Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells

Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.

Characterization of pro- and anti-angiogenic factors in models of diabetic retinopathy

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015

Entscheidungshilfe bei Internationalisierungsstrategien in der Nutzfahrzeugindustrie durch Competitive Intelligence - am Anwendungsbeispiel Afrika

Die nachhaltige Verschiebung der Wachstumsmärkte in Richtung Emerging Markets (und hier insbesondere in die BRIC-Staaten) infolge der Wirtschaftskrise 2008/2009 hat die bereits weit reichend konsolidierte Nutzfahrzeugindustrie der Triadenmärkte in Nordamerika, Europa und Japan vor eine Vielzahl von Herausforderungen gestellt. Strategische Ziele wie die Festigung und Steigerung von Absatzvolumina sowie eine bessere Ausbalancierung von zyklischen Marktentwicklungen, die die Ertragssicherung und eine weitestgehend kontinuierliche Auslastung existenter Kapazitäten sicherstellen soll, sind in Zukunft ohne eine Marktbearbeitung in den ex-Triade Wachstumsmärkten kaum noch erreichbar. Dies verlangt eine Auseinandersetzung der betroffenen Unternehmen mit dem veränderten unternehmerischen Umfeld. Es gilt neue, bisher größtenteils unbekannte Märkte zu erobern und sich dabei neuen – teilweise ebenfalls wenig bekannten - Wettbewerbern und deren teilweise durchaus unkonventionellen Strategien zu stellen. Die Triade-Unternehmen sehen sich dabei Informationsdefiziten und einer zunehmenden Gesamtkomplexität ausgesetzt, die zu für sie zu nachteiligen und ungünstigen nformationsasymmetrien führen können. Die Auswirkungen, dieser Situation unangepasst gegenüberzutreten wären deutlich unsicherheits- und risikobehaftetere Marktbearbeitungsstrategien bzw. im Extremfall die Absenz von Internationalisierungsaktivitäten in den betroffenen Unternehmen. Die Competitive Intelligence als Instrument zur unternehmerischen Umfeldanalyse kann unterstützen diese negativen Informationsasymmetrien zu beseitigen aber auch für das Unternehmen günstige Informationsasymmetrien in Form von Informationsvorsprüngen generieren, aus denen sich Wettbewerbsvorteile ableiten lassen. Dieser Kontext Competitive Intelligence zur Beseitigung von Informationsdefiziten bzw. Schaffung von bewussten, opportunistischen Informationsasymmetrien zur erfolgreichen Expansion durch Internationalisierungsstrategien in den Emerging Markets wird im Rahmen dieses Arbeitspapieres durch die Verbindung von wissenschaftstheoretischen und praktischen Implikationen näher beleuchtet. Die sich aus dem beschriebenen praktischen Anwendungsbeispiel Competitive intelligence für afrikanische Marktbearbeitung ergebenden Erkenntnisse der erfolgreichen Anwendung von Competitive Intelligence als Entscheidungshilfe für Internationalisierungsstrategien sind wie folgt angelegt: - Erweiterung der Status-quo, häufig Stammmarkt-zentristisch angelegten Betrachtungsweisen von Märkten und Wettbewerbern in Hinblick auf das reale Marktgeschehen oder Potentialmärkte - bias-freie Clusterung von Märkten bzw. Wettbewerbern, oder Verzicht auf den Versuch der Simplifizierung durch Clusterbildung - differenzierte Datenerhebungsverfahren wie lokale vs. zentrale / primäre vs. sekundäre Datenerhebung für inhomogene, unterentwickelte oder sich entwickelnde Märkte - Identifizierung und Hinzuziehung von Experten mit dem entscheidenden Wissensvorsprung für den zu bearbeitenden Informationsbedarf - Überprüfung der Informationen durch Datentriangulation

Studienmotivation und Berufserwartungen von Studienanfängerinnen und Studienanfängern der Evangelischen Religions- und Gemeindepädagogik

Ziel der durchgeführten Untersuchung war es, Einsichten in die Studienmotivation und Berufserwartungen von Studienanfängern und -anfängerinnen der Evangelischen Religionspädagogik / Gemeindepädagogik zu erhalten. Heute bieten acht (Fach-) Hochschulen einen grundständigen, also in vollem Umfang berufsqualifizierenden Bachelorstudiengang Evangelische Religions- bzw. Gemeindepädagogik an, der zum kirchlichen Beruf einer Gemeindepädagogin oder eines Gemeindepädagogen bzw. eines Diakons oder einer Diakonin führen kann. Sechs dieser Studiengänge sehen heute eine Kombinationsmöglichkeit mit dem Studium der Sozialen Arbeit vor, die auch die staatliche Anerkennung als Sozialarbeiter bzw. Sozialpädagogin ermöglicht. Inwieweit sich dies auch auf die Wahl des Studienfachs Religions- und Gemeindepädagogik und auf die Studienmotivation auswirkt, war Gegenstand einer im Wintersemester 2011/12 durchgeführten Untersuchung. Warum entscheiden sich heute (zumeist) junge Menschen für ein religions- und gemeindepädagogisches Studium und welche Vorstellungen über ihre spätere Berufspraxis haben sie? Welche Rolle spielt für die Studienfachentscheidung die Möglichkeit des Erwerbs einer doppelten Qualifikation, die nicht notwendigerweise in eine spätere kirchliche Berufstätigkeit führen muss, sondern auch für den Bereich sozialer Arbeit in staatlichen Einrichtungen und bei freien Trägern qualifiziert? Um Antwort auf diese Fragen zu erhalten, wurden in einer Fragebogen-Erhebung die Studienanfänger und -anfängerinnen an acht Hochschulstandorten (Berlin, Bochum, Freiburg, Hannover, Kassel, Ludwigsburg, Moritzburg, Nürnberg) befragt. 221 von insgesamt 250 Studierenden im ersten Fachsemester beteiligten sich daran (88,4%).

Was macht die Universität aus ihren Bologna-Studierenden?

Der folgende Beitrag fasst die jüngsten Ergebnisse einer Studierendenbefragung zusammen, die im Rahmen des BMBF-geförderten Forschungsprojekts „ZEITLast: Lehrzeit und Lernzeit: Studierbarkeit der BA-/BSc- und MA-/MSc- Studiengänge als Adaption von Lehrorganisation und Zeitmanagement unter Berücksichtigung von Fächerkultur und Neuen Technologien“ im Wintersemester 2010/2011 in den beiden Studiengängen „Informationsmanagement und Informationstechnologie“ und „Polyvalenter 2-Fächer-Bachelor-Studiengang mit Lehramtsoption“ an der Stiftung Universität Hildesheim durchgeführt wurde. Dieser Befragung ging in beiden Studiengängen eine Zeitbudgeterhebung voraus. Zentrale Ergebnisse werden im Folgenden vorgestellt und im Weiteren exemplarisch in den wissenschaftlichen Diskurs eingebunden. Deutlich wird, dass das Gefühl von Belastung nicht auf die reine Zeitinvestition in das Studium zurückzuführen ist, sondern auch in engem Zusammenhang mit der vorherrschenden Lehrorganisation an der Hochschule und den eigenen studentischen Kompetenzen zu sehen ist.

Digital unterwegs ohne das virtuelle soziale Netzwerk – qualitative Studie über Facebook-Verweigerung und Virtual Identity Suicide

Das virtuelle soziale Netzwerk Facebook feiert seinen zehnten Geburtstag. Mit über einer Milliarde aktiver Nutzer ist es seit seiner Entstehung zur weltweit größten Internetplattform zur Kommunikation avanciert. Dennoch gibt es in Deutschland eine große Anzahl an Menschen, die sich zwar täglich im Internet bewegt, aber auf eine Mitgliedschaft bei Facebook verzichtet. In dieser Arbeit werden die Gründe untersucht, warum manche Personen Facebook nicht nutzen. Die Leitfrage der Arbeit lautet: „Warum nutzen ausgewählte deutsche Internetnutzer Facebook nicht?“. Es wird zwischen zwei unterschiedlichen Personenkreisen, den Nicht- und den Ex-Nutzern, unterschieden. Basierend auf Leitfadeninterviews mit 25 Befragten, die mittels einer qualitativen Inhaltsanalyse ausgewertet werden, werden elf verschiedene Gründe für eine Verweigerung von Facebook identifiziert. Für die Nicht-Nutzer stellt die Art der Kommunikation den zentralen Grund dar, Facebook nicht zu verwenden. Die Ex-Nutzer wiederum sehen den fehlenden Nutzen der Anwendung als wichtigstes Argument gegen Facebook.

Bitte recht freundlich!

Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung von Spitzenführungspersonal-Fotos. Sie liefert Antworten auf die Frage, welche Mimik und welche Gestik auf solchen Fotos bei den betrachtenden Personen die positivste Wirkung erzeugt und welche Wirkungsunterschiede existieren, in Abhängigkeit davon, wer das Foto betrachtet und in Abhängigkeit davon, ob auf dem Foto eine weibliche oder männliche Person zu sehen ist. Beim Betrachten von Portraitfotos entstehen bei Menschen automatisch und unbewusst Vorstellungen über die Eigenschaften der abgebildeten Person, so genannte implizite Persönlichkeitstheorien. Die Untersuchung wurde als Online-Befragung in Form einer Bildbewertungsstudie durchgeführt. Als Stimulusmaterial wurden jeweils 16 Fotos einer weiblichen und einer männlichen Spitzenführungskraft produziert, welche unterschiedliche Kombinationen aus Gestiken und Mimiken zeigten, die nach den Attributen Glaubwürdigkeit, Sympathie, Attraktivität, Kompetenz und Entschlossenheit bewertet wurden. Weibliche Spitzenführungskräfte wirken am positivsten, wenn sie eine zugewandte Gestik zeigen. Besonders glaubwürdig wirken sie, wenn sie dazu ein Zahnlächeln zeigen. Kompetenz und Entschlossenheit wird bei weiblichen Spitzenführungskräften am stärksten durch eine Kombination aus einem Schmunzeln und einer zugewandten Gestik vermittelt – Attraktivität und Sympathie durch eine Kombination aus Lachen und einer zugewandten Gestik. Kompetenz und Entschlossenheit werden bei männlichen Spitzenführungskräften ebenfalls durch eine Kombination aus Schmunzeln und einer zugewandten Gestik am stärksten vermittelt. Glaubwürdigkeit wird durch eine Kombination aus Schmunzeln und einer vorgebeugten Gestik am stärksten vermittelt – Attraktivität und Sympathie durch eine Kombination aus Lachen und einer vorgebeugten Gestik.

Pessoa coletiva e sociedades comerciais : dimenção problemática e coordenadas sistemáticas da personificação jurídico-privada

Tese de doutoramento, Direito (Ciências Jurídico-Civis), Universidade de Lisboa, Faculdade de Direito, 2014

Miniaturization and Integration of Optoelectronics for Contact Lens Embedded Display and Wireless Communication

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2013

Fonte de Iluminação LED – Avaliação dos Efeitos Fotobiológicos no Olho e Pele

Tendo por referência a diretiva 2006/95/CE, o trabalho desenvolvido no contexto da disciplina de Dissertação/Projeto/Estágio do Mestrado de Engenharia de Instrumentação e Metrologia, decorreu nas instalações do IEP (Instituto Electrotécnico Português) e teve como objetivo principal o desenvolvimento de um procedimento de avaliação dos efeitos fotobiológicos no olho e pele provocados por fontes de emissão contínua (LED), doravante designado método alternativo ao de referência. Os dois métodos, alternativo e de referência, utilizam respectivamente um foto-radiómetro multicanal e um espetro-radiómetro. O procedimento desenvolvido (método alternativo) de acordo com a norma EN/IEC62471) consiste na aquisição dos valores de irradiância com recurso a um foto-radiómetro e posterior determinação dos valores da radiância, com os quais se faz a avaliação dos efeitos fotobiológicos, para fontes de luz LED (Light Emitting Diode) ou GLS (General Lighting Service). A consulta detalhada da norma EN/IEC62471 e a pesquisa sobre os conceitos, definições, equipamentos e metodologias relacionadas com o tema em causa, constituiu o primeiro passo deste projecto. Com recurso aos dois equipamentos, uma fonte de luz LED (módulo de 12 lâmpadas LED) é avaliada em relação aos perigos (ou riscos) actínico UV e UV-A, ao perigo da luz azul e ainda o perigo térmico na retina e térmico na pele, permitindo fazer uma análise comparativa dos resultados. O método alternativo revelou-se bastante flexível e eficaz, proporcionando bons resultados em termos da irradiância e radiância dos referidos efeitos fotobiológicos. A comparação destes resultados com os valores limites de exposição mencionados na norma EN/IEC6247 permitiu afirmar que a fonte de luz LED avaliada não representa perigo fotobiológico para a saúde humana e classifica-se no grupo de risco “isento”. Uma vez cumpridos os objectivos, entendeu-se que seria uma mais-valia para o trabalho já realizado, estudar outro caso prático. Sendo assim, fez-se a avaliação da radiação de apenas um dos LED´s que constituíam a fonte usada nos ensaios anteriores, com o espetro-radiómetro (método de referência) e com uma distância de 200 mm entre a fonte e o medidor. Neste caso verificaram-se diferenças significativas nas quantidades obtidas quando comparadas com os valores normativos. Concluiu-se que o efeito fotobiológico da luz azul insere-se no grupo de “isento”, sem perigo para a saúde. Contudo, o efeito térmico da retina apresenta um aumento considerável da quantidade de radiância, embora dentro do grupo de risco “isento”. Esta classificação de grupos de risco. Face aos resultados obtidos, pode confirmar-se que as lâmpadas LED apresentam segurança fotobiológica, atendendo aos baixos valores de irradiância e radiância dos efeitos fotobiológicos estudados. Pode ainda afirmar-se que a utilização do foto-radiómetro em alternativa ao espetro-radiómetro se revela mais eficaz do ponto de vista de metodologia prática. Este trabalho demonstra a robustez desses dois equipamentos de avaliação dos efeitos fotobiológicos, e procura estabelecer uma linha de orientação para a prevenção dos efeitos adversos na pele e olhos de todos os seres humanos sujeitos à radiação ótica artificial. Quanto às incertezas de medições, em relação ao processo de medição com foto-radiómetro, a sua estimação não se realizou, devido a não rastreabilidade entre as medições indicadas pelo fabricante, no certificado de calibração e as medidas realizadas por outras entidades. Contudo, é propõe-se a sua realização em trabalhos futuros dentro desse âmbito. As incertezas dos resultados de medições com espetro-radiómetro foram parcialmente estimadas. Atendendo às potencialidades do sistema de medição, propõe-se como trabalho futuro, a aplicação da norma IEC62478, que faz parte da aplicação da norma EN/IEC62471 na avaliação do efeito da luz azul, com base na determinação da temperatura de cor correlacionada (CCT) de lâmpadas ou sistemas de lâmpadas incluindo luminárias. Os valores de irradiância e radiância adquiridos nos processos de avaliação, tanto com foto-radiómetro como espectro-radiómetro foram gravados em ficheiro Excel para um CD e anexados a este trabalho.

New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

A filosofia no ensino secundário: um ponto de vista

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ensino de Filosofia no Ensino Secundário

Size-Control Regulation during Regeneration

Functional regeneration of organs upon injury is a key process for animals survival. Contrary to humans, some vertebrates are remarkably competent in regenerating after acute organ or appendage lesions. This advantageous skill allows overcoming limitations in repair even in adult stages, when tissues are fully developed, via a process of epimorphic regeneration. One such organism is the zebrafish, which can regenerate several organs, namely its heart, retina, spinal cord and fins. (...)

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Stem Cell Transplantation for Retinal Degenerations

Within the last few years, several reports have revealed that cell transplantation can be an effective way to replace lost neurons in the central nervous system (CNS) of patients affected with neurodegenerative diseases. Concerning the retina, the concept that newborn photoreceptors can integrate the retina and restore some visual functions was univocally demonstrated recently in the mouse eye (MacLaren et al. 2006) and remains to be achieved in human. These results pave the way to a standard approach in regenerative medicine aiming to replace lost photoreceptors. With the discovery of stem cells a great hope has appeared towards elaborating protocols to generate adequate cells to restore visual function in different retinal degeneration processes. Retinal stem cells (RSCs) are good candidates to repair the retina and are present throughout the retina development, including adulthood. However, neonatal mouse RSCs derived from the radial glia population have a different potential to proliferate and differentiate in comparison to adult RSCs. Moreover, we observed that adult mouse RSCs, depending on the culture conditions, have a marked tendency to transform, whereas neonatal RSCs show subtle chromosome abnormalities only after extensive expansion. These characteristics should help to identify the optimal cell source and culture conditions for cell transplantation studies. These results will be discussed in light of other studies using RSCs as well as embryonic stem cells. Another important factor to consider is the host environment, which plays a crucial role for cell integration and which was poorly studied in the normal and the diseased retina. Nonetheless, important results were recently generated to reconsider cell transplantation strategy. Perspectives to enhance cell integration by manipulating the environment will also be presented.