Identification of genes regulated by mir-363*, a regulator of bone marrow endothelial cell properties

As células estaminais hematopoiéticas residem na medula óssea e possuem capacidade para se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de células sanguíneas. O endotélio da medula óssea é constituído por células endoteliais de medula óssea (BMEC) e compreende dois nichos com funções distintas: o nicho osteoblástico e o nicho vascular. O nicho osteoblásctico proporciona condições para a quiescência de células estaminais hematopoiéticas, enquanto no nicho vascular ocorre proliferação e diferenciação das mesmas. Quando ocorre um desequilíbrio na expressão de genes que codificam para proteínas envolvidas na mobilização de células do nicho osteoblástico para o nicho vascular – factores angiócrinos – ocorre uma desestabilização do microambiente medular, que se pode traduzir num processo tumoral. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes, de cadeia simples, que regula a expressão génica. Os miRNAs são sequências endógenas de RNA que possuem entre 19 e 25 nucleótidos de tamanho. Os miRNAs são reguladores da expressão genica, induzindo o silenciamento a nível da pós-transcrição, através da sua ligação com uma sequência específica para a qual possuem afinidade, na região 3’ não traduzida (3’ UTR) dos seus mRNA alvo, conduzindo à inibição da tradução ou à sua degradação. Os miRNAs estão envolvidos na regulação de genes de diversas vias afectando processos fundamentais como hematopoiese, apoptose, proliferação celular e tumorigénese. Os níveis de expressão dos miRNAs estão alterados no cancro, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Os perfis dos níveis de expressão de vários miRNAs foram estudados, tendo-se verificado que se alteram durante o processo de carcinogénese, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Apesar do miR-363* estar envolvido na regulação da expressão de genes que regulam propriedades das células endoteliais e medula óssea, os genes sobre os quais exerce a sua função ainda não foram identificados.O objectivo do presente estudo é a identificação dos genes directamente regulados pelo miR-363* (genes alvo) e a sua relevância para a disfunção medular e a sua caracterização nos síndromes mielodisplásicos. A estratégia usada baseou-se na redução ou aumento forçados dos níveis de miR-363* em células endoteliais e subsequente análise da expressão génica através de microarrays de cDNA do genoma humano. A redução do miR-363* vai implicar o aumento da expressão dos seus genes alvo, assim como o aumento dos níveis do miR-363* vai induzir a degradação e consequente redução dos seus genes alvos. A intersecção dos dados gerados através do estudo da expressão com bases de dados que possuem algoritmos para previsão de genes alvo directos dos miRNAs (miRBase e MicroCosm Targets) permitiu restringir os genes a analisar a sete genes, nomeadamente BST1, ESAM, FCER1G, IKBKG, SELE, THBS3 e TIMP1. A interacção directa destes candidatos a alvos directos do miR-363* foi posteriormente validada. Para tal, as 3’UTR dos genes foram clonadas num vector que contém o gene da luciferase. Uma vez as clonagens realizadas, efectuaram-se ensaios funcionais em células endoteliais, nomeadamente HUVEC, nas quais se co-transfectaram os vectores gerados, anti-miRs ou pre-miRs (para diminuir ou aumentar o nível de miRNA) e o plasmídeo controlo da Renilla para normalização dos ensaios de luciferase. A variação da luminescência obtida em presença do aumento ou redução do miR-363* deu uma forte indicação da regulação directa do miR-363* nesses alvos. No entanto, a confirmação desta interacção directa foi efectuada através de ensaios de mutagénese, nos quais de induziram mutações na 3’UTR nos locais de ligação do miRNA, seguidos dos ensaios funcionais como acima descritos. Esta estratégia sugere que o TIMP1, inibidor da metaloprotease-9 (MMP-9), é regulado directamente pelo miR-363*. Adicionalmente, os níveis de expressão dos alvos directos do miR-363* foram estudados em 17 amostras de aspirados de medula óssea de doentes com síndromes mielodisplásicos. Os síndromes mielodisplásicos são caracterizados como um grupo heterogéneo de condições, que apresentam citopenias (produção deficiente de eritrócitos, leucócitos e/ou megacariócitos) e medula óssea displástica e hipercelular. A escalonagem dos doentes foi feita de acordo com o sistema de prognóstico IPSS elaborado pela Organização Mundial de Saúde, e que consiste numa tabela de risco de progressão de síndromes mielodisplásicos para leucemia mielóide aguda (LMA) e que agrupa os doentes em baixo risco – que compreende os níveis baixo e intermédio 1 – e em alto risco – que compreende os níveis intermédio 2 e alto. Dos genes regulados pelo miR-363*, o destacam-se o TIMP1, estando aumentando em doentes com mau prognóstico, e o THBS3 que apresenta um aumento nos doentes com prognóstico intermédio. Em suma, os estudos realizados permitiram a identificação de genes regulados pelo miR-363* e contribuiram para o conhecimento de como o miR-363* contribui para a disfunção medular, particularmente em síndromes mielodisplásicos, pela desregulação das propriedades endoteliais.

Differential requirements of aPKC activity within different epithelial tissues

Epithelial tissues are essential during morphogenesis and organogenesis. During development, epithelial tissues undergo several different remodeling processes, from cell intercalation to cell change shape. An epithelial cell has a highly polarized structure, which is important to maintain tissue integrity. The mechanisms that regulate and maintain apicobasal polarity and epithelial integrity are mostly conserved among all species and in different tissues within the same organism. aPKC-PAR complex localizes in the apical domain of polarized cells, and its function is essential for apicobasal polarization and epithelial integrity. In this work we characterized two novel alleles of aPKC: a temperature sensitive allele (aPKCTS), which has a point mutation on a kinase domain, and another allele with a point mutation on a highly conserved amino acid within the PB1 domain of aPKC (aPKCPB1). Analysis of the aPKCTS mutant phenotypes, lead us to propose that during development different epithelial tissues have differential requirements of aPKC activity. More specifically, our work suggests de novo formation of adherens junctions (AJs) is particularly sensitive to sub-optimal levels of apkc activity. Analysis of the aPKCPB1 allele, suggests that aPKC is likely to have an apical structural function mostly independent of its kinase activity. Altogether our work suggests that although loss of aPKC function is associated to similar epithelial phenotypes (e.g., loss of apicobasal polarization and epithelial integrity), the requirements of aPKC activity within these tissues are nevertheless likely to vary.

Effect of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) on the proliferation and extracellular matrix mineralization and gene expression of gilthead seabream skeletal cell lines

The aquaculture industry aims at replacing significant amounts of marine fish oil by vegetable oils in fish diet. Dietary lipids have been shown to alter the fatty acid composition of bone compartments, which would impact the local production of factors controlling bone formation. Knowledge on the mechanisms underlying the nutritional regulation of bone metabolism is however scarce in fish. Two in vitro bone-derived cell systems developed from seabream (an important species for aquaculture in the Mediterranean region) vertebra, capable of in vitro mineralization and exhibiting prechondrocyte (VSa13) and pre-osteoblast (VSa16) phenotype, were used to assess the effect of certain polyunsaturated fatty acids (PUFAs; arachidonic (AA), eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids) on cell proliferation, extracellular matrix (ECM) mineralization and gene expression. While all PUFAs promoted morphological changes in both cell lines, VSa16 cell proliferation appeared to be stimulated by PUFAs in a dose dependent manner until 100M, whereas proliferation of VSa13 cells was impaired at concentrations above 10M. AA, EPA and DHA inhibited VSa13 ECM mineralization, alone and in combination, while VSa16 ECM mineralization was only inhibited by AA and EPA. DHA had the opposite effect, increasing mineralization almost by 2 fold. When EFAs were combined, DHA apparently compensated for the inhibitory effect of AA and EPA. Expression of marker genes for bone and lipid metabolisms has been investigated by qPCR and shown to be regulated in pre-osteoblasts exposed to individual PUFAs. Our results show that PUFAs are effectors of fish bone cell lines, altering cell morphology, proliferation and mineralization when added to culture medium. This work also demonstrates the suitability of our in vitro cell systems to get insights into mineralization-related effects of PUFAs in vivo and to evaluate the replacement of fish oils by vegetable oil sources in fish feeds.

Central micro-hídrica incorporada em conduta adutora

No presente Trabalho foi efectivado um Estudo sobre a viabilidade técnico-económica sobre o aproveitamento eficiente da energia hídrica excedentária nas condutas adutoras dos sistemas de captação, tratamento e distribuição de águas, através da implementação, imediatamente a montante das Estações de Tratamento de Águas, de miniturbinas hidráulicas incorporadas nas condutas e acopladas a geradores de energia eléctrica assíncronos. Esta energia excedentária integra-se no duplo conceito de energia renovável e de energia alternativa – renovável porque a fonte primária é a água acumulada nas albufeiras das barragens; alternativa porque a produção de energia eléctrica é utilizada em consumo nas Instalações de Tratamento de Águas (ETA) em alternância ou/e em simultâneo com a energia da rede. Este Estudo resultou de uma proposta dirigia a Águas do Algarve, S.A. cuja aceitação culminou na elaboração do Projecto Base da Central Mini-Hídrica (CMH) do Beliche, localizada na ETA do Beliche (Sistema Multimunicipal de Abastecimento de Águas do Algarve). A construção da CMH foi da responsabilidade da empresa Electrolagos, CRL, e foi concluída nos fins de 2010, encontrando-se actualmente em plena exploração. Os resultados já obtidos permitem concluir que a instalação é eficiente, energética e economicamente, excedendo, nesta primeira fase, as expectativas relativamente à excelente integração no sistema de auto-regulação do caudal de entrada. O Projecto é inovador, não só porque aplica diversos equipamentos standards de utilizações convencionalmente diferentes, mas também porque congrega essa diversidade num único modelo. As inovações fundamentais consistem em: -Utilização de bombas hidráulicas tradicionais a funcionar como miniturbinas, sistema PaT (Pumb as Turtine) de recente aplicação e em plena investigação; -Utilização de Máquinas Assíncronas a funcionar como geradores de energia eléctrica a 50Hz; -Injecção directa da energia produzida na Instalação e/ou na Rede de Distribuição sem sistema de conversão. A integração directa da MCH na adutora também constitui uma inovação pois, tradicionalmente, estas instalações são isoladas (sistema ‘ilha’) ou em paralelo ou ainda em derivação relativamente a condutas. Esta inovadora integração implicou testes pormenorizados das canalizações de adução e de impulsão, assim como a escolha de equipamentos e acessórios adequados, de modo a não interferir e perturbar significativamente os parâmetros nominais do funcionamento normal da ETA (caudais; velocidades; pressões). O Trabalho aqui apresentado está totalmente em linha com a Estratégia Nacional para a Energia (Resolução 29/2010 do concelho de Ministros) no sentido que contribui para a redução da dependência energética externa através do uso de energias renováveis e para a redução das emissões de CO2.

Elaboração de um manual de gestão ambiental para autarquias: uma ferramenta para a sustentabilidade

O aumento da degradação ambiental, que se tem vindo a verificar ao longo dos anos tem conduzido a um despertar para as questões ambientais. Surge assim a necessidade, ao nível das organizações em geral, de integrar a gestão dos seus aspectos ambientais na sua gestão comum, pelo que a implementação de sistemas de gestão ambiental como mecanismo de auto-regulação, tem vindo a ser encarada pelas organizações como uma visão pró-activa, que além de evitar soluções dispendiosas de tratamento e eventuais multas por incumprimento legal, promove a eficácia económica das empresas e melhora continuamente o seu desempenho ambiental. Esta filosofia é já bastante comum nas empresas, sendo que a administração pública, e em particular o governo local, começou recentemente a dar os primeiros passos nesta matéria. Com este trabalho pretende-se criar um documento orientador para o Governo Local, no âmbito da implementação de um sistema de gestão ambiental. O presente documento constitui o relatório base onde é feito um enquadramento da temática ao nível do governo local, num contexto nacional e internacional, são enunciados os objectivos e explicada a metodologia inerente ao desenvolvimento do estudo; O segundo documento que constitui o estudo, é o Manual de Gestão Ambiental que contem uma abordagem da metodologia de implementação faseada de um sistema de gestão ambiental e possibilita a adopção de boas práticas ambientais, ao nível das actividades desenvolvidas nestas organizações. O manual pretende constituir uma base de orientação para as Autarquias locais, de forma que estas possam, através da metodologia proposta, reduzir os impactes ambientais associados às suas actividades e melhorar continuamente o seu desempenho ambiental.

Compostagem e caracterização de resíduos vegetais para utilização como substratos hortícolas

O objectivo deste trabalho foi estudar a utilização de 5 compostos de resíduos de origem vegetal, como componentes de substratos hortícolas. Estudaram-se os processos de compostagem de bagaço de azeitona, bagaço de uva, polpa de alfarroba, casca de eucalipto e casca de pinheiro, caracterizaram-se os compostos obtidos e testou-se a sua aptidão agronómica, como substratos para viveiro de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) em placas alveoladas e cultura de pelargónio (Pelargonium x hortorum) em vaso. Após uma preparação prévia, que em alguns dos resíduos vegetais constou de moenda, suplemento de azoto e aumento do teor de humidade, efectuou-se a sua compostagem em caixas com 1200 L de capacidade, isoladas termicamente, com arejamento por volteio manual. Depois foram analisadas as suas características físicas e químicas e testados na sua aptidão como constituintes únicos de substratos e em misturas com turfa de sphagnum. A maioria dos processos de compostagem apresentou uma evolução habitual da temperatura, com a máxima aproximando-se ou ultrapassando 60 oC. Como excepções, verificou-se um período de compostagem muito longo em bagaço de azeitona; o atraso da fase termofílica em polpa de alfarroba e, na 1ª compostagem de casca de pinheiro, a temperatura não alcançou a zona termofílica. A maioria dos resíduos manifestaram uma acentuada resistência à degradação durante a compostagem, à excepção da polpa de alfarroba e da casca de eucalipto. Contudo, a nível físico-químico e químico registaram-se evoluções acentuadas, sobretudo nas variáveis relacionadas com alterações da superfície das partículas, como por exemplo, a capacidade de troca catiónica. Outras variáveis apresentaram uma evolução interessante para o acompanhamento do processo e o conhecimento do grau de estabilidade do composto final. Foi apreciável o efeito proporcionado pela adição de lamas de estação de tratamento de águas residuais urbanas, como suplemento azotado, a nível das propriedades físicas dos compostos, do aumento da velocidade do processo de compostagem e do enriquecimento dos compostos em macro e micronutrientes. A compostagem não conduziu à melhoria significativa das propriedades físicas dos materiais, excepto em casca de eucalipto. Os compostos caracterizaram-se fundamentalmente por uma reduzida capacidade de retenção de água e uma elevada capacidade de arejamento. Os compostos obtidos com incorporação de lamas apresentaram os valores mais baixos de capacidade de arejamento, mesmo assim dentro dos limites satisfatórios e, os valores mais altos de capacidade de retenção de água. Na cultura em placas alveoladas, o comportamento de muitas das misturas com compostos não se diferenciou do da testemunha, observando-se uma flutuação sazonal do comportamento das misturas nos dois viveiros de cada ano, associada às condições ambientais mais exigentes do ponto de vista da disponibilidade de água. Observou-se um maior número de correlações significativas entre as características dos substratos e as variáveis relativas ao crescimento das plantas nos viveiros efectuados mais tarde, sob condições de maior evapotranspiração. As plantas obtidas no segundo viveiro de tomate foram instaladas em cultura. As características das plantas do viveiro, apresentaram elevada correlação com as respectivas produções obtidas no campo, evidenciando a importância da qualidade das plantas de viveiro, na produção. Nos ensaios de pelargónio em vaso, também se observaram comportamentos idênticos ao da testemunha em muitas das misturas com compostos. Observou-se no 2º ensaio, um maior número de tratamentos com resultados idênticos aos da testemunha, resultante das condições de menor exigência hídrica, as quais fizeram sobressair menos as diferenças de propriedades físicas das misturas. Contudo, a diferença de crescimento obtido em algumas misturas, atribuiu-se também à interferência da continuidade capilar entre o vaso de papel com a estaca enraizada e a mistura em estudo. O trabalho presente mostrou que é possível obter compostos a partir de resíduos orgânicos, com boas características e a preço competitivo para utilização como substratos hortícolas. O processo de compostagem sendo um elemento chave, é fácil de controlar se houver uma regulação eficaz do arejamento e do teor de humidade durante o processo. Apesar de alguns resíduos, como a polpa de alfarroba, serem caros, se tomarmos em consideração o custo da sua eliminação, poderão conduzir a substratos comercialmente viáveis. Em condições ambientais que favoreçam uma maior evapotranspiração ou, em culturas com maior exigência hídrica, pode ser aconselhável a mistura dos compostos estudados com turfa de sphagnum pouco decomposta para melhorar a capacidade de retenção de água.

In vitro blood-brain barrier models to predict the permeation of gene therapy vectors into the brain

A terapia génica tem-se revelado uma alternativa relevante no tratamento de doenças neurodegenerativas (DN). Contudo, a entrega de vetores para transferência génica no cérebro representa ainda um enorme desafio devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE). A BHE é uma interface dinâmica e seletiva entre o sangue e o cérebro, constituída pelas células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos, desempenhando um importante papel na regulação da homeostasia cerebral. A BHE representa um dos maiores obstáculos no tratamento de DN, uma vez que esta barreira impede o transporte para o cérebro da maioria das moléculas terapêuticas, incluindo os vetores para terapia génica. Embora tenham sido desenvolvidos diferentes modelos in vitro da BHE de forma a avaliar o transporte de fármacos através da BHE, muito poucos foram criados com o intuito de testar a permeabilidade desta barreira a vetores de terapia génica. O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e a avaliação de modelos in vitro de BHE que permitam a investigação da capacidade dos vetores de terapia génica de penetrarem no cérebro. No nosso estudo, foram testados diferentes modelos in vitro de BHE em monocultura, constituídos por células endoteliais de rato ou murganho (RBE4 e bEnd3, respetivamente), e modelos de co-cultura, que combinam células endoteliais com células neuronais (Neuro2a) ou astrócitos primários, cultivados num sistema transwell. Para caraterizar estes modelos foram realizados testes de permeabilidade e de resistência elétrica transendotelial, bem como estudos baseados na técnica de PCR quantitativo e na imunocitoquímica das proteínas das junções intercelulares. Verificámos que os modelos baseados na cultura de células bEnd3 e células neuronais ou astrócitos apresentavam as melhores propriedades de barreira. Posteriormente foi avaliada nos modelos selecionados a penetração de um vetor não-viral que reconhecidamente tem a capacidade de atravessar in vivo a BHE: o peptídeo da glicoproteína do vírus da raiva (RGV-9r). Os siRNAs marcados com um fluoróforo e acoplados ao peptídeo RVG-9r foram capazes de penetrar eficientemente as células bEnd3, localizadas no lado luminal do insert, via endocitose mediada por recetores, e ainda de penetrar os astrócitos ou células neuronais, previamente cultivadas no lado abluminal. Estes resultados correlacionam-se, de forma clara, com os resultados previamente descritos em estudos in vivo. Em conclusão, os modelos in vitro de BHE baseados na co-cultura de células bEnd3 com células Neuro2a ou astrócitos, têm grande potencial na seleção de candidatos a vetores de terapia génica para o cérebro, uma vez que apresentam importantes características da BHE e se baseiam num método fácil e reprodutível. Tal facto representa uma promessa significativa para a identificação de novas estratégias de terapia génica não invasiva para o tratamento de doenças neurológicas.

Crescimento e condição nutricional de larvas de sardinha em condições controladas

Com o objectivo de determinar o crescimento de larvas de sardinha foram realizadas experiências em condições controladas. Um cardume de sardinhas adultas foi mantido em cativeiro e a desova induzida por meios naturais (aumento da disponibilidade alimentar, regulação da temperatura para cerca de 15º C e salinidade para ~35‰). Quando ocorreram desovas com mais do que 500 ovos num determinado dia, estes foram colocados a eclodir em condições controladas. As larvas de sardinha apresentaram um desenvolvimento morfológico normal (p.e. pigmentação dos olhos e desenvolvimento da boca entre o 3º e 4º dia). Diferentes tipos e combinações de alimentos foram experimentados (nauplios de Acartia grani, rotíferos e Gymnodinium sp.) e analisou-se a condição nutricional das larvas amostradas. Foram efectuadas experiências de inanição para se poder calibrar os resultados obtidos. As taxas de crescimento variaram entre 0.12 e 0.36 mm.dia-1, sendo a mais elevada correspondente a uma experiência de inanição. Observou-se, através da histologia, que dietas ricas em Acartia grani são mais favoráveis para um melhor desenvolvimento larvar. As análises da razão RNA/DNA sugerem que há uma forte possibilidade de os efeitos parentais terem bastante influência no desenvolvimento e crescimento das larvas de sardinha nas duas primeiras semanas de vida, mas não na sua sobrevivência, que dependeu da quantidade e qualidade de alimento fornecida.

Contribuições da análise de opções reais na avaliação de projectos de investimento

Os modelos de avaliação baseados na análise tradicional foram considerados, durante anos, como os métodos de excelência, para avaliar projetos de investimento. No entanto, devido à importância estratégica de alguns setores, onde se inclui o setor dos transportes, a análise tradicional foi sendo posta em causa, dando espaço para que novas abordagens relacionadas com a tomada de decisões em contexto de incerteza emergissem, como é o caso da metodologia das opções reais. Neste contexto na presente dissertação argumenta-se que a avaliação de um projeto de investimento recorrendo à análise de opções reais, é um método que apresenta algumas vantagens comparativamente com o tradicional modelo dos fluxos de caixa atualizados. Mais precisamente, é analisada a política ótima de decisão de investimento no novo aeroporto. Trata-se de um exemplo característico de cálculo da opção de diferimento inerente à tomada de decisão, que consiste, essencialmente, na oportunidade de esperar para realizar o projeto. As fórmulas desenvolvidas no presente trabalho permitem determinar o valor de um projeto de investimento com opção de diferimento, tendo por base um conjunto de pressupostos. Assim, considera-se que os fluxos de caixa do projeto são obtidos com base em variáveis (estocásticas e determinísticas) e que o valor do investimento é fixo. Mais, pressupõe-se que as variáveis estocásticas seguem um movimento geométrico Browniano. É ainda possível, obter o valor crítico para as variáveis do modelo, isto é, o valor a partir do qual é ótimo exercer a opção de diferimento, ou seja, avançar com o projeto.

Study of influence of regulatory polymorphisms of expression in development of breast cancer

The human genome has millions of genetics variants that can affect gene expression. These variants are known as cis-regulatory variants and are responsible for intra-species phenotypic differences and individual susceptibility to disease. One of the diseases affected by cis-regulatory variants is breast cancer. Breast cancer is one of the most common cancers, with approximately 4500 new cases each year in Portugal. Breast cancer has many genes mutated and TP53 has been shown to be relevant for this disease. TP53 is one of the most commonly mutated genes in human cancer and it is involved in cell cycle regulation and apoptosis. Previous work by Maia et al has shown that TP53 has differential allelic expression (DAE), which suggests that this gene may be under the influence of cis-regulatory variants. Also, its DAE pattern is totally altered in breast tumours with normal copy number. We hypothesized that cis-regulatory variants affecting TP53 may have a role in breast cancer development and treatment. The present work aims to identify the cis-regulatory variants playing a role in TP53 expression, using in silico, in vitro and in vivo approaches. By bioinformatic tools we have identified candidate cis-regulatory variants and predicted the possible transcription factor binding sites that they affect. By EMSA we studied DNA-protein interactions in this region of TP53. The in silico analysis allowed us to identified three candidate cis-regulatory SNPs which may affect the binding of seven transcription factors. However, the EMSA experiments have not been conclusive and we have not yet confirmed whether any of the identified SNPs are associated with gene expression control of TP53. We will carry out further experiments to validate our findings.

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Marine foundation species shifting ranges and genetic baselines

This thesis revealed the most importance factors shaping the distribution, abundance and genetic diversity of four marine foundation species. Environmental conditions, particularly sea temperatures, nutrient availability and ocean waves, played a primary role in shaping the spatial distribution and abundance of populations, acting on scales varying from tens of meters to hundreds of kilometres. Furthermore, the use of Species Distribution Models (SDMs) with biological records of occurrence and high-resolution oceanographic data, allowed predicting species distributions across time. This approach highlighted the role of climate change, particularly when extreme temperatures prevailed during glacial and interglacial periods. These results, when combined with mtDNA and microsatellite genetic variation of populations allowed inferring for the influence of past range dynamics in the genetic diversity and structure of populations. For instance, the Last Glacial Maximum produced important shifts in species ranges, leaving obvious signatures of higher genetic diversities in regions where populations persisted (i.e., refugia). However, it was found that a species’ genetic pool is shaped by regions of persistence, adjacent to others experiencing expansions and contractions. Contradicting expectations, refugia seem to play a minor role on the re(colonization) process of previously eroded populations. In addition, the available habitat area for expanding populations and the inherent mechanisms of species dispersal in occupying available habitats were also found to be fundamental in shaping the distributions of genetic diversity. However, results suggest that the high levels of genetic diversity in some populations do not rule out that they may have experienced strong genetic erosion in the past, a process here named shifting genetic baselines. Furthermore, this thesis predicted an ongoing retraction at the rear edges and extinctions of unique genetic lineages, which will impoverish the global gene pool, strongly shifting the genetic baselines in the future.

The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

Evolution, gene regulation and functional analysis of BMP2 in fish

Bone morphogenetic proteins (BMPs) are multifunctional growth factors belonging to the transforming growth factor β (TGFβ) superfamily with a central role in bone formation and mineralization. BMP2, a founding member of this family, has demonstrated remarkable osteogenic properties and is clinically used to promote bone repair and fracture healing. Lack of basic data on factors regulating BMP2 expression and activity have hampered a better understanding of its role in bone formation and bone-related diseases. The objective of this work was to collect new functional data and determine spatiotemporal expression patterns in a fish system aiming towards a better understanding of BMP2 function and regulation. Transcriptional and post-transcriptional regulation of gilthead seabream BMP2 gene was inferred from luciferase reporter systems. Several bone- and cartilage-related transcription factors (e.g. RUNX3, MEF2c, SOX9 and ETS1) were found to regulate BMP2 transcription, while microRNA 20a was shown to affect stability of the BMP2 transcript and thus the mineralogenic capacity of fish bone-derived host cells. The regulation of BMP2 activity through an interaction with the matrix Gla protein (MGP) was investigated in vitro using BMP responsive elements (BRE) coupled to luciferase reporter gene. Although we demonstrated the functionality of the experimental system in a fish cell line and the activation of BMP signaling pathway by seabream BMP2, no conclusive evidence could be collected on a possible interaction beween MGP and BMP2. The evolutionary relationship among the members of BMP2/4/16 subfamily was inferred from taxonomic and phylogenetic analyses. BMP16 diverged prior to BMP2 and BMP4 and should be the result of an ancient genome duplication that occurred early in vertebrate evolution. Structural and functional data suggested that all three proteins are effectors of the BMP signaling pathway, but expression data revealed different spatiotemporal patterns in teleost fish suggesting distinct mechanisms of regulation. In this work, through the collection of novel data, we provide additional insight into the regulation, the structure and the phylogenetic relationship of BMP2 and its closely related family members.

Neuroendocrinologia do comportamento social no ciclídeo africano Oreochromis mossambicus: mecanismos reguladores e modulação social da reprodução

A reprodução em teleósteos é controlada pelo eixo hipotálamo-pituitária-gónada (HPG) que modula a gametogénese, o desenvolvimento dos caracteres secundários e a expressão do comportamento reprodutor. A informação sobre fatores endógenos e exógenos é integrada no cérebro e a atividade do eixo HPG é regulada, fazendo com que traços comportamentais sejam expressos no momento e no contexto certos. Fatores exógenos relacionados com condições físicas do ambiente (e.g. temperatura e fotoperíodo) têm o papel principal no controlo da reprodução. No entanto, o estatuto social e o contexto social têm sido menos estudados. Mecanismos hormonais e neuroendócrinos são muito conservados ao longo dos vertebrados, fazendo dos peixes um bom modelo para o estudo da endocrinologia do comportamento. Os objetivos gerais deste trabalho consistem em determinar de que forma o contexto social interfere na expressão do comportamento e o papel de mecanismos hormonais e neuroendócrinos nesse processo, sendo abordados dois mecanismos, os androgénios e os neuropéptidos arginina vasotocina (AVT) e Isotocina (IT), dando-se especial relevância à AVT. A tilápia moçambicana (Oreochromis mossambicus) foi o modelo usado. A a sua biologia é bem conhecida, é muito adaptável a condições artificiais, e que tem uma importância económica crescente. Esta espécie possui um sistema social elaborado, com machos a organizarem-se em arenas reprodutoras, onde escavam depressões no substrato, para as quais atraem as fêmeas para a reprodução. Todos os trabalhos apresentados nesta dissertação tiveram como como sujeito focal o macho. Esta tese está organizada quatro capítulos. No capítulo I- Introdução geral, é apresentada uma revisão da literatura relevante para enquadrar o presente trabalho. Os capítulos II e III englobam os 4 artigos científicos que foram redigidos, denominados de artigo 1 a 4, consoante a ordem em que são apresentados na tese. O capítulo II, intitulado “Modulação social da reprodução”, é apresentado um estudo (artigo 1) que aborda o efeito do ambiente social no comportamento e no estado fisiológico da tilápia moçambicana. Com este trabalho pretendia-se perceber qual o efeito do contexto de instabilidade social nos níveis plasmáticos hormonais e a influência destes contextos na criação de padrões de comportamento. Gerou-se com sucesso um cenário de instabilidade social, através da substituição de machos dominantes entre replicados, por oposição ao contexto social estável em que os animais foram retirados e reintroduzidos no mesmo aquário. Em contexto social instável verificou-se tal como esperado, um aumento do comportamento agonístico. Apesar da agressividade não ter sido acompanhada pelo aumento dos níveis hormonais, os resultados sugerem que os androgénios funcionam como fator de reforço da integração na criação de padrões comportamento em contexto social instável, mostrando assim uma otimização do comportamento em períodos de instabilidade social. No capítulo III, intitulado “Mecanismos reguladores do comportamento social”, são apresentados três artigos e foi dividido em duas secções. Na primeira é abordado o papel dos androgénios (artigo 2) e na segunda o papel da AVT e IT (artigo 3 e 4) na regulação do comportamento social. Em relação ao estudo do papel dos androgénios (artigo 2), pretendeu-se estudar o efeito da falta de androgénios em circulação na exibição do comportamento agonístico e reprodutor. Para tal, procedeu-se à castração de machos de tilápia. A remoção integral das gónadas baixou os níveis de androgénios em cerca de 90% para a testosterona e quase 100% para 11KT e provocou uma completa abolição do comportamento reprodutor (construção do ninho, coloração nupcial e corte), no entanto o comportamento agonístico não foi afetado. Revelou-se desta forma que o mecanismo de regulação do comportamento reprodutor e agonístico é diferente, com os androgénios como agentes mediadores do comportamento reprodutor e moduladores do comportamento agonístico, uma vez que a literatura existente relaciona os androgénios com o comportamento agonístico nesta espécie. O estudo da regulação da AVT e IT em função do estatuto social foi efetuado com duas abordagens diferentes, resultando em dois artigos científicos (artigo 3 e 4). A primeira tinha como objetivo perceber se a AVT e IT estava distribuída por todo o cérebro em quantidades mensuráveis ou apenas em alguma área específica, além de perceber qual a diferença dos níveis cerebrais e glândula pituitária entre machos dominantes e subordinados. Procedeu-se ao doseamento da AVT e IT no cérebro através de cromatografia de fase líquida (high performance liquid cromatography, HPLC) em machos dominantes e subordinados (com o estatuto estabilizado há pelo menos 5 semanas). O cérebro foi dividido em 7 áreas [bolbos olfativos, telencéfalo, teto ótico, diencéfalo, cerebelo, rombencéfalo e pituitária (considerada como área cerebral para efeitos comparativos)]. Verificou-se que a área que apresentou uma maior concentração de neuro péptidos (AVT e IT) foi a pituitária, seguida dos bolbos olfactivos e finalmente as restantes áreas. A existência destes neuropéptidos no bolbo olfactivo sugere que a AVT e IT estão implicadas no mecanismo de reconhecimento social. Esta relação tem particular importância para esta espécie uma vez que a Tilápia usa o mecanismo do olfacto, por exemplo para o reconhecimento do estado reprodutivo das fêmeas. Machos subordinados apresentaram concentrações de AVT superiores na pituitária, o que sugere a influência da AVT num processo fisiológico específico relacionado com a subordinação. Uma vez que machos subordinados armazenam menos urina do que machos dominantes (machos dominantes armazenam grandes quantidades de urina que libertação de forma pulsátil, de forma dependente do contexto, aumentando o número de pulsos na presença de machos rivais ou fêmeas pré-ovuladas). A AVT pode estar a exercer um efeito antidiurético nos machos subordinados diminuindo assim a produção de urina. Machos dominantes apresentaram valores superiores de IT no rombemcéfalo, sugerindo que a isotocina pode estar relacionada com o comportamento social em dominantes. Para avaliar o efeito do estatuto na organização dos grupos neuronais produtores de AVT (situados na área pré-ótica) foram criadas condições semelhantes à situação anterior, neste caso foram contabilizados os neurónios imunorreativos à AVT na área pré-ótica e medida a área dos corpos celulares em machos dominantes, subordinados e fêmeas. Os grupos neuronais da área pré-ótica são constituídos por células parvocelulares (pPOA), magnocelulares (mPOA) e gigantocelulares (gPOA). A literatura relaciona uma maior expressão de células pPOA em machos subordinados e gPOA em dominantes, no entanto os resultados do artigo 4 mostraram que machos subordinados aumentaram a área dos corpos celulares de todos os grupos neurais, e todos os grupos apresentam projeções para pituitária (apesar de projetarem para outra áreas) sugerindo que este aumento generalizado do tamanho das células implica um aumento da produção de AVT direcionada para a pituitária. As células (principalmente a área dos corpos celulares) correlacionaram-se negativamente com o comportamento agressivo e positivamente com o comportamento de fuga, sugerindo uma inibição geral do comportamento reprodutor e agonístico em machos subordinados. O tamanho das células mPOA está inversamente associado ao peso do rim o que sugere um efeito deste grupo neural no rim provavelmente implicado no mecanismo antidiurético em machos subordinados.