mmHg). The increase in blood pressure was greater in OMH (Δ SBP = 17 ± 2 vs Δ SBP = 9 ± 1 mmHg in ONT) during cold pressor testing, but they had a lower increase in heart rate (Δ HR = 13 ± 2 vs Δ HR = 20 ± 3 bpm in ONT) during isometric exercise (handgrip test). Sympathetic activity, measured by microneurography, was significantly higher (P < 0.05) before exercise in OMH (17 ± 6 vs 11 ± 4 burst/min in ONT) and exhibited a greater increase (Δ = 18 ± 10 vs Δ = 8 ± 3 burst/min in ONT) during isometric exercise. This study showed increased sympathetic activity in OMH before exercise and a greater response during isometric exercise, suggesting an autonomic abnormality before exercise and a greater sympathetic response to physical stress in OMH compared to ONT.

Effect of cyhalothrin on Ehrlich tumor growth and macrophage activity in mice

Cyhalothrin, a pyrethroid insecticide, induces stress-like symptoms, increases c-fos immunoreactivity in the paraventricular nucleus of the hypothalamus, and decreases innate immune responses in laboratory animals. Macrophages are key elements in cellular immune responses and operate at the tumor-host interface. This study investigated the relationship among cyhalothrin effects on Ehrlich tumor growth, serum corticosterone levels and peritoneal macrophage activity in mice. Three experiments were done with 10 experimental (single gavage administration of 3.0 mg/kg cyhalothrin daily for 7 days) and 10 control (single gavage administration of 1.0 mL/kg vehicle of cyhalothrin preparation daily for 7 days) isogenic BALB/c mice in each experiment. Cyhalothrin i) increased Ehrlich ascitic tumor growth after ip administration of 5.0 x 106 tumor cells, i.e., ascitic fluid volume (control = 1.97 ± 0.39 mL and experimental = 2.71 ± 0.92 mL; P < 0.05), concentration of tumor cells/mL in the ascitic fluid (control = 111.95 ± 16.73 x 106 and experimental = 144.60 ± 33.18 x 106; P < 0.05), and total number of tumor cells in the ascitic fluid (control = 226.91 ± 43.22 x 106 and experimental = 349.40 ± 106.38 x 106; P < 0.05); ii) increased serum corticosterone levels (control = 200.0 ± 48.3 ng/mL and experimental = 420.0 ± 75.5 ng/mL; P < 0.05), and iii) decreased the intensity of macrophage phagocytosis (control = 132.3 ± 19.7 and experimental = 116.2 ± 4.6; P < 0.05) and oxidative burst (control = 173.7 ± 40.8 and experimental= 99.58 ± 41.7; P < 0.05) in vitro in the presence of Staphylococcus aureus. These data provide evidence that cyhalothrin simultaneously alters host resistance to Ehrlich tumor growth, hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) axis function, and peritoneal macrophage activity. The results are discussed in terms of data suggesting a link between stress, HPA axis activation and resistance to tumor growth.

Lipopolysaccharide-induced expression of cell surface receptors and cell activation of neutrophils and monocytes in whole human blood

Lipopolysaccharide (LPS) activates neutrophils and monocytes, inducing a wide array of biological activities. LPS rough (R) and smooth (S) forms signal through Toll-like receptor 4 (TLR4), but differ in their requirement for CD14. Since the R-form LPS can interact with TLR4 independent of CD14 and the differential expression of CD14 on neutrophils and monocytes, we used the S-form LPS from Salmonella abortus equi and the R-form LPS from Salmonella minnesota mutants to evaluate LPS-induced activation of human neutrophils and monocytes in whole blood from healthy volunteers. Expression of cell surface receptors and reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) generation were measured by flow cytometry in whole blood monocytes and neutrophils. The oxidative burst was quantified by measuring the oxidation of 2',7'-dichlorofluorescein diacetate and the NO production was quantified by measuring the oxidation of 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate. A small increase of TLR4 expression by monocytes was observed after 6 h of LPS stimulation. Monocyte CD14 modulation by LPS was biphasic, with an initial 30% increase followed by a 40% decrease in expression after 6 h of incubation. Expression of CD11b was rapidly up-regulated, doubling after 5 min on monocytes, while down-regulation of CXCR2 was observed on neutrophils, reaching a 50% reduction after 6 h. LPS induced low production of ROS and NO. This study shows a complex LPS-induced cell surface receptor modulation on human monocytes and neutrophils, with up- and down-regulation depending on the receptor. R- and S-form LPS activate human neutrophils similarly, despite the low CD14 expression, if the stimulation occurs in whole blood.

Atividade antioxidante do beta-caroteno e da vitamina A. Estudo comparativo com antioxidante sintético

Foi avaliada a atividade antioxidante da vitamina A na forma de acetato de retinol e de seu principal precursor, o beta-caroteno, adicionados a um sistema de óleo de soja previamente sensibilizado à oxidação. Os parâmetros utilizados como grau de atividade oxidativa foram: índice de peróxidos, teores de malonaldeído durante os intervalos de 24 a 72 horas, e perfil dos ácidos linoléico e linolênico após 144 horas de oxidação. Pelos resultados pode-se verificar que o retinol apresentou atividade antioxidante superior ao beta-caroteno. As determinações das atividades antioxidantes foram comparadas à do butilhidroxitolueno (BHT). A eficiência antioxidante da vitamina A e do beta-caroteno foram proporcionais às suas resistências à decomposição no sistema oxidativo. O acetato de retinol, a exemplo do BHT, mostrou uma rápida interação com os radicais ativos, pois já no início de sua adição ao óleo de soja, reduziu o nível da oxidação em relação ao respectivo controle.

Gearing Towards Omnichannel Grocery Retail Through Business Model Innovation

Technological innovations and the advent of digitalization have led retail business into one of its biggest transformations of all time. Consumer behaviour has changed rapidly and the customers are ever more powerful, demanding, tech-savvy and moving on various plat-forms. These attributes will continue to drive the development and robustly restructure the architecture of value creation in the retail business. The largest retail category, grocery yet awaits for a real disruption, but the signals for major change are already on the horizon. The first wave of online grocery retail was introduced in the mid 1990’s and it throve until millennium. Many overreactions, heavy investments and the burst IT-bubble almost stag-nated the whole industry for a long period of time. The second wave started with a venge-ance around 2010. Some research was carried out during the first wave from a single-viewpoint of online grocery retail, but without a comprehensive approach to online-offline business model integration. Now the accelerating growth of e-business has initiated an increased interest to examine the transformation from traditional business models towards e-business models and their integration on the companies’ traditional business models. This research strove to examine how can we recognize and analyze how digitalization and online channels are affecting the business models of grocery retail, by using business mod-el canvas as an analysis tool. Furthermore business model innovation and omnichannel retail were presented and suggested as potential solutions for these changes. 21 experts in online grocery industry were being interviewed. The thoughts of the informants were being qualitatively analysed by using an analysis tool called the business model canvas. The aim of this research was to portray a holistic view on the Omnichannel grocery retail business model, and the value chain, in which the case company Arina along with its partners are operating. The key conclusions exhibited that online grocery retail business model is not an alterna-tive model nor a substitute for the traditional grocery retail business model, though all of the business model elements are to some extent affected by it, but rather a complementary business model that should be integrated into the prevailing, conventional grocery retail business model. A set of business model elements, such as value proposition and distribu-tion channels were recognized as the most important ones and sources of innovation within these components were being illustrated. Segments for online grocery retail were empiri-cally established as polarized niche markets in contrast of the segmented mass-market of the conventional grocery retail. Business model innovation was proven to be a considera-ble method and a conceptual framework, by which to come across with new value proposi-tions that create competitive advantage for the company in the contemporary, changing business environment. Arina as a retailer can be considered as a industry model innovator, since it has initiated an entire industry in its market area, where other players have later on embarked on, and in which the contributors of the value chain, such as Posti depend on it to a great extent. Consumer behaviour clearly affects and appears everywhere in the digi-talized grocery trade and it drives customers to multiple platforms where retailers need to be present. Omnichannel retail business model was suggested to be the solution, in which the new technologies are being utilized, contemporary consumer behaviour is embedded in decision-making and all of the segments and their value propositions are being served seamlessly across the channels.

Efeito da irradiação e do armazenamento na disponibilidade de ferro em carne de cordeiro tratado com diferentes dietas

A irradiação é um método eficiente para aumentar a segurança microbiológica e preservar os nutrientes contidos nas carnes, entre eles o ferro. A forma de melhor absorção, ferro heme, deve ser preservada, havendo melhora na qualidade nutricional da carne armazenada. A dieta também pode influenciar nos teores e formas em que são encontrados os nutrientes na carne. O ferro é fornecido pela dieta, sendo essencial para os processos metabólicos como transporte de oxigênio, metabolismo oxidativo e crescimento celular. Amostras de carne de cordeiro tratado com diferentes dietas (controle, TAC1, TAC2 e sorgo), foram embaladas a vácuo, e irradiadas nas doses 0, 2 e 4 kGy, usando-se Irradiador Multipropósito com fonte de cobalto-60 (60Co) e armazenadas a 4 °C por 15 dias. Os valores de ferro total e ferro heme foram medidos aos 0 e 15 dias de armazenamento. O armazenamento diminuiu os teores de ferro total (de 18,36 para 14,28 mg.100 g-1) e de ferro heme (de 13,78 para 10,52 mg.100 g-1). As dietas afetaram os níveis de ferro total e heme da carne, sendo que a dieta com sorgo foi a que apresentou maiores teores. A dose de 2 kGy foi a dose que mais afetou os valores de ferro, independentemente dos tempos de armazenamento. Foi constatado que os teores de ferro total e heme variaram em função do tempo de armazenamento, das doses de irradiação e das dietas fornecidas aos cordeiros.

Efeito da bebida de café descascado sobre a atividade antioxidante, os parâmetros hematológicos e bioquímicos em ratos

O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da bebida filtrada, preparada com café-arábica descascado, sobre a peroxidação de lipídios, os parâmetros hematológicos e bioquímicos in vivo. Para isso foram utilizados ratos que ingeriram 280 mg/kg/dia da bebida de café por 7 dias (tratamento agudo) e 30 dias (tratamento crônico). A fim de determinar se a bebida de café é capaz de reduzir o estresse oxidativo, foi analisada a peroxidação de lipídios isolados de cérebro de rato analisando-se as substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico. A ingestão da bebida por 7 e 30 dias inibiu significativamente a peroxidação lipídica (p < 0,05 e p < 0,001), respectivamente, em comparação ao controle. No entanto, não houve diferença significativa entre a porcentagem de inibição da peroxidação quando foram comparados os tratamentos agudo (48,6%) e crônico (53,4%). A ingestão crônica de doses moderadas da bebida filtrada de café não produziu modificação significativa no nível plasmático dos parâmetros bioquímicos e hematológicos analisados. Os resultados indicam que a ingestão moderada de café filtrado pode ter efeito benéfico para a saúde, por inibir a peroxidação lipídica e não interferir nos níveis séricos de colesterol e triglicerídeos em ratos.

Pré-eclâmpsia (indicador de doença renal crônica): da gênese aos riscos futuros

A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença específica da gestação que, somada às demais desordens hipertensivas, constitui importante causa de morbimortalidade materna e perinatal. Tem incidência estimada de 3 a 14% entre todas as gestações e pode manifestar-se de diferentes formas clínicas. A PE e a doença cardiovascular (DCV) possuem mecanismos fisiopatológicos semelhantes, como disfunção endotelial, alteração metabólica e estresse oxidativo, assim como também compartilham alguns fatores de risco como obesidade, doença renal e diabetes. A exata relação entre PE e risco cardiovascular ainda não está totalmente elucidada, talvez o estresse metabólico desencadeado na PE provoque a lesão vascular que contribui para o desenvolvimento da DCV e/ou da doença renal crônica (DRC) futuramente. Esse risco parece ser ainda maior em mulheres com história de PE recorrente, severa e eclâmpsia. A investigação do antecedente de PE pode auxiliar na avaliação do risco futuro de DCV e DRC, na prevenção e no diagnóstico precoce.

Alterações cognitivas na doença renal crônica: uma atualização

Prejuízos das funções cognitivas ocorrem com frequência na doença renal crônica (DRC). As condições mais associadas a esses prejuízos são depressão, delirium, comprometimento cognitivo leve e demência. Os mecanismos envolvidos ainda não estão estabelecidos, mas alguns fatores, como dano neuronal induzido pelas toxinas urêmicas, lesões cerebrovasculares isquêmicas, estresse oxidativo, inflamação crônica, anemia, hiper-homocisteinemia e disfunção endotelial, podem ser importantes. O desempenho neuropsicológico tende a melhorar com o início da diálise, apesar de algumas disfunções cognitivas permanecerem alteradas mesmo após a instituição do tratamento, principalmente nos domínios de atenção, flexibilidade cognitiva, memória e aprendizagem. O transplante renal pode melhorar e, inclusive, reverter alguns déficits cognitivos, apesar de prejuízos na memória verbal e nas funções executivas poderem permanecer. O diagnóstico do declínio cognitivo nos pacientes renais crônicos pode ter impacto no manejo e no prognóstico. Este artigo apresenta uma atualização sobre declínio das funções cognitivas nos pacientes com DRC.

Associação entre níveis de ferritina e peroxidação lipídica em pacientes em hemodiálise

ResumoIntrodução:A suplementação de ferro é uma das importantes recomendações em pacientes com doença renal crônica (DRC), contudo, uma sobrecarga desse mineral pode contribuir para o estresse oxidativo, condição essa bastante relacionada com o risco cardiovascular nesses pacientes.Objetivo:O objetivo desse trabalho foi investigar se os níveis de ferritina estão associados ao estresse oxidativo avaliado pelo malondialdeído (MDA) em pacientes em hemodiálise (HD).Métodos:Vinte pacientes em tratamento de HD (55,0 ± 15,2 anos, tempo de diálise de 76,5 ± 46,3 meses, IMC 23,6 ± 3,0 kg/m2) foram comparados com 11 indivíduos saudáveis (50,9 ± 8,0 anos, IMC 23,8 ± 1,9 kg/m2). O nível de MDA foi medido pela reação com o ácido tiobarbitúrico e os dados bioquímicos de rotina foram obtidos por meio do prontuário médico.Resultados:Os pacientes em HD apresentaram elevados níveis de MDA (13,2 ± 5,3 nmol/mL) quando comparados aos indivíduos saudáveis (5,1 ± 2,7 nmol/mL; p < 0,01). Doze pacientes (60%) apresentaram valores de ferritina superiores a 500 ng/mL e houve correlação positiva entre ferritina e MDA nos pacientes HD (r = 0,66; p = 0,005; n = 17).Conclusão:O excesso dos estoques de ferro em pacientes em HD resulta em um aumento da peroxidação lipídica e, consequentemente, contribui para um maior estresse oxidativo nesses pacientes.

Inflamação renal, alterações metabólicas e oxidativas após 6 semanas de dieta de cafeteria em ratos

Resumo Introdução: A obesidade é uma doença em que a inflamação está inteiramente envolvida e pode causar insuficiência renal. Objetivo: Avaliar a influência da exposição a curto prazo de uma dieta de cafeteria sobre a inflamação no tecido renal e a formação de produtos de glicação avançada (AGEs) no plasma de rato. Métodos: Ratos Wistar machos (10 semanas de idade, pesando 350 g) foram designados para receber dieta de ração comercial (C; n = 8 animais/grupo, 5% de energia a partir de gordura) ou dieta de cafeteria (CAF-D, n = 8 animais/grupo: 29% de energia de gordura) e de sacarose em água (300 g/L) de beber durante 6 semanas. Resultados: Índice de adiposidade em seis semanas foi maior no grupo CAF-D em comparação com C. O mesmo comportamento foi observado para os níveis plasmáticos de glicose, triglicerídeos, leptina, insulina e AGEs. A expressão do gene de IL-6 e TNF-α em tecido renal foi maior no grupo D-CAF e nenhuma diferença significativa no tecido adiposo. Não houve aumento destas citocinas no plasma ou rim. Houve uma diminuição significativa de adiponectina no grupo CAF-D. Conclusão: A exposição a curto prazo da CAF-D reflete alterações no metabolismo, aumento dos níveis plasmáticos de AGEs, o que pode refletir o aumento expressão de citocinas inflamatórias no rim.

Estudo enzimático da deterioração de sementes de Melanoxylon brauna submetidas ao envelhecimento natural e acelerado

Não há conhecimento específico para sementes florestais quanto aos processos metabólicos envolvidos durante o armazenamento, o que dificulta o estabelecimento de técnicas para sua conservação adequada. Assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar a participação de enzimas do estresse oxidativo e metabolismo de lipídios durante o armazenamento ou envelhecimento acelerado. Sementes de brauna (Melanoxylon brauna - Leguminosae-Caesalpinoideae) foram envelhecidas naturalmente durante o armazenamento por 0, 3, 6, 9 e 12 meses em câmara fria e artificialmente (envelhecimento acelerado) durante 0, 24, 48, 72 e 96 horas, com objetivo de avaliar alterações na atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase e nos teores de lipídios. Para isso, foram realizados testes de germinação, avaliadas a atividade enzimática e quantificados os teores de lipídios no eixo embrionário e nos cotilédones. O envelhecimento natural e acelerado afetou de forma semelhante o comportamento das sementes de brauna, promovendo redução do vigor. Embora os efeitos dos dois tipos de envelhecimento afetassem igualmente a germinação, o envelhecimento artificial a 45 ºC por 72 horas simula adequadamente o comportamento enzimático manifestado pelas sementes armazenadas por 12 meses em câmara fria. Houve semelhante redução gradativa das reservas de lipídios em ambos os sistemas de envelhecimento, mas sem correlação entre o armazenamento natural e o envelhecimento acelerado.