964 resultados para Mécanisme enzymatique
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Il est essentiel pour chaque organisme davoir la possibilit de rguler ses fonctions afin de permettre sa survie et damliorer sa capacit de se reproduire en divers habitats. Avec linformation disponible, il semble que les organismes consacrent une partie assez importante de leur matriel gntique des fonctions de rgulation. On peut envisager que certains mécanismes de rgulation ont persist dans le temps parce quils remplissent bien leurs rles. Les premires tudes sur les procaryotes ont indiqu quil y avait peu de mécanismes de rgulation exerant le contrle des gnes, mais il a t dmontr par la suite quune varit de ces mécanismes est utilise pour la rgulation de gnes et doprons. En particulier, les oprons bactriens impliqus dans la biosynthse des acides amins, lARNt synthtase, la dgradation des acides amins, les protines ribosomales et lARN ribosomal font lobjet dun contrle par lattnuation de la transcription. Ce mécanisme dattnuation de la transcription diffre dautres mécanismes pour la gnration de deux structures diffrentes de lARNm, o lune de ces structures rprime le gne en aval, et lautre permet de continuer la transcription/traduction. Dans le cadre de cette recherche, nous nous sommes intress au mécanisme dattnuation de la transcription chez les procaryotes o aucune molcule ne semble intervenir comme facteur de rgulation, en me concentrant sur la rgulation des oprons bactriens. Le but principal de ce travail est de prsenter une nouvelle mthode de recherche des riborgulateurs qui combine la recherche traditionnelle des riborgulateurs avec la recherche structurale. En incorporant ltude du repliement de lARNm, nous pouvons mieux identifier les attnuateurs rpondant ce type de mécanisme dattnuation. Ce mmoire est divis en quatre chapitres. Le premier chapitre prsente une revue de la littrature sur lARN et un survol sur les mécanismes de rgulation de lexpression gntique chez les procaryotes. Les chapitres 2 et 3 sont consacrs la mthodologie utilise dans cette recherche et limplmentation du logiciel TA-Search. Enfin, le chapitre 4 expose les conclusions et les applications potentielles de la mthode.
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Le glaucome est la deuxime cause de ccit irrversible dans le monde. La perte de vision qui se produit lors du glaucome sexplique par une dgnrescence du nerf optique et une mort progressive et slective des cellules ganglionnaires de la rtine (CRG). L'hypertension oculaire est un facteur de risque majeur dans le glaucome, mais des dfauts du champ visuel continuent se dvelopper chez un contingent de patients malgr l'administration de mdicaments qui abaissent la pression intraoculaire (PIO). Par consquent, bien que la PIO reprsente le seul facteur de risque modifiable dans le dveloppement du glaucome, son contrle ne suffit pas protger les CRGs et prserver la fonction visuelle chez de nombreux patients. Dans ce contexte, j'ai avanc l'hypothse centrale voulant que les stratgies de traitement du glaucome visant promouvoir la protection structurale et fonctionnelle des CRGs doivent agir sur les mécanismes molculaires qui conduisent la mort des ces neurones. Dans la premire partie de ma thse, j'ai caractris l'effet neuroprotecteur de la galantamine, un inhibiteur de l'actylcholinestrase qui est utilis cliniquement dans le traitement de la maladie d'Alzheimer. Cette tude sest base sur l'hypothse que la galantamine, en modulant l'activit du rcepteur de l'actylcholine, puisse amliorer la survie des CRGs lors du glaucome. Nous avons utilis un modle exprimental bien caractris d'hypertension oculaire induite par ladministration d'une solution saline hypertonique dans une veine pisclrale de rats Brown Norway. Les rsultats de cette tude (Almasieh et al. Cell Death and Disease, 2010) ont dmontr que l'administration quotidienne de galantamine amliore de manire significative la survie des corps cellulaires et des axones CRGs. La protection structurelle des CRGs saccompagne dune prservation remarquable de la fonction visuelle, value par l'enregistrement des potentiels voqus visuels (PEV) dans le collicule suprieur, la cible principale des CRGs chez le rongeur. Une autre constatation intressante de cette tude est la perte substantielle de capillaires rtiniens et la rduction du dbit sanguin associ la perte des CRGs dans le glaucome exprimental. Il est trs intressant que la galantamine ait galement favoris la protection de la microvascularisation et amlior le dbit sanguin rtinien des animaux glaucomateux (Almasieh et al. en prparation). J'ai notamment dmontr que les neuro-et vasoprotections mdies par la galantamine se produisent par iv l'activation des rcepteurs muscariniques de l'actylcholine. Dans la deuxime partie de ma thse, j'ai tudi le rle du stress oxydatif ainsi que l'utilisation de composs rducteurs pour tester l'hypothse que le blocage d'une augmentation de superoxyde puisse retarder la mort des CRG lors du glaucome exprimental. J'ai profit d'un compos novateur, un antioxydant base de phosphineborane (PB1), pour tester sur son effet neuroprotecteur et examiner son mécanisme d'action dans le glaucome exprimental. Les donnes dmontrent que l'administration intraoculaire de PB1 entrane une protection significative des corps cellulaire et axones des CRGs. Les voies molculaires conduisant la survie neuronale mdie par PB1 ont t explores en dterminant la cascade de signalisation apoptotique en cause. Les rsultats dmontrent que la survie des CRGs mdie par PB1 ne dpend pas dune inhibition de signalisation de protines kinases actives par le stress, y compris ASK1, JNK ou p38. Par contre, PB1 induit une augmentation marque des niveaux rtiniens de BDNF et une activation en aval de la voie de survie des ERK1 / 2 (Almasieh et al. Journal of Neurochemistry, 2011). En conclusion, les rsultats prsents dans cette thse contribuent une meilleure comprhension des mécanismes pathologiques qui conduisent la perte de CRGs dans le glaucome et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratgies neuroprotectrices et vasoprotectrices pour le traitement et la gestion de cette maladie.
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La leucmie aigu mylode est une hmopathie maligne gntiquement htrogne caractrise par de frquents rarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gne RUNX1. Dans ce groupe danomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associes respectivement un pronostic favorable et dfavorable, sont les mieux tudies. Or, plus de la moiti des rarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractriss au niveau clinique et molculaire. Les principaux objectifs de cette thse sont de caractriser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et dtudier la drgulation transcriptionnelle associe ces anomalies au niveau de cibles plus spcifiques ayant un rle dans lauto-renouvellement ou dans la diffrenciation hmatopotique. laide des techniques de cytogntique et de biologie molculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont t identifis au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la rcurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a t dmontre suite ltude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer lexistence de divers modes de drgulation de RUNX1 dans les leucmies aigus. Lexpression prsume de protines chimriques et/ou disoformes tronques de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gnes partenaires sont des consquences rvles par ltude de ces fusions. Le squenage et lanalyse des jonctions gnomiques des fusions rcurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont dmontr la prsence de signatures molculaires caractristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition diffrente des jonctions, limplication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a t propose. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps rel nous ont permis de dmontrer lexistence de cibles de drgulation partages par les fusions rcurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons dmontr que CEBPA est moins exprim dans la majorit des spcimens tudis prsentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spcimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutt surexprim. Malgr lactivation transcriptionnelle de JUP dans lensemble de ces spcimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont diffremment exprimes dans ces cellules, appuyant lhtrognit dcrite dans ce groupe de leucmies. Malgr limplication de partenaires varis, nos donnes dexpression dmontrent que les chimres et les protines tronques de RUNX1 partagent des cibles communes dactivation et de rpression transcriptionnelle et tablissent, pour la premire fois, des vidences molculaires suggrant lexistence de similitudes entre la fusion rcurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent frquemment dans ce groupe gntique, linhibition de JUP pourrait tre une option thrapeutique intressante et ceci est appuy par les bnfices observs lors de linhibition de la voie Wnt dans dautres groupes gntiques de leucmies aigus.
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Les cellules beta pancratiques scrtent linsuline lors dune augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrl par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. Dautres sources dnergie, comme les acides amins (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la scrtion dinsuline. Une scrtion dinsuline insuffisante au besoin du corps dclanche le diabte. Le rle que joue laugmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la scrtion dinsuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la scrtion dinsuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycrolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont t reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline. Le diacylglycrol, provenant de la lipolyse, a t propos comme un signal lipidique important damplification. Cependant, lhydrolyse des triglycrides et des diacylglycrides a t dmontre essentielle pour la scrtion dinsuline stimule par le glucose, en suggrant un rle du monoacylglycrol (MAG) dans ce processus. Dans cette tude, on dmontre que la rduction de la scrtion dinsuline stimule par le glucose, lors dune inhibition de la lipolyse, est restaure par laddition de MAG. Dans les cellules beta pancratiques, le niveau de MAG augmente en prsence des concentrations leves du glucose, et galement lorsquon inhibe lenzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec linhibiteur spcifique WWL70. Lanalyse lipidomique a dmontr quaprs la stimulation des cellules beta pancratiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, lespce la plus accumule de MAG tait le 1-stearoylglycrol (1-SG). Laddition de 1-SG, de 1-palmitoylglycrol (1-PG) ou de WWL70 augmente la scrtion dinsuline stimule par le glucose, et cette augmentation est indpendante de la gnration de acides gras partir de MAG. Cela suggre que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. De plus, la surexpression du gne dABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une rduction de la scrtion dinsuline, due probablement la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme molculaire impliqu dans la potentialisation de la scrtion dinsuline par le MAG, on a bloqu laction du rcepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par lagent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancratique par AMG9810 entrane une diminution de la potentialisation de la scrtion de linsuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entranerai lentre du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de lexocytose des granules insuline. En soutien de cette hypothse, on a trouv une diminution du calcium intracellulaire lorsquon traite au AMG9810 des cellules beta pancratique de rat (provenant des lots disperss) stimules au glucose et au WWL70. Lensemble des rsultats suggre que le MAG est un mdiateur de la potentialisation lipidique de la scrtion dinsuline stimule par le glucose. Vu que linhibition pharmacologique dABHD6 augmente la scrtion dinsuline, on pourra conclure que cette enzyme reprsente une cible thrapeutique potentielle dans le dveloppement des mdicaments anti-diabtiques, visant une augmentation de la scrtion dinsuline.
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Cette recherche porte sur la dimension interprtative de l'intgration europenne et sur son rle dans la dmocratisation au sein des pays postcommunistes. Je focalise mon attention sur la signification pour les gens desdits pays que revtent la participation politique, la comptence politique, et laction collective. Cette signification prend forme selon des circonstances spcifiques, agences par les relations de pouvoir asymtriques avec lUnion europenne (UE). Jexamine la littrature sur le rle de l'intgration europenne dans la dmocratisation des pays postcommunistes et je distingue deux paradigmes thoriques principaux : un premier qui met l'accent sur le processus institutionnel, lautre sur le processus instrumental stratgique. Au sein de ces deux approches, je prsente diffrents auteurs qui voient l'UE soit comme un facteur pro-dmocratique, soit comme un facteur antidmocratique dans le contexte postcommuniste de transition politique. Cette recherche ne suit pas thoriquement et mthodologiquement les tudes contenues dans la revue de la littrature. Plutt, elle sappuie sur un modle thorique inspir des recherches de McFalls sur la runification culturelle allemande aprs 1989. Ce modle, sans ngliger les approches institutionnelles et stratgiques, met laccent sur d'autres coles thoriques, interprtatives et constructivistes. Mes conclusions se basent sur les rsultats de sjours d'tude dans deux pays postcommunistes : la Bulgarie, membre de l'UE depuis 2007, et la Macdoine, pays-candidat. Jai recours des mthodes qualitatives et des techniques ethnographiques qui triangulent des rsultats puiss des sources multiples et varies pour exposer des trajectoires dynamiques de changement culturel influences par l'intgration europenne. Les conclusions montrent sous quelles conditions les idaux-types de changement politique conventionnels, soit institutionnel ou stratgique, reprsentent des modles utiles. Je prsente aussi leurs limitations. Ma conclusion principale est que l'intgration europenne reprsente un phnomne complexe dans le monde des significations. Cest un facteur qui est simultanment un amplificateur et un inhibiteur de la culture politique dmocratique. Les gens crent des sous-cultures diffrentes o des interprtations multiples du processus d'intgration europenne mnent des effets dissemblables sur la participation politique, la comptence et laction collective. La conversation discursive entre les gens qui composent de telles sous-cultures distinctes peut produire des effets divergents au niveau national. Cette recherche nest pas une analyse de lUE comme mécanisme institutionnel ; elle ne pose ainsi pas lUE comme une institution qui dtermine directement le processus de dmocratisation postcommuniste. Plutt, elle sintresse au processus dintgration europenne en tant quinteraction qui affecte la culture politique au sein des pays postcommunistes, et la manire dont cette dernire peut agir sur le processus de dmocratisation. Mon point dintrt central nest donc pas leuropanisation ou le processus de devenir comme lEurope , moins que leuropanisation ne devienne une composante de la culture politique avec des consquences sur le comportement politique des acteurs.
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Si lon considre que le rle des actionnaires varie dans un continuum qui stend de la passivit lune des extrmits jusquau contrle total de la socit dans laquelle ils ont investi, on peut affirmer que si, une certaine poque, les investisseurs institutionnels ont privilgi une certaine forme dapathie rationnelle, cette ralit a volu. Loins davoir atteint lautre extrmit du spectre, on doit nanmoins constater que dsormais, les dirigeants et les actionnaires dominants doivent faire face un nombre limit dactionnaires institutionnels qui se connaissent et dtiennent une part importante des titres dune socit. Malgr la prsence dobstacles lgaux et organisationnels qui entravent toujours aujourdhui lexercice des droits des actionnaires, il semble que les interventions des investisseurs institutionnels aient transcend la rgle de la majorit en ayant recours des moyens inusits pour diminuer les risques dopportunisme au sein des socits ouvertes. En effet, si lactivisme des investisseurs institutionnels est un phnomne complexe qui prend des formes multiples souvent opaques et qui est difficile cerner avec prcision, il est nanmoins possible daffirmer que ce mécanisme de gouvernance joue un rle des plus importants en contribuant limiter les cots dagence dcoulant de lextraction de bnfices privs par les dirigeants et les actionnaires dominants. En effet, au Canada, o la structure de proprit dune majorit de socits est concentre, lactivisme actionnarial permet de faire contrepoids au vaste pouvoir discrtionnaire des dirigeants ainsi qu linfluence quexercent les actionnaires dominants afin dassurer une certaine forme de protection aux droits des actionnaires minoritaires.
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HYAL-1 (hyaluronidase-1) appartient la famille des hyaluronidases connues pour leur rle dans la dgradation de lacide hyaluronique. Lexpression de HYAL-1 est leve dans de nombreux type de cancers, notamment dans le cancer de la prostate, de la vessie, des reins et du sein o il est impliqu dans la croissance tumorale et les mtastases. Rcemment notre laboratoire a aussi dmontr une expression leve de HYAL-1 dans le cancer pithlial de lovaire (CEO) de type mucineux et cellules claires, expression qui est inversement corrle celle du rcepteur de loestrogne alpha (RE). Cependant, malgr le fait que le rle de HYAL-1 dans le cancer soit bien tablit, le mécanisme de sa rgulation reste encore inconnu. Le RE est un facteur de transcription qui suite sa liaison avec son ligand va rguler lexpression de plusieurs gnes. Le RE ainsi stimul par lhormone va activer la transcription de ces gnes cibles mais il est connu maintenant quune grande partie des gnes rguls par le RE sont en ralit rprims par ce rcepteur. Dans ce travail nous proposons dtudier le mécanisme de la rgulation du gne HYAL-1 par le RE dans le CEO cellules claires et dans le cancer du sein. Lexpression ectopique du RE dans la ligne TOV21G (RE-) de mme que le traitement de la ligne MCF-7 (RE+) avec de loestrogne a induit une diminution du niveau dexpression de lARN m de HYAL-1. Ces rsultats nous ont permis de confirmer que HYAL-1 est un gne cible du RE. Il est aussi connu que le RE peut exercer son action par diffrents mécanismes daction, entre autres en interagissant avec une squence dADN appele lment de rponse loestrogne (ERE), retrouv sur le promoteur des gnes cibles ou bien indirectement par des interactions protine-protine en se liant dautres facteur de transcription tels que Sp1. Aprs avoir identifis de telles squences sur le promoteur proximal de HYAL-1, (1 ERE proximal -900 pb, 3 distaux -32350 pb, 48430, -50130 pb du site dinitiation de la transcription) en plus des 2 Sp1 connus (-60 et 1020pb), nous avons dmontrs par immunoprcipitation de la chromatine que le RE est recrut sur le promoteur de HYAL-1 au niveau de lERE proximal -900 pb et du distal -32350 pb de mme que sur le site Sp1 -1020 pb. De plus, lactivit biologique de lERE -900 pb et du ii Sp1-1020pb t confirme par des essais de gnes rapporteurs la lucifrase. Avec son rle connu dans la tumorigense, lidentification de HYAL-1 comme gne cible du RE pourrait tre une avenue intressante pour le traitement des cancers hormono-indpendants.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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Lobjectif gnral de cette thse est de dvelopper une plateforme dimmobilisation denzymes efficace pour application en biopile. Grce la microencapsulation ainsi quau choix judicieux des matriaux polymriques pour la fabrication de la plateforme dimmobilisation, lefficacit du transfert lectronique entre lenzyme encapsule et llectrode serait amlior. Du mme coup, les biopiles employant cette plateforme dimmobilisation denzymes pourrait voir leur puissance dlivre tre grandement augmente et atteindre les niveaux ncessaires lalimentation dimplants artificiels pouvant remplacer des organes telque le pancras, les reins, le sphincter urinaire et le coeur. Dans un premier temps, le p-phnylnediamine a t employ comme substrat pour la caractrisation de la laccase encapsule dans des microcapsules de poly(thylneimine). La diffusion de ce substrat travers les microcapsules a t tudie sous diverses conditions par lentremise de son oxidation lectrochimique et enzymatique afin den valuer sa rversibilit et sa stabilit. La voltampromtrie cyclique, llectrode disque tournante (rotating disk electrode - RDE) et llectrode O2 ont t les techniques employes pour cette tude. Par la suite, la famille des poly(aminocarbazoles) et leurs drivs a t identife pour remplacer le poly(thylneimine) dans la conception de microcapsules. Ces polymres possdent sur leurs units de rptition (mono- ou diamino) des amines primaires qui seraient disponibles lors de la polymrisation interfaciale avec un agent rticulant tel quun chlorure de diacide. De plus, le 1,8-diaminocarbazole (unit de rptition) possde, une fois polymris, les proprits lectrochimiques recherches pour un transfert dlectrons efficace entre lenzyme et llectrode. Il a toutefois t ncessaire de dvelopper une route de synthse afin dobtenir le 1,8-diaminocarbazole puisque le protocole de synthse disponible dans la littrature a t jug non viable pour tre utilis grande chelle. De plus, aucun protocole de synthse pour obtenir du poly(1,8-diaminocarbazole) directement na t trouv. Ainsi, deux isomres de structure (1,6 et 1,8-diaminocarbazole) ont pu tre synthtiss en deux tapes. La premire tape consistait en une substitution lectrophile du 3,6-dibromocarbazole en positions 1,8 et/ou 1,6 par des groupements nitro. Par la suite, une raction de dhalognation rductive t ralise en utilisant le Et3N et 10% Pd/C comme catalyseur dans le mthanol sous atmosphre dhydrogne. De plus, lors de la premire tape de synthse, le compos 3,6-dibromo-1-nitro-carbazole a t obtenu; un monomre cl pour la synthse du copolymre conducteur employ. Finalement, la fabrication de microcapsules conductrices a t ralise en incorporant le copolymre poly[(9H-octylcarbazol-3,6-diyl)-alt-co-(2-amino-9H-carbazol-3,6-diyl)] au PEI. Ce copolymre a pu tre synthtis en grande quantit pour en permettre son utilisation lors de la fabrication de microcapsules. Son comportement lectrochimique sapparentait celui du poly(1,8-diaminocarbazole). Ces microcapsules, avec laccase encapsule, sont suffisamment permables au PPD pour permettre une activit enzymatique dtectable par lectrode O2. Par la suite, la modification de la surface dune lectrode de platine a pu tre ralise en utilisant ces microcapsules pour lobtention dune biolectrode. Ainsi, la validit de cette plateforme dimmobilisation denzymes dveloppe, au cours de cette thse, a t dmontre par le biais de laugmentation de lefficacit du transfert lectronique entre lenzyme encapsule et llectrode.
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Dans la cellule, chaque ARNm se doit dtre rgul finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais galement au niveau de sa traduction, de sa dgradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre lexpression de chaque produit protique au moment et lendroit prcis o son action est requise. Lorsquun mécanisme physiologique est mis de lavant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent dtre rguls simultanment. Lun des moyens permettant dorchestrer un tel processus est de rguler laction dune protine commune associe chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi lexpression dun groupe prcis dARNm peut tre rgule finement dans le temps et dans lespace selon les facteurs protiques auxquels il est associ. Dans loptique dtudier certains de ces complexes ribonucloprotiques (mRNP), nous nous sommes intresss aux isoformes et paralogues de Staufen, une protine domaine de liaison lARN double-brin (dsRBD) implique dans de nombreux aspects de la rgulation post-transcriptionnelle, tels la dgradation, la traduction ou encore la localisation dARNm. Chez la drosophile, un seul gne Staufen est exprim alors que chez les mammifres, il existe deux paralogues de la protine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possdant divers isoformes produits suite lpissage alternatif de leur gne. Stau1 et Stau2 sont identiques 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffrent quen leur extrmit N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqu, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problmatique trs intressante laquelle nous nous sommes attaqu : ces diffrentes protines, quoique trs semblables, font-elles partie de complexes ribonucloprotiques distincts ayant des fonctions propres chacun ou, au contraire, vu cette similarit de squence, travaillent-elles de concert au sein des mmes complexes ribonucloprotiques? Afin dadresser cette question, nous avons entrepris disoler, partir de cellules HEK293T, les diffrents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique dimmunoprcipitation. Nous avons isol les ARNm associs chaque protine, les avons identifis grce aux micropuces dADN et avons confirm nos rsultats par RT-PCR. Malgr la prsence dune population commune dARNm associe Stau1 et Stau2, la majorit des transcrits identifis furent spcifiques chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqu que les diverses populations dARNm participaient aux mmes mécanismes de rgulation, ce qui suggre que ces deux protines possdent des rles complmentaires dans la mise en uvre de divers phnomnes cellulaires. Au contraire, les transcrits associs Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutt semblables. Ces rsultats sont trs intressants, car pour la premire fois, nous avons identifi des populations dARNm associes aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analyses en parallle afin den faire ressortir les populations spcifiques chacune de ces protines. Ensuite, connaissant limportance de Stau2 dans le transport dendritique dARNm, nous avons cherch caractriser les complexes ribonucloprotiques neuronaux associs celle-ci. Dans un premier temps et laide de la technique dimmunoprcipitation, nous avons identifi une population dARNm neuronaux associs Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une prsence dau moins huit fois suprieure dans le prcipit obtenu avec lanticorps anti-Stau2 par rapport celui obtenu avec le srum pr-immun. Ces ARNm codent pour des protines impliques dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de mtabolisme de lARN. De faon intressante, cette population dARNm isole du cerveau de rat est relativement diffrente de celle caractrise des cellules humaines HEK293T. Ceci suggre que la spcificit dassociation Stau2-ARNm peut diffrer dun tissu un autre. Dans un deuxime temps, nous avons isol les protines prsentes dans les complexes ribonucloprotiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifies par analyse en spectromtrie de masse. De cette faon, nous avons identifi au sein des particules de Stau2 des protines liant lARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protines du cytosquelette (- et -tubuline), de mme que la protine peu caractrise RUFY3. En poussant davantage la caractrisation, nous avons tabli que YB1 et PABPC1 taient associes Stau2 grce la prsence de lARN, alors que la protine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernire association semble tre modulable par laction de lATP. Ce rsultat offre de nombreuses possibilits quant la rgulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette tude suggre un mécanisme de rgulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite la caractrisation des mRNP de Stau, nous avons voulu dterminer au niveau neurophysiologique limportance de ceux-ci. Comme ltude de Stau2 avait dj t entreprise pralablement par un autre laboratoire, nous avons dcid de concentrer notre tude sur le rle de Stau1. Ainsi, nous avons dmontr que celle-ci tait ncessaire la mise en place dune forme de plasticit synaptique long terme, la forme tardive de potentialisation long terme ou L-LTP, dpendante de la transcription et de lactivit des rcepteurs NMDA. La transmission de base, de mme que la facult de ces pines faire de la E-LTP, la forme prcoce de potentialisation long terme, et la dpression long terme ou LTD sont conserves. Ceci indique que les pines conservent la capacit dtre modules. Ainsi, linhibition de la L-LTP, suite la sous-expression de Stau1, nest pas simplement due la perte dlments fonctionnels, mais rside plutt dans lincapacit de ceux-ci induire les changements synaptiques spcifiquement ncessaires la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 rduit la fois lamplitude et la frquence des mEPSC. Ces rsultats concordent avec lobservation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion dpines allonges et filopodales, des pines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait mme, elle diminue le nombre dpines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons t en mesure de dmontrer que labsence, au niveau neuronal, de la protine Stau1 induisait un dficit probable dans la localisation et/ou la traduction dARNm responsable de la restructuration de lpine et de facteurs ncessaires la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons particip lever le voile sur la composition et limportance des complexes ribonucloprotiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifi des populations distinctes et communes dARNm associes aux diffrents isoformes de Stau, partir des mRNP prsents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons russi mettre lavant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protique direct, hsc70, partenaire dont lassociation est modulable par laction de lATP, ainsi quune population neuronale de transcrits dARNm. Enfin, nous avons mis en lumire limportance de Stau1 dans la morphologie des pines dendritiques ainsi que dans le phnomne de la plasticit synaptique.
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Les autotransporteurs monomriques, appartenant au systme de scrtion de type V, correspondent une famille importante de facteurs de virulence bactriens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le dveloppement dune infection ou pour le maintien et la survie des bactries dans lorganisme hte, ont t dcrites pour cette famille de protines. Malgr limportance de ces protines, notre connaissance de leur biogense et de leur mécanisme daction demeure relativement limite. Lautotransporteur AIDA-I, retrouv chez diverses souches dEscherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqu dans ladhsion et linvasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et dagrgats bactriens. Les domaines extracellulaires dautotransporteurs monomriques sont responsables de la fonctionnalit et possdent pratiquement tous une structure caractristique dhlice . Nous avons men une tude de mutagense alatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalit de cette protine. Par cette approche, nous avons dmontr que les domaines passagers de certains autotransporteurs possdent une organisation modulaire, ce qui signifie quils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers dautotransporteurs peuvent tre clivs et relchs dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgr la diversit des mécanismes de clivage existants, plusieurs protines, telles quAIDA-I, sont clives par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro dAIDA-I, couple avec une approche de mutagense dirige, nous avons dmontr que cette protine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides amins possdant un groupement carboxyle. Ces rsultats ont permis la description dun nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomriques. Une des particularits dAIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransfrase spcifique nomme Aah. La glycosylation est un concept plutt rcent chez les bactries et pour linstant, trs peu de protines ont t dcrites comme glycosyles chez E. coli. Nous avons dmontr que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransfrases bactriennes retrouves chez diverses espces de protobactries. La glycosylation dAIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnat pas une squence primaire, mais plutt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactries et permettent dlargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation dAIDA-I et par consquent pour sa capacit de permettre ladhsion. Puisque plusieurs homologues dAah sont retrouvs proximit dautotransporteurs monomriques putatifs, cette famille de glycosyltranfrases pourrait tre importante, sinon essentielle, pour la biogense et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les rsultats prsents dans cette thse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure comprhension de la biogense dune des plus importantes familles de protines scrtes chez les bactries Gram ngatif.
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Lactivit rythmique des muscles masticateurs (ARMM) pendant le sommeil se retrouve chez environ 60% de la population gnrale adulte. L'tiologie de ce mouvement n'est pas encore compltement lucide. Il est cependant dmontr que laugmentation de la frquence des ARMM peut avoir des consquences ngatives sur le systme masticatoire. Dans ce cas, l'ARMM est considre en tant que manifestation d'un trouble moteur du sommeil connue sous le nom de bruxisme. Selon la Classification Internationale des Troubles du Sommeil, le bruxisme est dcrit comme le serrement et grincement des dents pendant le sommeil. La survenue des pisodes dARMM est associe une augmentation du tonus du systme nerveux sympathique, du rythme cardiaque, de la pression artrielle et elle est souvent en association avec une amplitude respiratoire accrue. Tous ces vnements peuvent tre dcrits dans le contexte dun micro-veil du sommeil. Cette thse comprend quatre articles de recherche visant tudier i) l'tiologie de lARMM pendant le sommeil en relation aux micro-veils, et valuer ii) les aspects cliniques du bruxisme du sommeil, du point de vue diagnostique et thrapeutique. Pour approfondir l'tiologie de lARMM et son association avec la fluctuation des micro-veils, nous avons analys le patron cyclique alternant (ou cyclic alternating pattern (CAP) en anglais), qui est une mthode danalyse qui permet dvaluer l'instabilit du sommeil et de dcrire la puissance des micro-veils. Le CAP a t tudi chez des sujets bruxeurs et des sujets contrles qui ont particip deux protocoles exprimentaux, dans lesquels la structure et la stabilit du sommeil ont t modifies par l'administration d'un mdicament (la clonidine), ou avec l'application de stimulations sensorielles (de type vibratoire/auditif) pendant le sommeil. Dans ces deux conditions exprimentales caractrises par une instabilit accrue du sommeil, nous tions en mesure de dmontrer que les micro-veils ne sont pas la cause ou le dclencheur de lARMM, mais ils reprsentent plutt la fentre permissive qui facilite l'apparition de ces mouvements rythmiques au cours du sommeil. Pour valuer la pertinence clinique du bruxisme, la prvalence et les facteurs de risque, nous avons effectu une tude pidmiologique dans une population pdiatrique (7-17 ans) qui tait vue en consultation en orthodontie. Nous avons constat que le bruxisme est un trouble du sommeil trs frquent chez les enfants (avec une prvalence de 15%), et il est un facteur de risque pour l'usure des dents (risque relatif rapproch, RRR 8,8), la fatigue des muscles masticateurs (RRR 10,5), les maux de tte frquents (RRR 4,3), la respiration bruyante pendant le sommeil (RRR 3,1), et divers symptmes lis au sommeil, tels que la somnolence diurne (RRR 7,4). Ces rsultats nous ont amens dvelopper une tude exprimentale pour valuer l'efficacit d'un appareil d'avancement mandibulaire (AAM) chez un groupe d'adolescents qui prsentaient la fois du bruxisme, du ronflement et des maux de tte frquents. L'hypothse est que dans la pathogense de ces comorbidits, il y a un mécanisme commun, probablement li la respiration pendant le sommeil, et que l'utilisation d'un AAM peut donc agir sur plusieurs aspects lis. court terme, le traitement avec un AAM semble diminuer l'ARMM (jusqu' 60% de diminution), et amliorer le ronflement et les maux de tte chez les adolescents. Cependant, le mécanisme d'action exact des AAM demeure incertain; leur efficacit peut tre lie l'amlioration de la respiration pendant le sommeil, mais aussi l'influence que ces appareils pourraient avoir sur le systme masticatoire. Les interactions entre le bruxisme du sommeil, la respiration et les maux de tte, ainsi que l'efficacit et la scurit long terme des AAM chez les adolescents, ncessitent des tudes plus approfondies.
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La blomycine est un antibiotique cytotoxique, son potentiel gnotoxique est plus important quand elle est utilise en combinaison avec des agents antinoplasiques sur le cancer testiculaire, que sur les autres types qui dveloppent souvent une rsistance envers la drogue. Notre but consiste alors de mettre en vidence ce mécanisme de rsistance en utilisant lorganisme modle Saccharomyces cerevisiae. Nous avons dmontr au sein de notre laboratoire, que les levures dltes au niveau de leur coactivateur transcriptionnel Imp2, prsentent une hypersensibilit la blomycine, en raison de son accumulation toxique dans la cellule. Ceci suggre que Imp2 pourrait rguler lexpression dune ou de plusieurs pompes efflux, capables dexpulser la blomycine lextrieur de la cellule. Pour tester notre hypothse, nous avons recherch des suppresseurs multicopies capables de restaurer la rsistance la blomycine chez le mutant imp2, et cest ainsi que nous avons identifi l'activateur transcriptionnel Yap1. Ce dernier se lie une rgion spcifique localise au niveau du promoteur et permet dactiver l'expression d'un sous-ensemble de gnes, codant pour des pompes efflux, impliques dans la rsistance aux drogues. Selon la littrature, au moins 27 pompes efflux ont t identifies chez la levure Saccharomyces cerevisiae, certaines dentre elles disposent du site de liaison pour Yap1, tels que Qdr3, Tpo2 et Tpo1. Afin de dterminer si une de ces pompes expulse la blomycine, nous avons cr des mutations simples et doubles en combinaison avec IMP2, aussi nous avons verifi si les mutants taient sensibles la drogue et enfin, nous avons test si la surexpression de Yap1 pouvait restaurer le phnotype sauvage chez ces mutants, via lactivation de pompes efflux.
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La sclrose latrale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus frquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants lchelle mondiale. La maladie se caractrise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite la dgnrescence des neurones du cortex moteur, tronc crbral et moelle pinire. Les personnes atteintes dveloppent les premiers symptmes lge adulte et la maladie progresse sur une priode de trois cinq ans. Il a t rpertori quenviron 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affects le sont donc de faon sporadique. La dcouverte il y a 19 ans de mutations dans le gne zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), prsentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affects, a t lvnement dclencheur pour la dcouverte de variations gntiques responsables de la maladie. La recherche sur la gntique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernires annes avec lidentification de mutations dans de nouveaux gnes. Toutefois, mme si certains de ces gnes ont t dmontrs comme rellement lis la maladie, la contribution dautres gnes demeure incertaine puisque les rsultats publis de ceux-ci nont pas, ce jour, t rpliqus. Une portion substantielle de cas reste cependant tre gntiquement explique, et aucun traitement ce jour na t dmontr comme tant efficace pour remdier, attnuer ou prvenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat tait didentifier de nouveaux gnes muts dans la SLA, tout en valuant la contribution de gnes nouvellement identifis chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les rsultats prsents sont organiss en trois sections diffrentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations prsentes dans le gne FUS est value chez les patients familiaux, sporadiques et juvniles de SLA. Prcisment, de nouvelles mutations sont rapportes et la proportion de mutations retrouves chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est value. De plus, une nouvelle mutation est rapporte dans un cas juvnile de SLA; cette tude de cas est discute. Dans un deuxime temps, de nouvelles avenues gntiques sont explores concernant le gne SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapporte chez une famille franaise de SLA. De plus, la possibilit quune mutation prsente dans un autre gne impliqu dans la SLA ait un impact sur lpissage du gne SOD1 est value. Finalement, la dernire section explique la contribution de nouveaux gnes candidats chez les patients atteints de SLA. Spcifiquement, le rle des gnes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phnotype de SLA est valu. Il est souhait que nos rsultats combins avec les rcents dveloppements en gntique et biologie molculaire permettent une meilleure comprhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le dploiement de thrapies suite lidentification des cibles appropries.
