Identification and characterization of a Catharanthus roseus mutant altered in monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis

The Madagascar periwinkle [Catharanthus roseus (L.) G. Don] is a commercially important horticultural flower species and is the only source for several pharmaceutically valuable monoterpenoid indole alkaloids (MIAs), including the powerful antihypertensive ajmalicine and the antineoplastic agents vincristine and vinblastine. While biosynthesis of MIA precursors has been elucidated, conversion of the common MIA precursor strictosidine to MIAs of different families, for example ajmalicine, catharanthine or vindoline, remains uncharacterized. Deglycosylation of strictosidine by the key enzyme Strictosidine beta-glucosidase (SGD) leads to a pool of uncharacterized reaction products that are diverted into the different MIA families, but the downstream reactions are uncharacterized. Screening of 3600 EMS (ethyl methane sulfonate) mutagenized C. roseus plants to identify mutants with altered MIA profiles yielded one plant with high ajmalicine, and low catharanthine and vindoline content. RNA sequencing and comparative bioinformatics of mutant and wildtype plants showed up-regulation of SGD and the transcriptional repressor Zinc finger Catharanthus transcription factor (ZCT1) in the mutant line. The increased SGD activity in mutants seems to yield a larger pool of uncharacterized SGD reaction products that are channeled away from catharanthine and vindoline towards biosynthesis of ajmalicine when compared to the wildtype. Further bioinformatic analyses, and crossings between mutant and wildtype suggest a transcription factor upstream of SGD and ZCT1 to be mutated, leading to up-regulation of Sgd and Zct1. The crossing experiments further show that biosynthesis of the different MIA families is differentially regulated and highly complex. Three new transcription factors were identified by bioinformatics that seem to be involved in the regulation of Zct1 and Sgd expression, leading to the high ajmalicine phenotype. Increased cathenamine reductase activity in the mutant converts the pool of SGD reaction products into ajmalicine and its stereoisomer tetrahydroalstonine. The stereochemistry of ajmalicine and tetrahydroalstonine biosynthesis in vivo and in vitro was further characterized. In addition, a new clade of perakine reductase-like enzymes was identified that reduces the SGD reaction product vallesiachotamine in a stereo-specific manner, characterizing one of the many reactions immediately downstream of SGD that determine the different MIA families. This study establishes that RNA sequencing and comparative bioinformatics, in combination with molecular and biochemical characterization, are valuable tools to determine the genetic basis for mutations that trigger phenotypes, and this approach can also be used for identification of new enzymes and transcription factors.

Disease-Gene Association Using Genetic Programming

As a result of mutation in genes, which is a simple change in our DNA, we will have undesirable phenotypes which are known as genetic diseases or disorders. These small changes, which happen frequently, can have extreme results. Understanding and identifying these changes and associating these mutated genes with genetic diseases can play an important role in our health, by making us able to find better diagnosis and therapeutic strategies for these genetic diseases. As a result of years of experiments, there is a vast amount of data regarding human genome and different genetic diseases that they still need to be processed properly to extract useful information. This work is an effort to analyze some useful datasets and to apply different techniques to associate genes with genetic diseases. Two genetic diseases were studied here: Parkinson’s disease and breast cancer. Using genetic programming, we analyzed the complex network around known disease genes of the aforementioned diseases, and based on that we generated a ranking for genes, based on their relevance to these diseases. In order to generate these rankings, centrality measures of all nodes in the complex network surrounding the known disease genes of the given genetic disease were calculated. Using genetic programming, all the nodes were assigned scores based on the similarity of their centrality measures to those of the known disease genes. Obtained results showed that this method is successful at finding these patterns in centrality measures and the highly ranked genes are worthy as good candidate disease genes for being studied. Using standard benchmark tests, we tested our approach against ENDEAVOUR and CIPHER - two well known disease gene ranking frameworks - and we obtained comparable results.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Caractérisation structurale de la molécule HLA-DO

Les molécules classiques du CMH de classe II présentent des peptides antigéniques aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation est régulée par deux molécules non classiques : HLA-DM catalyse la relâche de CLIP et le chargement de peptides et HLA-DO module l’activité de DM. Une expression insuffisante en cellules d’insectes empêche les expériences de cristallisation de DO, probablement en raison de sa conformation, rendant DO instable et inapte à sortir du réticulum endoplasmique (RE). DM corrige la conformation de DO et permet sa sortie du RE. Aussi, par ses ponts disulfures uniques, DM adopte une conformation stable et peut sortir du RE sans lier d’autre molécule. Nous avons tenté de corriger la conformation de DO en introduisant des cystéines pour établir des ponts homologues à ceux de DM. La conformation de DO ne fut pas corrigée. Par ailleurs, nous avons augmenté l’expression de DO en introduisant une séquence partielle de Kozak. Nous avons aussi étudié l’effet de DM sur l’expression de DO. DM a favorisé l’expression de DO, probablement en diminuant sa dégradation. Chaque chaîne du dimère DMαβ est impliquée dans l’oxydation de sa chaîne partenaire. La conformation non-optimale de DO pourrait traduire une incapacité des chaînes α ou β à favoriser l’oxydation de sa partenaire; DM corrigerait ce problème. Notre analyse d’immunobuvardage de type Western a toutefois démontré que DM ne modifie pas l’état d’oxydation de DOα et DOβ. Finalement, nous avons étudié l’interaction DO-DM. L’acide aminé DOαE41 est impliqué dans cette liaison. Certains des acides aminés entre α80 et α84 pourraient être impliqués. Nous avons muté des acides aminés de cette région de DOα. Les résidus testés ne semblent pas impliqués dans la liaison DO-DM. L’obtention de la structure tridimensionnelle de DO et la caractérisation de son état oxydatif et de sa liaison à DM permettront de mieux comprendre son rôle.

Mode de vie, habitudes alimentaires et cancer du sein: Étude cas-témoins chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations des gènes BRCA

Le cancer du sein (CS) est la deuxième cause de décès liés au cancer parmi les femmes dans la plupart des pays industrialisés. Les personnes qui ont le CS peuvent ne pas hériter des mutations causant le cancer de leurs parents. Ainsi, certaines cellules subissent des mutations qui mènent au cancer. Dans le cas de cancer héréditaire, les cellules tumorales contiennent généralement des mutations qui ne sont pas trouvées ailleurs dans l'organisme, mais peuvent maintenir des mutations qui vont répartir dans toutes les cellules. La genèse du CS est le résultat des mutations de gènes qui assurent la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Deux gènes semblent particulièrement concernés par les mutations. Les gènes ‘Breast Cancer 1’ (BRCA1) et ‘Breast Cancer 2’ (BRCA2), sont impliqués dans la prédisposition génétique de CS. On estime que 5-10% des cas de cancer du sein sont attribuables à une prédisposition génétique. La plupart de ces cancers sont liés à une anomalie du gène BRCA1 ou BRCA2. Plusieurs études ont été menées chez les femmes atteintes de CS sporadique et quelques études se sont concentrées sur celles qui sont porteuses de mutations de BRCA. Alors, notre recherche a été entreprise afin de vérifier l’hypothèse d’une association entre le CS, le mode vie et les habitudes alimentaires chez les Canadiennes-françaises non porteuses des 6 mutations de BRCA les plus fréquentes parmi cette population. Nous avons mené une étude cas-témoins dans cette population. Quelque 280 femmes atteintes du cancer du sein et non-porteuses de mutations de BRCA, ont été recrutées en tant que cas. Les témoins étaient recrutés parmi les membres de la famille des cas (n=15) ou à partir d'autres familles atteintes de CS (n=265). Les participantes étaient de tous âges, recrutées à partir d’une étude de cohorte qui est actuellement en cours, menée par une équipe de chercheurs au Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (CHUM) Hôtel-Dieu à Montréal. Les apports alimentaires ont été recueillis par un questionnaire de fréquence semi-quantitatif validé et administré par une nutritionniste, qui portait sur la période avant les deux ans précédant le premier diagnostic de CS pour les cas et la période avant les deux ans précédant l’entrevue téléphonique pour les témoins. Un questionnaire de base était administré par l’infirmière de recherche aux participantes afin de colliger des renseignements sociodémographiques et sur les facteurs de risque du CS. Une association positive et significative a été détectée entre l’âge (plus de 50 ans) auquel les sujets avaient atteint leur Indice de Masse Corporel (IMC) le plus élevé et le CS rapport de cotes (OR) =2,83; intervalle de confiance à 95% (IC95%) (2,34-2,91). De plus, une association positive a été détectée entre un gain de poids de >34 lbs comparativement à un gain de poids de ≤15 lbs, dès l’âge de 20 ans OR=1,68; IC95% (1,10-2,58). Un gain de poids de >24 lbs comparativement à un gain de poids de ≤9 lbs, dès l’âge de 30 ans a aussi montré une augmentation de risque de CS OR=1,96; IC95% (1,46-3,06). Une association positive a aussi été détecté entre, un gain de poids de >12 lbs comparativement à un gain de poids de ≤1 lb, dès l’âge de 40 ans OR=1,91; IC95% (1,53-2,66). Concernant le tabagisme, nous avons observé une association positive et significative reliée à la consommation de plus de 9 paquets-années OR = 1,59; IC95% (1,57-2,87). Il fut suggéré que l’activité physique modéré confère une protection contre le CS: une pratique de > 24,8 (‘metabolic equivalent’) MET-hrs par semaine par rapport à ≤10,7 MET-hrs par semaine, diminue le risque du CS de 52% OR = 0,48 ; IC95% (0,31-0,74). L’activité physique totale (entre 16,2 et 33,2 MET-hrs par semaine), a aussi montré une réduction de risque de CS de 43% OR = 0,57 ; IC95% (0,37-0,87). Toutefois, il n'y avait aucune association entre une activité physique vigoureuse et le risque de CS. L’analyse portant sur les macro- et micro-nutriments et les groupes alimentaires a montré qu’un apport en énergie totale de plus de 2057 Kcal par jour augmentait le risque de CS de 2,5 fois OR = 2,54; IC95% (1,67-3,84). En ce qui concerne la consommation de café, les participantes qui buvaient plus de 8 tasses de café par jour avaient un risque de CS augmenté de 40% OR = 1,40; IC95% (1,09-2,24). Les sujets ayant une consommation dépassant 9 g d’alcool (éthanol) par jour avaient également un risque élevé de 55% OR = 1,55; IC95% (1,02-2,37). De plus, une association positive et significative a été détectée entre le CS et la consommation de plus de deux bouteilles de bière par semaine OR = 1,34; IC95% (1,28-2,11), 10 onces de vin par semaine OR = 1,16; IC95% (1,08-2,58) ou 6 onces de spiritueux par semaine OR = 1,09; IC95% (1,02-2,08), respectivement. En résumé, les résultats de cette recherche supportent l’hypothèse selon laquelle le mode de vie et les habitudes alimentaires jouent un rôle important dans l’étiologie de CS chez les Canadiennes-françaises non porteuses de mutations de BRCA. Les résultats nous permettent de constater que le gain de poids et le tabagisme sont liés à des risques élevés de CS, tandis que l'activité physique modérée aide à réduire ce risque. De plus, nos résultats suggèrent qu’un apport énergétique total relativement élevé et une consommation élevée de café et d'alcool peuvent accroître le risque de ce cancer. Ce travail a permis de mettre l’accent sur une nouvelle direction de recherche, jusqu'à présent non investiguée. Les résultats de ce travail de recherche pourraient contribuer à recueillir de nouvelles informations et des conseils pouvant influencer et aider la population à modifier son mode de vie et ses habitudes alimentaires afin de diminuer le risque de cancer du sein.

Impact d’une mutation ponctuelle stratégique de la protéine HOXB4 sur son pouvoir de régulation, de prolifération et de différenciation des CSH et des progéniteurs murins

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique.

L’effet de HOXB4 sur l’expansion et la différenciation des progéniteurs myéloïdes

La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques.

Caractérisation moléculaire de la modulation spatio-temporelle des fonctions du phagosome

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées.

Caractérisation clinique et génétique d’une nouvelle forme d’ataxie autosomique récessive dans la population québécoise

Les ataxies autosomiques récessives sont un groupe de troubles neurologiques hétérogènes caractérisés par une incoordination brute des mouvements musculaires impliquant le dysfonctionnement nerveux du cervelet qui coordonne le mouvement. Plusieurs formes héréditaires ont été décrites dont la plus connue : l’ataxie de Friedriech. Dans cette thèse nous rapportons l'identification et la caractérisation d’une nouvelle forme dans la population québécoise. L’ataxie récessive spastique avec leucoencéphalopathie (ARSAL; aussi connue comme l’ataxie autosomique récessive spastique de type 3 (SPAX3); OMIM 611390) est la deuxième ataxie spastique décrite dans la population canadienne française. En effet, près de 50 % de nos cas sont originaires de la région de Portneuf. En 2006, nous avons décrit les caractéristiques cliniques de cette nouvelle forme d’ataxie. Un premier criblage du génome entier, constitué de plus de 500 marqueurs microsatellites, a permis la localisation du locus sur le chromosome 2q33-34. Suite au séquençage de plus de 37 gènes candidats et afin de rétrécir cet intervalle candidat, nous avons utilisé une micro-puce d’ADN constituée de marqueurs SNP «single nucleotide polymorphism» et nous avons identifié un deuxième intervalle candidat de 0.658Mb au locus 2q33 dans lequel se trouvent moins de 9 gènes. L’identification et la caractérisation de ces mutations a nécessité l’utilisation de diverses technologies de pointe. Trois mutations (une délétion et deux réarrangements complexes) dans le gène mitochondrial tRNA-synthetase (MARS2) ont été identifiées dans notre cohorte. Nous émettons l’hypothèse que la nature des mutations complexes est responsable d’un dérèglement de la transcription du gène, ce qui a un impact néfaste sur la fonction mitochondriale et le tissu neuronal.

Le VEGF induit la synthèse du PAF par l’entremise de l’activation du VEGFR-2 : identification des phosphotyrosines impliquées

Notre laboratoire a démontré que la capacité proinflammatoire du vascular endothelial growth factor (VEGF-A165) implique la synthèse endothéliale du facteur d’activation plaquettaire (PAF) via l’activation du récepteur tyrosine kinase homodimérique VEGFR-2/R-2. La synthèse du PAF requiert l’activation de la p38 MAPK et p42/44 MAPK qui activent la phospholipase A2 secrétée de type V (sPLA2-V). Nous avons découvert que la synthèse aigue de prostacycline (PGI2) induite par le VEGF-A165 requiert l’activation des récepteurs hétérodimériques VEGFR-1/R-2. L’activation sélective des récepteurs du VEGF peut donc agir comme balance dans la synthèse de facteurs pro-(PAF) et anti-(PGI2) inflammatoire. Cependant, les tyrosines impliquées dans la transphosphorylation de VEGFR-2/R-2 menant à la synthèse du PAF sont inconnues. Par mutagenèse dirigée, nous avons effectué des transfections transitoires de cellules endothéliales avec des plasmides codant pour le VEGFR-2 dont les tyrosines ciblées ont été remplacées de façon séquentielle par une phénylalanine. Un vecteur vide pcDNA a été utilisé comme contrôle négatif. La stimulation des cellules endothéliales de l’aorte bovine (BAEC) transfectées avec le VEGF-A165 (1nM) pendant 15 minutes augmente la synthèse du PAF de 300%, laquelle était similaire dans les BAEC non transfectées. Dans les BAEC transfectées avec les vecteurs pcDNA codant pour les mutations Y801F, Y1059F, Y1175F et Y1214F, nous avons observé une réduction de 54, 73, 68, et 57% respectivement de la synthèse du PAF induite par le VEGF par rapport au pcDNA témoin. Nos résultats apportent un nouvel aperçu sur le mécanisme par lequel le VEGF induit la synthèse du PAF qui est connu pour sa contribution dans l’activité pro-inflammatoire du VEGF.

Étude moléculaire des mécanismes d’action de potentiateurs du canal CFTR sur le canal KCa3.1

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces.

Couplage du récepteur à sept domaines transmembranaires GABA-B1 aux voies intracellulaires de signalisation en absence de GABA-B2

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs.

Étude clinique et génétique d’une nouvelle forme d’ataxie spinocérébelleuse pure associée à l’Érythrokératodermie

Nous présentons ici la description clinique et génétique d’un syndrome neurocutané unique. Le laboratoire du Dr Cossette a entrepris la caractérisation clinique et génétique d'une famille canadienne-française qui a été identifiée par les Drs Giroux et Barbeau en 1972 et qui comprend plus de 100 personnes sur six générations. Les membres atteints de cette famille présentent des lésions typiques d'érythrokératodermie (EK) (OMIM 133190, EKV1 et EKV2), associées à une ataxie spinocérébelleuse pure. Dans cette famille, l'ataxie est caractérisée par des troubles de la coordination et de la démarche causés par une dégénérescence du cervelet et de la moelle épinière. Cette ataxie est transmise selon un mode autosomique dominant. Une étude antérieure de cette variante d'EK avec ataxie avait suggéré une liaison sur le chromosome 1p34-p35, soit la même région que les formes EKV de type 1 et 2, causées respectivement par des mutations dans les gènes connexin-31 (GJB3; OMIM 603324) et connexin-30.3 (GJB4; OMIM 605425). Cependant, aucune mutation n'a été retrouvée dans ces gènes pour la famille canadienne-française. Nous avons récemment recontacté la famille et effectué des examens détaillés, incluant une imagerie par résonance magnétique (IRM) et un électromyogramme (EMG). Les manifestations neurologiques des individus atteints sont compatibles avec une nouvelle forme d’ataxie cérébelleuse pure à transmission autosomique dominante (ADCA de type III dans la classification de Harding) que nous avons appelée SCA34. Une cartographie complète du génome nous a permis de localiser le gène SCA34 sur le chromosome 6p12.3-q16.2. Également, en collaboration avec les Drs Alexis Brice (Hôpital Pitié-La Salpêtrière, Paris) et Alfredo Brusco (Hôpital San Giovanni Battista di Torino, Italie), nous avons confirmé que trois autres familles européennes avec SCA inexpliquée étaient également liées au locus SCA34. Notre laboratoire a récemment entrepris la recherche des mutations responsables de SCA34. Les résultats de ce criblage de gènes candidats sont présentés dans le chapitre 3 de cette thèse.

Étude du transcriptome des cellules non tumorales de l’épithélium de surface de l’ovaire des femmes porteuses d’une mutation des gènes BRCA1 et BRCA2

Nous avons étudié le transcriptome de neuf échantillons d'ARN extraits de cultures primaires de cellules non tumorales de l’épithélium de surface de l’ovaire (NOSE) provenant de quatre donneuses non porteuses de mutation, deux mutées sur BRCA1 et trois sur BRCA2, ainsi que de quatre échantillons d’ARN extraits de cultures primaires de cellules tumorales de l’ovaire (TOV) provenant de trois donneuses porteuses de mutation sur BRCA1 et une sur BRCA2. Nous avons identifié, pour la première fois, les signatures moléculaires associées à la présence d’une mutation de BRCA1 et BRCA2 dans les cellules NOSEs ainsi que la signature associée à la transformation tumorale des cellules NOSEs en TOVs chez les porteuses de mutation de BRCA1. Nous avons également localisé les domaines chromosomiques comportant des gènes corégulés en association avec la présence d’une mutation de BRCA1 dans les cellules NOSEs. Les allèles sauvage et muté de BRCA2 étaient exprimés dans les cellules TOVs provenant des porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2. Nous avons observé que le niveau d’expression des transcrits de BRCA2 était plus élevé dans les cellules provenant des tumeurs ovariennes les plus agressives chez les femmes porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2, les transcrits correspondants à l’allèle muté contribuant avec un pourcentage élevé du niveau d’expression total du gène. Le phénotype tumoral observé chez les Canadiennes Françaises porteuses de cette mutation pourrait résulter d’un effet de dosage de l’allèle muté.